CC BY
58
reviews
ОБЗОРЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 578.832.1:578.1
Васин А.В.12, Петрова-Бродская А.В.12, Плотникова М.А.1, Цветков В.Б.134, Клотченко С.А.1
эволюционная динамика структурных и функциональных
доменов белка ns1 вирусов гриппа а человека
1 ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург;
2 ФГАО УВО «Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого», 195251, г. Санкт-Петербург;
3 ФГБУН «Институт нефтехимического синтеза им. А.В. Топчиева» РАН, 119991, г. Москва;
4 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины» ФМБА, 119435, г. Москва
Белок NS1 вируса гриппа А (ВГА) является одним из ключевых вирусных факторов, отвечающих за взаимодействие с клеткой-хозяином. NS1 противостоит системе клеточной противовирусной защиты, участвует в процессинге и экспорте клеточных мРнК, регулирует активность вирусной РнК-полимеразы и экспрессию вирусных генов, оказывает влияние на сигнальные системы клетки. Многочисленные функции NS1 осуществляются за счёт устоявшихся взаимодействий с клеточными факторами, число которых, по разным данным, превышает сотню. Примечательно, что только два сегмента генома ВГА человека — NS1 и NP — не подвергались реассортации и эволюционировали в процессе генетического дрейфа начиная с пандемии 1918 г. по настоящее время. Этот факт может свидетельствовать о важности NS1 и его многочисленных взаимодействий с клеточными факторами в межвидовой адаптации вируса. В обзоре представлены данные об эволюции белка NS1 ВГА человека и проведён анализ аминокислотных замен, произошедших в основных структурных и функциональных доменах белка NS1 в процессе эволюции.
Ключевые слова: вирус гриппа А; неструктурный белок NS1; структурные и функциональные домены; взаимодействие вирус—хозяин; эволюционная динамика. Для цитирования: Васин А.В., Петрова-Бродская А.В., Плотникова М.А., Цветков В.Б., Клотченко С.А. Эволюционная динамика структурных и функциональных доменов белка NS1 вирусов гриппа А человека. Вопросы вирусологии. 2017; 62(6): 246-258. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-246-258
Vasin A.V.12, Petrova-Brodskaya A.V.12, Plotnikova М.А.1, Tsvetkov V.B.134, KlotchenkoS.A.1 EVOLUTIONARY DYNAMICS OF STRUCTURAL AND FUNCTIONAL DOMAINS OF INFLUENZA A
VIRUS NS1 PROTEIN
1 Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation;
2 Peter the Great St. Petersburg Polytechnic University, St. Petersburg, 195251, Russian Federation;
3 A.V. Topchiev Institute of Petrochemical Synthesis, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991, Russian Federation;
4 Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Moscow, 119435, Russian Federation
Influenza A virus (IAV) NS1 protein is one of the key viral factors responsible for virus-host interactions. NS1 counteracts host antiviral defense, participates in the processing and export of cellular mRNAs, regulates the activity of viral RNA polymerase and the expression of viral genes, and influences the cellular signaling systems. Multiple NS1 functions are carried out due to the interactions with cellular factors, the number of which exceeds one hundred. It is noteworthy that only two segments of IAV genome - NS and NP - did not undergo reassortment and evolved in the course of genetic drift, beginning with the pandemic of 1918 to the present. This fact may indicate the importance of NS1 and its numerous interactions with cellular factors in the interspecific adaptation of the virus. The review presents data on the evolution of the human IAV NS1 protein and analysis of the amino acid substitutions in the main structural and functional domains of NS1 protein during evolution.
K e y w o r d s: A virus; nonstructural protein NS1; .structural and functional domains; virus-host interactions; evolutionary dynamics.
For citation: Vasin А.У, Petrova-Brodskaya АУ, Plotnikova М.А., Tsvetkov V.B., Klotchenko SA. Evolutionary dynamics of structural and functional domains of influenza A virus NS1 protein. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2017; 62(6): 246-258. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-246-258 For correspondence: Andrey V. Vasin, Head of the Department of molecular biology of viruses, Director of the Research Institute of Influenza, St. Petersburg, 197376, Russian Federation. E-mail: influenza.spb@gmail.com Information about authors:
Vasin АУ, http://orcid.org/0000-0002-1391-7139; Petrova-Brodskaya АУ, http://orcid.org/0000-0001-5130-3755;
Plotnikova МА., https://orcid.org/0000-0001-8196-3156; Tsvetkov V.B., http://orcid.org/0000-0003-0494-3332; Klotchenko S.A., http://orcid.org/0000-0003-0289-6560
Acknowledgment. This work was supported by the Russian Science Foundation (Grant No. 15-15-00170) and the Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 16-34-01110).
Для корреспонденции: Васин Андрей Владимирович, заведующий отделом молекулярной биологии вирусов ФГБУ«НИИ гриппа» Минздрава России, 197376, г. Санкт-Петербург. E-mail: influenza.spb@gmail.com
вопросы вирусологии. 2017; 62(6)
_DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2017-62-6-246-258
обзоры
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 18 August 2017 Accepted 25 August 2017
Введение
Считается, что природным резервуаром вирусов гриппа А (ВГА) являются водоплавающие птицы, у которых встречаются вирусы, содержащие гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA) большинства известных подтипов [1]. Несмотря на значительный прогресс в области молекулярной вирусологии, эпидемиологии и эволюции ВГА, фундаментальный вопрос о механизмах передачи вируса от птиц (или других хозяев) к человеку и их адаптации для циркуляции в популяции человека до сих пор остаётся без ответа. Наибольшее внимание с этой точки зрения уделяется поверхностному белку HA, определяющему вирусный подтип и отвечающему за связывание и вхождение вируса в клетку, а также субъединицам PB1, PB2 и PA полимеразного комплекса [2]. Вместе с тем в процессе адаптации к новому хозяину важную роль играют другие вирусные белки, в частности неструктурный белок NS1 [3]. Основная функция NS1 заключается в противостоянии интерферон-опосредованным механизмам противовирусной защиты и взаимодействии со множеством клеточных факторов [4, 5]. В литературе имеются данные об аминокислотных заменах в NS1, которые усиливают патогенность штаммов ВГА разной видовой специфичности
[6]. Например, усиление вирулентности вируса H1N1 человека, содержащего ген NS высокопатогенных ВГА птиц H5N1, связано с заменой E92D, обеспечивающей усиление устойчивости клеток к вирусу, индуцированной интерфероном
[7]. Между тем значимость выявленных замен, связанных с увеличением вирулентности, для смены видовой специфичности вируса и адаптации к новому хозяину остается малопонятной [5, 6]. Несомненным является то, что при изучении роли NS1 как в патогенезе инфекции, так и в процессе межвидовой адаптации необходимо четко понимать молекулярно-генетические детерминанты патогенности и эволюционное происхождение NS1. В обзоре обобщены современные данные об эволюции белка NS1 ВГА человека, описаны его основные структурные и функциональные сайты и проведён анализ произошедших в них в процессе эволюции аминокислотных замен.
Филогенетический анализ гена NS ВГА человека.
На протяжении последнего столетия в популяции человека преимущественно циркулировали ВГА подтипов H1N1, H2N2 и H3N2 [8, 9]. При этом появление вирусов каждого нового подтипа сопровождалось пандемиями в 1918, 1957, 1968, 1977 (псевдопандемия) и 2009 гг. [10]. Считается, что с 1510 г. произошло не менее 14 пандемий, вызванных ВГА [9]. При этом полные генетические последовательности известны только для ВГА, циркулировавших не ранее 1918 г., поэтому понимание вирусологической природы пандемий гриппа, происходящих до этого времени, сильно ограничено.
Общим предком для современных ВГА человека является вирус ШШ?аЫ918, вызвавший пандемию «испанского гриппа», которая унесла жизни не менее 50 млн человек [8]. На рис. 1 представлена схема филогенетического дерева гена NS (области гена NS, соответствующей открытой рамке считывания белка NS1) ВГА человека и свиньи, отражающая современную модель его эволюции [11, 12]. Включение в анализ ВГА свиного происхождения связано с тем, что они филогенетически близки вирусам человека и вносят существенный вклад в появление новых вирусных подтипов в процессе реас-сортации генетических сегментов [13, 14].
Среди генов NS ВГА человека и свиньи выделяют две эволюционные линии. Первая, обозначенная как NS ,
ауогу
содержит вирусы, произошедшие от ВГА птиц. Вторая
линия, обозначенная как NS
pdm1918'
соответствует ВГА
Рис. 1. Схема эволюции гена N8 ВГА человека и свиньи с 1918 г по настоящее время. N8 . — N81 пула ВГА птиц; Ш1918 — N81 ВГА ИШ1 . 1918; --- —N81 ВГГНШ1 человека; ^ ™
N2 — N81 ВГА И3№ человека; N8
NS NS.
— "NS1 ВГА H2N2 челоВеКа
. d09 — NS1 ВГА H1N1 . 09 чело-
pdm09 ^ pdm09 ч
реассортантного ВГА свиней; NS — NS1 ВГА евразийской линии сви-
г г 5 eursw ±
ней; NS — NS1 ВГА человека и свиньи подтипов H5, H7, H9 птичьего про-
исхождения. Линии NSH1N1, NSH2N2 и NSH
c17NS
линии NS — к клейду
NSpdm1918, происходящий от гена ВГА человека
NStri и NSpdm09 — к клейду ' i. Клейды NS и NS
ir ^^ hum nri sw
относятся к клейду NSh ri, j ., линии NSeursw и NS"
sworp av
объединены в общий клейд
,. Чёрным цветом отмечены линии N81 серым — линии N81 ВГА свиньи, линия N81 ВГА птиц отмечена пунктиром.
reviews
человека и свиньи, ведущим свое эволюционное происхождение от гена NS1918 вируса H1N1 . Этот вирус, с одной стороны, происходит из пула ВГА птиц (NSaviaB), с другой стороны, является предшественником подавляющего большинства современных ВГА человека [2, 8].
Внутри линии NSpd наблюдается достоверное разделение на два клейдаТЖ, . и NS , которые соответ-
hum _ori sw _ori i
ствуют сезонным ВГА человека подтипов H1N1, H2N2 hH3N2 (линии NSfflM, NS^n и NSfflN2 соответственно) и ВГА свиней классической линии, тройным реассортант-ным вирусам свиньи и пандемическим вирусам H1N1-, .„„„ человека (линии NS , , NS и NS , „„ соответствен-
pdm!009 4 clasw7 tri pdm09
но). Внутри линии NSav or. можно выделить ВГА свиней евразийской линии (NS^T*) и ВГА человека и свиней, происходящие от вирусов птиц подтипов H5, H7, H9 (NSav).
Эволюционная динамика гена NS ВГА человека.
Чтобы проследить эволюционную динамику гена NS ВГА человека, необходимо сопоставить данные его филогенетического анализа и эволюции самих вирусов [2]. Как было сказано ранее, вирусы H1N1pdm19^ являются предшественниками всех современных линий ВГА, циркулирующих в популяции человека, а также ВГА свиней за исключением вирусов евразийской линии. Начиная с 1918 г. ген NS эволюционировал в вирусах H1N1 человека с примерно постоянной скоростью вплоть до пандемии «азиатского гриппа» 1957 г., вызванной появлением реассортантного вируса, в геноме которого появились 3 новых произошедших от ВГА птиц сегмента: HA (подтипа H2), NA (подтипа N2) и PB1 [2]. Остальные 5 геномных сегментов (в том числе NS) вирусов H2N2 сохранились от сезонного вируса H1N1. ВГА H2N2 в 1968 г. были вытеснены из циркуляции новым пандемическим вирусом H3N2, вызвавшим пандемию «гонконгского гриппа». Этот вирус появился в результате реассортации геномных сегментов ВГА человека H2N2 и ВГА птиц, приведшей к возникновению новых сегментов HA (подтипа H3) и PB1 [2]. Вирус быстро стал эндемическим и циркулирует как сезонный в популяции человека по настоящее время. Сегменты NS вирусов H3N2 первых лет циркуляции и вирусов H2N2 последних лет циркуляции были филогенетически близки. Это свидетельствует о том, что ген NS, не претерпев существенных изменений, продолжил эволюционировать в вирусах H3N2 человека [11, 12].
ВГА человека H1N1 вновь появился в популяции человека в 1977 г., вызвав техническую пандемию, или псевдопандемию. Молекулярно-генетический анализ подтвердил, что штаммы ВГА H1N1 1977 г. были практически идентичны штаммам 1957 г. по последовательностям всех восьми геномных сегментов [15]. Так как вирус не мог в течение 20 лет циркулировать в другом хозяине без накопления мутаций, считается, что он находился в «замороженном» состоянии, после чего произошла его реактивация. Линия, соответствующая гену NS вирусов H1N1, продолживших циркулировать наряду с вирусами H3N2, образует отдельную от них эволюционную ветвь.
В 2009 г. произошла пандемия, вызванная появлением нового ВГА подтипа H1N1pam2009. В целом пандемия, вызванная вирусом H1N1p носила умеренный, близкий к слабому характер [16]. Данный вирус является сложным реассортантом двух неродственных вирусов H1N1 свиней классической, произошедшей от вируса H1N1pdm1918, и евразийской, произошедшей от ВГА птиц, линий [2, 17]. Удалённость этих линий подтверждается и
данными филогенетического анализа гена NS, согласно которому кластеризуются две линии NS ог. и NSpdm191-[11, 12]. Сегменты NA и М вирусов 2009 челове-
ка происходят от ВГА свиней H1N1 евразийской линии, в то время как остальные 6 сегментов — от тройного реассортантного вируса свиней H1N2, появившегося в конце 90-х годов прошлого века [10, 1-]. В этом вирусе гены HA, NP и NS происходят от вирусов классической линии свиней, гены PB2 и PA — из пула ВГА птиц, а PB1 — от сезонных вирусов человека H3N2. Таким образом, ген NS вирусов H1N1 dm2009, как и ген NS ВГА человека подтипов H1N1, H2N2 ' и H3N2, происходит от общего предкового гена NS пандемического вируса 191- г. Однако этот сегмент эволюционировал в пуле ВГА свиней.
Согласно данным филогенетического анализа ВГА свиней, содержащие ген NS линии NS^ , можно разделить на 3 группы. Первая группа включает ВГА свиней классической линии, содержащие гены NS клейда NSc/ , произошедшие от NS191-. Вторая группа образована тройными реассортантными ВГА свиней, возникшими в результате реассортации ВГА свиней классической линии с ВГА H3N2 человека и ВГА птиц. Ген NS этих вирусов произошёл от гена NS ВГА свиней классической линии и дал начало генам NS вирусов гриппа H1N1pdm2009. При этом клейд генов NS этих пандемических вирусов содержит последовательности гена NS вирусов свиней тех же годов выделения, что свидетельствует об их эволюционной близости. Примечательно, что линия генов NS dm09 содержит небольшую группу генов NS ВГА свиней подтипа H1N1 2003 г. выделения [12].
Известно также, что существуют спорадические случаи межвидовой передачи ВГА, однако такие вирусы не закрепляются в популяции человека. Например, в 1976 г. в США зарегистрированы случаи инфицирования людей вирусами свиней H1N1 [19]. Наиболее известными являются случаи межвидовой передачи ВГА птиц человеку, таких как высокопатогенные ВГА птиц H5N1 [20] или умеренно патогенные ВГА птиц H7N9 [20]. В этом случае ген NS имел птичье происхождение. Однако такие случаи межвидовой передачи носили локальный характер, и вирусы не смогли зафиксироваться в популяции человека. Следует отметить, что межвидовая прямая передача вируса может происходить не только от птиц к млекопитающим, но и между различными видами млекопитающих, в частности между человеком, свиньями и лошадьми [13].
Таким образом, общая схема, иллюстрирующая эволюционную динамику гена NS ВГА человека, показывает, что сегмент NS начиная с 191- г. не подвергался реас-сортации и оставался неизменным у всех подтипов ВГА, циркулировавших в популяции человека (см. рис. 1). Мутации в гене NS накапливались постепенно в процессе генетического дрейфа. Среди всех геномных сегментов ВГА помимо NS неизменным в процессе эволюции ВГА человека оставался только сегмент NP [2].
Синтез и локализация NS1.
Белок NS1 кодируется --м сегментом генома ВГА. В процессе транскрипции по механизму альтернативного сплайсинга образуется не менее двух мРНК, кодирующих белки NS1 и NS2 [21]. Обе мРНК имеют 56 общих нуклеотидов на 5'-конце, в результате чего NS1 и NS2 содержат 10 общих N-концевых аминокислот [22]. Имеющиеся данные литературы относительно накопления мРНК NS1 и белка ядерного экспорта (NEP) свидетельствуют о низком уровне сплайсинга мРНК NEP, в ре-
обзоры
зультате чего она составляет около 10% от мРНК NS1 [23, 24]. Экспрессия NS1 в инфицированных клетках поддерживается на высоком уровне: уже через 2 ч после заражения наблюдается характерное увеличение транскриптов NS1 [23].
NS2, также известный как NEP, является структурным компонентом вириона, отвечающим за экспорт вирусных рибо-нуклеопротеинов из ядра в цитоплазму [25]. NS1 считался неструктурным компонентом вириона ВГА [26], однако, по последним данным, он также входит в состав вирусных частиц [27].
Внутриклеточная локализация NS1 может различаться в зависимости от штамма вируса, типа клеточной линии, времени после инфицирования, а также уровня экспрессии самого белка NS1. В инфицированных клетках NS1 преимущественно локализуется в ядре, однако на поздних стадиях инфекции значительное количество белка обнаруживается в цитоплазме [5]. В зависимости от штамма вируса NS1 имеет 1 или 2 сигнала ядерной локализации (NLS1 и NLS2). При взаимодействии с клеточным белком импортином-а NLS отвечают за активный транспорт NS1 в ядро. Сигнальная последовательность NLS1 высококонсервативна и включает R35, R38 и K413, также участвующие в связывании днРНК [28]. Напротив, С-концевая сигнальная последовательность NLS2 содержит K219, R220, R231 и R232, присутствующие не у всех белков NS1 [28]. Существует также конкурирующая с NLS2 последовательность сигнала ядрышковой локализации (NoLS), которая содержит дополнительные основные остатки R224 и R229 [29].
Цитоплазматическая локализация NS1 регулируется тремя механизмами. Во-первых, это секвестрирование новосинтезированного белка в цитоплазму при помощи клеточных или вирусных факторов, которые маскируют NLS [29]. Во-вторых, в цитоплазматическом транспорте участвует сигнал ядерного экспорта (NES), расположенный между 138-м и 147-м аминокислотным остатком (а. о.) и требующий наличия L144 и L146, которые обычно маскируются близлежащими остатками в положениях 148—161 [30]. Таким образом, возможно, что в течение инфекции для активации цитоплазматической локализации требуется «открытие» данных аминокислот. В-третьих, возможна конкуренция между NLS и NES, так как последовательность NES становится определяющей после того, как последовательности NLS перекрываются клеточным NS1-связывающим белком (NS1-BP). Молекулярные события, управляющие этими тремя возможными механизмами, до сих пор не установлены, но есть основания полагать, что специфические клеточные факторы играют ключевую роль в определении внутриклеточной локализации белка [31]. Например, возможна регуляция белка NS1 в процессе фосфорилирования, так как мутация в потенциальном сайте фосфорилирования S195 приводит к задержке NS1 в ядре [32].
В целом различное внутриклеточное распределение NS1 в течение всей инфекции необходимо для реализации его различных функций [5].
Структура NS1.
Белок NS1 имеет относительно малые размеры, и у
С-концевой эффекторный домен (ED)
Рис. 2. Кристаллическая структура димера белка NS1 ВГА (PDB 4OPH). Мономер справа отмечен более светлым оттенком (РНК-связывающий домен), оттенком темнее (линкерная область), темно-серым цветом (С-концевой ED-домен). Аналогичные домены мономера слева симметричны и также выделены различными оттенками серого. Пунктирной линией обозначен С-концевой хвост. а1—а5 и а'1—а'5 — а-спирали (имеют координаты 2—25, 29—50, 54—70, 94—100, 170—188, 195— 202 а. о. соответственно). Р1—Р7 и Р'1—Р'7 — Р-нити (имеют координаты 88—91, 107—112, 115—120, 127—137, 140—151, 156—162, 191—194 а. о. соответственно). Pro и Pro' — богатая пролином петля (координаты 162—170 а. о.). В прямоугольниках показаны клеточные и вирусные факторы, с которыми взаимодействует NS1.
большинства ВГА его длина составляет не более 237 а.о. В структуре N81 выделяют 2 функционально различимых домена: ^концевой РНК-связывающий (RBD) и С-концевой эффекторный (ED) домены, которые соединены между собой гибкой линкерной областью (рис. 2). Кроме того, в молекуле N81 имеется короткий С-концевой хвост. N81 преимущественно функционирует в виде димеров, которые образуются за счет формирования ионных связей [33]. N81 также способен к олигомеризации в присутствии молекул днРНК [33, 34]. ^концевой RBD длиной 73 а. о., образованный тремя а-спиральными участками, содержит NLS1 и сайт распознавания днРНК [34]. Антипараллельные а-спирали а2 и а2' в димере N81 связываются с большой бороздкой днРНК посредством нескольких основных аминокислот, в частности R38 и К41 [34]. Следует отметить, что такая структура, состоящая из двух антипараллельных основных а-спиралей, характерна для многих РНК-связывающих белков, действующих в форме димера.
С-концевой ED длиной около 164 а. о. осуществляет взаимодействие с ядерными белками клетки-хозяина и отвечает за ядерно-цитоплазматический транспорт зрелых мРНК в инфицированных клетках. ED состоит из трех а-спиралей и семи Р-нитей [32]. Последние формируют большой антипараллельный Р-слой, окружающий одну сторону длинной а-спирали а5. Пространственная структура ED содержит высококонсервативный набор заряженных экспонированных на поверхность аминокислот.
Длина С-конца N81 широко варьирует у различных штаммов [5]. На С-конце N81 имеются 2 8Н-связывающих домена типов 8Н2 и 8Н3 [35]. Оба домена специфически взаимодействуют с регуляторной субъединицей р85Р фосфатидилинозитол-3-киназы (Р13К) [36]. Активация опосредованного ею сигнального пути играет ключевую роль в обеспечении вирусной репликации [37]. Особенно важной является антиапоптотическая функция активации Р13К, так как действие противовирусных интерферонов
reviews
(ИФН) направлено на индукцию программы апоптоза инфицированных клеток [38]. Большинство белков NS1 на С-конце имеют состоящий из четырех аминокислот PDZ-связывающий мотив [39]. PDZ-связывающие мотивы играют ключевую роль в активации сигнальных путей, обеспечивающих противостояние действию ИФН и приводящих к активации клеточных генов, поддерживающих репродукцию вируса [40, 41].
Показано, что молекулы NS1 обладают конформаци-онным полиморфизмом, который заключается в различной ориентации ED относительно RBD, приводящей к трем возможным конформациям белка: открытой, полуоткрытой и закрытой [33]. Ключевую роль в образовании таких структур играет длина линкерной области и аминокислота в положении 71 [33]. Такая конформационная подвижность зависит от стадии инфекции, внутриклеточной локализации и посттрансляционных модификаций NS1 и может вносить вклад в мультифункциональ-ность этого белка.
Функциональные домены NS1 и роль NS1 в жизненном цикле ВГА.
NS1 является одним из наиболее многофункциональных белков ВГА. Посредством взаимодействия со множеством клеточных факторов NS1 участвует в регуляции сплайсинга, экспорте и трансляции вирусных мРНК, антагонизме с системами клеточного противовирусного ответа [5]. Наибольший прогресс в понимании роли белка NS1 был достигнут с появлением методов системной биологии [42].
Одна из первых фундаментальных работ по комплексной оценке роли гена NS1 в жизненном цикле ВГА была опубликована в 2002 г. [43]. Авторы с помощью кДНК микрочипа определили профили экспрессии генов эпителиальных клеток легкого A549, инфицированных вирусами A/PR/8/34, содержащими полноразмерный и укороченные гены NS (wtNS- и ANS-вирусы, соответственно). Использование дефектного по открытой рамке считывания NS1 вируса позволило оценить вклад этого гена в клеточный ответ на уровне мРНК. Было показано, что инфекция вирусом wtNS приводила к значительной индукции генов, вовлеченных в ИФН-путь. Делеция открытой рамки считывания NS1 в гене NS приводила к уве -личению числа и степени экспрессии клеточных генов, вовлечённых в ИФН, NFxB и другие противовирусные пути. При этом разные индуцируемые ИФН-гены проявляли разную чувствительность к NSI-опосредованному ингибированию их экспрессии. Рекомбинантный вирус, содержащий С-концевую делецию в гене NS, индуцировал паттерн экспрессии клеточных мРНК, промежуточный между вирусом дикого типа и вирусом, полностью нокаутным по NS1. В дальнейшем было показано, что на клеточный ответ на ВГА-инфекцию значительное влияние оказывает последовательность гена NS [44].
В процессе подготовки к написанию обзора мы повторили вышеприведенный эксперимент на клетках A549, инфицированных wtNS- и ANS-вирусами [45], с использованием современных микрочипов SurePrint G3 Human Gene Expression 8*60K v2 («Agilent», США), позволяющих проводить анализ экспрессии более 32 000 аннотированных генов, псевдогенов и некодирующих РНК. При обработке результатов анализа оставили только гены, экспрессия которых изменилась более чем в 2 раза (log 2 FC больше +1 или меньше -1). Экспрессия 129 генов возрастала только в случае заражения вирусом ANS, 66 генов оказались специфичными для вируса
Рис. 3. Дифференциальная экспрессия генов клеток A549, инфицированных wtNS- и ДЫБ-вирусами. Показаны гены, число транскриптов для которых увеличилось (значения log 2 FC больше +2) по сравнению с контрольными клетками.
wtNS, при этом экспрессия 193 генов увеличивалась в случае обоих вирусов (рис. 3).
Анализ генной онтологии (GO) генов, уровень мРНК которых увеличился в ответ на вирусное заражение, проведённый в программе PANTHER Reactome [46, 47], показал, что большая их часть ожидаемо принадлежала путям, задействованным в активации врождённого противовирусного ответа.
В случае заражения ANS-вирусом активировалась экспрессия 129 генов. Среди них следует отметить гены ИФН-в1 и ИФН-а, ИФН-М, ИФН-12, ИФН-13 (ИЛ-29, ИЛ-28А и ИЛ-28В соответственно), играющие ключевую роль в противовирусной защите в эпителиальных тканях [48]; иммунорегуляторных и воспалительных хемокинов и их рецепторов CXCL2, CXCL3; митоген-активируемой киназы MAP3K8, активирующей NFxB, ФНО-а, ИЛ-2, ИЛ-8; ингибитора NFxBa; регуляторной субъединицы 15 протеинфосфатазы 1 (PPP1R15A); участвующего в противовоспалительном ответе фактора ZFP36.
В случае wtNS-вируса большая часть генов не классифицировалась согласно GO-анализу. Можно было только выделить гены, участвующие в регуляции HSF1-опосредованного ответа на тепловой шок: HSPA5, HSPA1B и HSPA1A (семейство А белков теплового шока Hsp70), DNAJB1 (белок теплового шока семейства Hsp40) и BAG3 (ингибитор шапероновой активности Hsc70/Hsp70). В литературе была показана возможность взаимодействия вышеприведенных белков теплового шока с NS1 [49, 50]. Кроме того, в случае wtNS-вируса обнаружили увеличение уровня транскриптов некодиру-ющих РНК SNAR: G1, H, F, B2, G2, D и A3. Эти РНК ассоциированы с ядерным белком ILF3/NF90, в частности активирующим экспрессию ИЛ-2 в T-клетках. Недавно было показано, что NF90 является противовирусным фактором, регулирующим активацию PKR и образование стресс-гранул в ВГА-инфицированных клетках [51].
обзоры
Рис. 4. Взаимодействие N81 с клеточными и вирусными белками. Представлены белки, взаимодействующие с N81, по данным литературы [5, 54, 96—101] и базы ^1теМепШа [59].
Вместе с тем точный механизм такого ингибирования еще не определён.
Число генов, экспрессия которых снизилась, невелико для обоих вирусов. В случае wtNS-вируса следует отметить снижение уровня мРНК генов MAVS. Белки МАУ8 действуют в ответ на активацию RIG-I и MDA5, координируя пути, приводящие к экспрессии факторов транскрипции NFNB, IRF3 и IRF7 и последующей индукции противовирусных цитокинов ИФН-Р и RANTES [52].
Помимо метода анализа экспрессии генов много данных было получено с использованием методов анализа белок-белковых взаимодействий, таких как дрожжевая двухгибридная система ^2Н), GST-PD, коиммунопре-ципитация, кокристаллизация, LC-MS/MS [53—57]. В настоящее время известно более 100 клеточных белков, с которыми может взаимодействовать N81, однако их исчерпывающий список далёк от формирования [6, 53, 58]. Это связано не только с использованием новых методов и подходов, но и с тем, что взаимодействующие с N81 белки определяются полиморфизмами в N81 и могут отличаться для разных штаммов ВГА. На рис. 4 изображены клеточные и вирусные партнеры N81 по данным базы Уц-шМепШа [59].
Схематически их можно разбить на 4 группы [5, 6, 58]. Первая группа включает ядерные белки, задействованные в созревании и экспорте клеточных мРНК из ядра в цитоплазму, такие как 30 кДа-субъединица фактора специфического расщепления и полиаденилирования (CPSF30),
поли(А)-связывающий белок II (PABPII), фактор ядерного экспорта РНК 1 (NXF1/TAP), нуклеолин, NS1-BP, днРНК-специфическая аденозиндезаминаза 1 (ADAR1), РНК геликазы DHX9 и DDX21, фактор процессинга пре-мРНК 19 (PRPF19). Вторая группа включает белки цитоплазмы, участвующие в транспорте и трансляции мРНК: днРНК-связывающий белок hS-taufen, фактор инициации трансляции eIF4GI, поли(А)-связывающий белок I (PABPI), импортин-а. В третью группу входят белки, участвующие в сигналинге и механизмах противовирусной защиты, такие как геликаза RIG-I, трипартит мо-тивсодержащий белок 25 (TRIM-25), РНК-активируемая протеинки-наза (PKR), активатор PKR (PACT), PI3K, PDZ-содержащие белки, белок теплового шока Hsp90, ядерный фактор NF90. Четвертую группу составляют белки вируса гриппа: РНК-зависимая РНК-полимераза и NP. Большинство белков взаимодействует с областью ED. Некоторые белки, например изоформы импортина-а, напрямую связываются с RBD, в то время как другие взаимодействуют не напрямую, а через связанную днРНК, либо находясь в составе белковых комплексов [6, 60]. Необходимо учитывать, что взаимодействия определяются полиморфизмами в белковой последовательности NS1. Сводные данные по основным функциональным доменам NS1 представлены в таблице.
Анализ аминокислотных замен в структурных и функциональных сайтах NS1.
Белок NS1 является относительно консервативным с точки зрения эволюции вируса и, выполняя множество функций взаимодействия с клеточными факторами, играет чрезвычайно важную роль в адаптации вируса к хозяину. В связи с этим крайне интересно определить ви-доспецифические аминокислотные сайты и соотнести их с функциональной нагрузкой соответствующих участков белка. Ключевые аминокислотные замены в последовательностях клейдов NS1 представлены на рис. 5.
РНК-связывающий домен.
N-концевой RBD содержит NLS, сайт связывания с днРНК и сайт димеризации [5, 61,62]. В RBD NSbm имеется несколько ключевых замен по сравнению с пред-ковой последовательностью NS1918.
РНК-связывающий сайт содержит 13 аминокислотных замен в положениях 5, 29, 31, 34, 35, 37, 38, 41, 42, 44, 45, 46 и 49, ключевой из которых является R38. При этом входящие в состав РНК-связывающего сайта R35, R38 и K41 образуют NLS1 и абсолютно необходимы для связывания NS1 с импортином-а [28, 63]. R35 и R38 в NS1 являются абсолютно консервативными для всех изученных вирусов. K41 также консервативен за ис-
ключением NS, на K41R. В NS,
, у которых в 1974 г. произошла замес 1935 г. наблюдалась замена R44K,
reviews
Рис. 5. Аминокислотные замены в белке NS1 штаммов ВГА человека и свиньи, относящихся к различным филогенетическим линиям. Представленные штаммы относятся к следующим клейдам гена NS: A/Brevig_Mission/1/1918 (H1N1) — NS ; A/Memphis/10/1983 (H1N1), A/Malaysia/11641/1997 (H1N1) — NSh,n,; A/Taiwan/1/64 (H2N2) — NSH2N2; A/Hong_Kong/1_1/1968 (H3N2), A/0regon/02/2016 (H3N2) — NSH)n,; A/swine/Minnesota/24/1975 (Classical) — NS . ; A/swine/fowa/8548_1/98 (Triple) — NS .; A/California/14/2009 (H1N1pdm09) —"NS, dm09; A/swine/England/195852/1992 (Eurasian)c — NS ; A/Vietnam/CL01/2004 — NS . "
однако она сохранилась только для клейда а в
клейдах N8^^ и произошла обратная замена
K44R. Примечательно, что такая же замена R44K появилась в № , в 1971 г. и сохранилась в N8 и N8 , „„.
сШш т „
Остальные а.о., образующие РНК-связывающий сайт, в процессе эволюции не изменялись.
Область, отвечающая за димеризацию RBD, образована шестью аминокислотами в положениях 12, 19, 29, 32, 35 и 46 [64, 65]; эти аминокислоты являются абсолютно консервативными среди всех изучаемых последовательностей.
В области 21—23 а.о. мутации произошли только в N8^ г.. По сравнению с предковой последовательностью в N8, ог. присутствовали замены R21Q (с 1948 г.) и Е22У Кроме того, в К8Д2^2 с 1960 г. появилась замена Л23У, которая сохранилась и для N8^^. Эта область соответствует С-концевому фрагменту а-спирали (2—25) RBD.
Для всех N8 начиная с 1940 г. и N8 начиная
питоп _5ш_огг
с 1978 г. наблюдается замена Л60У. В N8 и N8
еиг^ю ау
встречается спорадическая замена Л60Е. Замена в 60-м положении не соответствует ни одному из известных функциональных доменов N81 и приходится на область а-спирали (54—70).
Для N8 . выявлены следующие замены: У181, Q25N, R59L и R<э7W (все с 1957 г.), а также E26G (с 1966 г.) и R44K (с 1971 г.). Все эти замены сохранились и в N8 , Кроме того, для N8 ^ были описаны замены У6М, ТКЖ (с 2015 г.) и Е55К (?с;т2^013 г.). Все эти замены за исключением R44K расположены за пределами функциональных сайтов и приходятся на области а-спиралей. Междоменная линкерная область. За RBD следует подвижная междоменная линкерная область длиной 13 а. о., соединяющая RBD и ED N81 [32]. Для вирусов Н5Ш в линкерной области описана деления
обзоры
Структурные и функциональные домены и сайты в белке NS1 ВГА
Домен Длина, а.о. А.о. Описание Ссылка
РНК-связывающий 73 1—73 N-концевой RBD отвечает за связывание с молекулами РНК и [5, 61,
домен (RBD) взаимодействие с RIG-I (через днРНК, PABPI и импортин-а) 62]
РНК-связывающий 13 5, 29, 31, 34, 35, 37, 38, 41, 42, Несколько а.о. вносят вклад в эффективное связывание днРНК [62, 65,
сайт 44, 45, 46, 49 белком NS1, но только R38 является абсолютно необходимой 92]
Интерфейс с диме- 6 12, 19, 29, 32, 35, 46 Димеризация RBD необходима для реализации РНК- [64, 65]
ризацией RBD связывающей активности
Сигнал ядерной ло- 3 35, 38, 41 А.о. в положениях 35, 38 и 41 играют ключевую роль в функциони- [28, 63]
кализации 1 (NLS1) ровании NLS1 и необходимы для связывания импортина-а
Детерминанта виру- 1 42 Введение замены P42S из вируса A/Duck/Guangxi/27/03 в А/ [93]
лентности; тканевой Duck/Guangxi/12/03 увеличивало вирулентность по показателям
тропизм летальности у мышей и системному распространению инфекции. Эта замена также влияет на ИФН-путь
Междоменный 13 6 8 4 7 Подвижный линкер между RBD и ED. Может варьироваться по [32]
линкер длине. Делеция 5 а.о. часто встречается в современных изолятах вирусов H5N1
Детерминанта виру- 5 80—84 Введение искусственной делеции из 15 нуклеотидов в [7, 66]
лентности рекомбинантном вирусе A/WSN/33/(H1N1) x А/Duck/ Shangdong/093/2004 (H5N1) (HA,NA) привело к увеличению вирулентности у мышей
Сайт взаимодей- 33 81—113 Взаимодействие NS1 с eIF4GI может приводить к предпочти- [94]
ствия с eIF4GI тельной трансляции вирусных мРНК
Эффекторный домен 117 87—203 ED опосредует взаимодействия с несколькими клеточными [5, 32,
(ED) белками и может стабилизировать RBD 75, 81]
Сайт связывания 20 87, 89, 91, 95, 96, 98, 99, 101, Связывание NS1 c p85b-PI3K приводит к активации PI3K- [35, 38,
p85b-PI3K 118, 133, 135, 142, 143, 145, 146, 148, 159, 161, 162, 164 сигналинга, необходимой для эффективной вирусной репликации, вероятно, по механизму предотвращения апоптоза клеток хозяина или повышения активности натриевых каналов 68—70]
Детерминанты пато- 5 90—94 Делеция 5 аминокислот, расположенных внутри области eIF4GI- [67]
генности; детерми- связывающего домена NS1, увеличивает вирулентность и пато-
нанты вирулентности генность вирусов H5N1
Детерминанты виру- 10 90—99 Укорочение eIF4GI-связывающего домена аттенуирует вирусную [67]
лентности репликацию in vitro и in vivo
Детерминанта пато- 1 92 Внесение замены E92D в вирусе A/HK/156/97 усиливало устой- [7]
генности чивость к цитокинам
Сайт взаимодей- 2 96, 97 Сайт необходим для взаимодействия с TRIM-25 и ингибирова- [71]
ствия с TRIM-25 ния RIG-I; важен для активации PI3K (вероятно, осуществляя прямой контакт с петлей активации p110 [70])
Детерминанта виру- 1 101 Вирулентность штаммов HK156 у мышей определяется амино- [71]
лентности кислотными заменами в HA (211), PB1 (456 and 712), PA (631), NP (127) и NS1 (101)
Тканевой тропизм; 2 103, 106 Введение замен L103F и I106M в вирусе A/HK/483/1997 усилило [72, 73]
детерминанты виру- вирулентность по сравнению с вирусом дикого типа по показате-
лентности лю летальности у мышей
Сайт связывания 28 103, 105—110, 117, 119—126, Необходим для связывания CPSF30 и ингибирования пост- [74-78]
CPSF30 151, 153, 155—157, 180, 181, 183, 184, 187—189 трансткрипционного 3'-концевого процессинга клеточных пре-мРНК
Сайт димеризации 17 106, 108—110, 117, 119, 121, Структура двух петель ED консервативна во всех кристалличе- [70, 81]
ED 124, 179—181, 183, 184, 186—189 ских моделях апо-ED, хотя ее физиологическая значимость неизвестна. W187 существенен для ED-димеризации in vitro
Сайт связывания 4 123, 124, 126, 127 Необходим для взаимодействия с PKR, приводящего к ингибиро- [79]
PKR ванию фосфорилирования eIF2a
Детерминанта пато- 1 125 Мутация D125G вызывает высокую патогенность у мышей на [80]
генности последнем пассаже 10 и также вызывает усиленную способность к связыванию а2,3- и а2,6-сиаловых рецепторов
Сигнал ядерного 11 137—147 L144 и L146 существенны для активности NES [30]
экспорта (NES)
Сайт маскирования 14 148—161 Последовательность сайта ингибирует активность NES. R148, [30]
NES E152 и E153 критичны для функционирования данного сайта
Детерминанта пато- 1 171 Мутация A171Y приводит к снижению экспрессии ИФН и ИФН- [95]
генности стимулируемых генов в клетках A549
Продолжение табл. см. на стр. 254
reviews
Подвижный хвосто- 27 вой домен
Детерминанты пато- 2 генности
Сайт связывания Crk/CrkL-SH3
Сайт фосфорилиро-вания
Сигнал ядерной локализации 2 (NLS2)
Сайт связывания РЛВР11
Тканевой тропизм; клинические симптомы заболевания
Мотив PDZ-лиганда
C-концевое расширение
6 6
15
204—230
200, 205
212, 214, 215, 217
213—217, 219
219, 220, 224, 229, 231, 232
223—237
226—230
227—230
231—237
Подвижный хвост, вероятно, является неструктурированным и [81] вариабельным по длине. Он содержит ряд мотивов, в том числе CDK/ERK фосфорилирования, Сгк/Сгк^Ю связывания, PDZ-
лиганд и NoLS/NLS2 А.о. в положениях 200 и 205 N81 вносят вклад в повышенную [82] ИФН типа I антагонистическую активность. Аминокислотные отличия в положениях 134 НА, 200 и 205 N81, 47 и 51 N82 вызывают разницу в вирулентности между высоко- и низкопатогенными вирусами Н5Ш Необходим для связывания с Сгк/Сг^. Мотив связывания Сгк/ [83] СЛ-8Н3 часто встречается в штаммах ВГА птиц, а также в пандемическом вирусе человека 1918 г.
ТЫТ215 фосфорилируется киназами CDKs/ERKs. Необходим для [84] эффективной вирусной репликации в культуре тканей
Эти основные а.о. существенны для функционирования NLS2 и [28, 63] требуются для связывания импортина-а. Эти же а.о. формируют сигнал нуклеолярной локализации (NoLS) у некоторых штаммов
Соответствует РАВРП-связывающей области N81. Может быть [85, 86] вовлечен в ингибирование посттранскрипционного 3'-концевого процессинга клеточных пре-мРНК
Встраивание этого мотива в С-концевую область N81 вируса А/ [39] WSN/33 приводило к существенному снижению массы животных по сравнению с вирусом дикого типа. Вирус вызывал тяжелый альвеолит и геморрагию в тканях легких мышей
Связывает PDZ-домен-содержащие белки. С-концевой PDZ- [39,
связывающий мотив обнаруживается преимущественно в 87—90] птичьих изолятах (обычные варианты включают Е8ЕУ/ЕРЕУ/ КЭЕУ у ВГА птиц)
Функция неизвестна, но оно может вносить вклад в NoLS/NLS2. [63] Мотив превалировал среди вирусов, выделенных с 1950 по 1987 г.
4
5
4
7
участка 80—84 а.о., которая, вероятно, нарушает ориентацию и/или стабильность RBD, что приводит к увеличению устойчивости к цитокинам и усилению вирулентности [66]. В этой области в NS, . присутствует замена I81M. Кроме
hum _ori .
того, с 1940 г. выявлена замена V84A, которая сохранилась в NS и NS , однако в NSfflN2 с 1971 г. произошла замена A84T. Для NS , характерны замены в двух сайтах: A76T и A86S (NScla2)oii A86T (NS и NSpdm)9). Кроме того, для NS , „„ была описана замена K78R. Р
Эффекторныи домен.
За линкерной областью следует протяженный ED, который осуществляет взаимодействие с ядерными белками клетки-хозяина и отвечает за ядерно-цитоплазматический транспорт зрелых мРНК в инфицированных клетках [5].
С 81-го по 113-й а.о. NS1 локализован сайт взаимодействия с фактором трансляции eIF4GI, связывание с которым приводит к преимущественной трансляции с вирусными мРНК [67]. Вышеописанные замены в 81, 84 и 86-м положениях линкерной области NS1, как и замены в положениях 90, 91, 95, 98, 108, 111 и 112 (см. далее), приходятся именно на сайт взаимодействия с eIF4GI. Мотив, отвечающий за связывание с фактором eIF4GI, перекрывается с рядом сайтов.
К ним относится сайт, отвечающий за связывание с белком и активацию PI3K сигнального пути, которые обеспечивают эффективную репликацию, вероятно, по механизму задержки апоптоза инфицированных клеток или увеличению активности натриевых каналов. В состав P85p-PI3K-связывающего сайта входят а.о. в положениях 87, 89, 91, 95, 96, 98, 99, 101, 118, 133, 135, 142, 143, 145, 146, 148, 159, 161, 162, 164 [35, 38, 68—70]. В области сайта взаимодействия с eIF4GI и P85P в NS появилась мутация в 91-м положении — T91A,
sw ori J ^
при этом в N8 , „„ произошла замена А918. В N8
рат09 * пит _оп
с 1940 г. наблюдалась замена L95I. Однако в N8 с 2001 г. появилась замена 195У, в N8^ — 195Т с 1975 г. В N8«, после 1961 г. произошла замена M98L, которая далее сохранилась в последовательностях клейда
Ключевую роль в патогенности вирусов играет участок 90—94 а.о. домена связывания с eIF4GI. Показано, что делеция этих 5 а.о. приводит к увеличению вирулентности и патогенности вирусов Н5Ш [67]. Для N8«, с 1971 г. в этом участке присутствует замена L90I. В N8 .. также встречается замена L90I примерно в половине штаммов, при этом замена L90I коррелирует с заменой K70R. Для N8 замена L90I присутствует с 2012 г.
В 92-м положении N81 описана мутация D92E, определяющая устойчивость к цитокинам и снижающая эффективность фосфорилирования N81 [7]. Такую мутацию обнаружили только для последовательностей N8 вирусов птичьего происхождения.
В положениях 96 и 97 N81 находятся а. о., отвечающие за взаимодействие с белком ТЫМ-25, которое обеспечивает ингибирование КЮ^ [71]. Эти же а. о. существенны для активации РВК, вероятно, осуществляемой за счет прямого контакта с петлей активации р110 [70]. Замен в этих положениях среди анализируемых последовательностей не обнаружено.
В 101-м положении N81 находится а.о., замена которого в совокупности с заменами в НА (211), РВ1 (456 и 712), РА (631), № (127) может приводить к усилению вирулентности [71]. Замена D101N присутствует в N8^3 с 1980 г.
В 103-м и 106-м положениях N81 расположены аминокислоты, замены которых (F103L и M106I) также могут приводить к увеличению вирулентности [72, 73].
обзоры
При анализе данных а.о. отличия были обнаружены только для последовательностей NS и штамма A/Puerto Rico/8/34 (F103S и M106I).
Далее по последовательности NS1 расположен мотив связывания фактора CPSF30, связывание с которым приводит к ингибированию посттранскрипционного 3-концевого процессинга клеточных пре-мРНК [74-78]. Он включает а. о. в положениях 103, 105—110, 117, 119—126, 151, 153, 155—157, 180, 181, 183, 184, 187—189.
Много замен приходится на область 108—119 а.о., часть из них затрагивает сайт связывания с CPSF30. В NS с 1971 г. одновременно появились замены K108R и I117V. Замена I117V произошла и в последовательностях клейда NS в 1980 г. В NSfl2W2 с 1960 г. закрепилась замена M119I, которая передалась последовательностям NS™,,, но с 1977 г. в них произошла обратная замена I119M.
Область 123—127 а.о. отвечает за взаимодействие с PKR, приводящее к ингибированию фосфорилирова-ния eIF2a [79]. В NSfflM (после 1977 г.) и NS^ ог. в этой области присутствует замена D125E, в NS^m09 "с 2013 г. произошла обратная замена E125D. По данным работы [80] замена G125D приводит к высокой патогенности у мышей и усиливает сродство к a2,3- и а2,6-сиаловым рецепторам.
В последовательностях NS1 всех изучаемых вирусов, кроме вирусов птичьего происхождения, присутствует замена S114P. В NSfl2W2 после 1960 г. появилась замена A112E, которая сохранилась в клейде NSfflM. Эти замены не соответствуют никаким функциональным сайтам и находятся на стыке двух Р-нитей (107—112 и 115— 120). Однако сопоставление пространственной структуры соответствующих участков NS1 вирусов H1N1 и H5N1 показало отсутствие каких-либо изменений пространственной структуры прилегающих Р-нитей. В NSm появилась замена I129M, сохранившаяся и в NS Кроме того, в этом же положении появилась замена Il29Vв NS^.
Далее по последовательности NS1 следует NES, расположенный между 137-м и 147-м а.о. [30]. Ключевая роль в NES принадлежит L144 и L146, которые обычно маскируются близлежащим участком 148—161 а.о., в котором критически важны R148, E152 и E153. В 144-м положении в NSmM в 1995 г. появилась замена L144I, в остальных NShum других значимых замен в 144-м и 146-м положениях нет. В NS^ ог. с 1977—1979 г. присутствует замена D139N, характерная и для NSav, однако она не затрагивает ключевые аминокислоты NES.
Кроме того, в области NES есть замена I145T, появившаяся с 1985 г. в NSfflM, и I145V, появившаяся с 1979 г. в NSfl3W2. А.о. в 145-м положении соответствуют одному из а. о., образующих сайт связывания P85P, который перекрывается с NES. Далее по последовательности NS1 нет значимых замен в сайте связывания P85p.
Область маскирования NEP перекрывается с аминокислотами в 151, 153, 155—157-м положениях, входящими в состав сайта связывания CPSF30, однако в этой области замен нет. Оставшаяся часть сайта связывания CPSF30 расположена в области 180—189 а.о., в которой есть одна замена D189G в NS^ ri.
В NSfflM присутствует замена^17Ш, а в с 1960 г. и в NSfl3W2 — N171I. Этот сайт является вариабельным, так как в нём есть замены и в остальных клейдах. Для всех NS, после 1935 г. имеется замена V178I. Такая
hum on
же замена V178I обнаружена у всех последовательностей NS и NS , но не NS . Эти замены приходятся на область a-спирали (170—188).
В клейде NS, присутствует замена E196K с 1940 г.,
hum_ori А J J
однако в NS„1M с 1987 г. произошла обратная замена K196E. В NS> и NSm._ после 1985 г. появилась заме-
swori H3N2
на T197N. А.о. в этих двух положениях находятся рядом с потенциальным сайтом фосфорилирования S195, замена которого приводит к задержке NS1 в ядре. У всех изученных вирусов замены в 195-м положении нет.
Неструктурированный С-концевой домен.
Далее с 204-го по 230-й а.о. следует подвижный С-концевой домен переменной длины. Он содержит ряд мотивов, таких как сайты CDK/ERK фосфорилирования, Crk/CrkL-SH3 связывания, PDZ-лиганд и NoLS/ NLS2 [81].
Аминокислоты в 200-м и 205-м положениях NS1 вместе с 134-м а.о. HA и 47-м и 51-м а.о. NEP вносят вклад в повышенную активность антагониста ИНФ I типа, обеспечивая разницу в вирулентности между низко- и высокопатогенными вирусами H5N1 [82]. В NSr. и NSpdm09 присутствует замена S205N, однако в NS^dm09 в 2012 г. произошла обратная замена. В 206-м положении выявлены замены S206R среди NS , и NS и S206C в
clasw tri
NS^m09. КРо№ ^^ в 207-м (У NS„^m09) и 209-м (кр°ме
pdm09'
N8 , „„) положениях выявлены замены N на D. В NS и
рат09 ау1
N8 ог. таких замен нет.
Далее следует сайт связывания Сгк/Сг^-8Н3 (212, 214, 215 и 217-й а.о.), характерный для ВГА птиц и вируса 1918 г. [83]. В 215-м положении у всех N8^ ог. присутствует замена Р215Т. Кроме того, в N8 . появилась замена К217Е (с 1957 г.), а в N8 — Р2128°или Р212К Треонин в 215-м положении фосфорилируется про-линспецифическими киназами, такими как CDK/ERK, узнающими определённый мотив 213—217 и 219-й а.о. [84]. Этот сайт фосфорилирования отсутствует в N8^ ог. (включая N8 , 09) и N8 .
Участок 219—232 а.о. соответствует области NLS2 [28, 63]. В нем ключевую роль играют а.о. в 219, 220, 224, 229, 231 и 232-м положениях. Эти же аминокислоты формируют в некоторых штаммах ВГА NoLS. Участок 219—232 а.о. частично перекрывается с РАБРП-связывающим сайтом (223—237 а.о.), который вовлечён в ингибирование посттранскрипционного процессинга 3-концов клеточных пре-мРНК [85, 86].
Участок 227—230 а.о. является PDZ-лигандом, который связывает белки, содержащие PDZ-домен [39, 87—90]. У всех сезонных штаммов в области PDZ-лиганда присутствует замена K227R, которая приводит к появлению мотива RSEV. Кроме того, для клейдов N8™ и N8^^ в 229-м положении произошла замена Е229к (мотив RSKV). Примечательно, что единственным исключением является относящийся к подтипу Н3№ штамм А/Но^_ Ко^/1_1/1968 (Н3Ш), содержащий мотив RSEV. Таким образом, для клейдов N8^ и N8^^ характерен мотив RSKV. Однако в N8 с 2011—2012 гг. наблюдалась спорадическая замена К229Е, которая окончательно зафиксировалась с 2013 г. В клейде N8^^ присутствует мотив RSEV. В частности, у вируса подтипа Н1Ш USSR77 1977 г. присутствует мотив RSEV, как и у последнего вируса Н1Ш 1957 г. При этом варианты ESEV/EPEV/KSEV являются мотивами для связывания PDZ-домена, а RSKV/ RSEV не являются. В N8 имеются мотивы EPEV и Е8ЕУ В N8 после 1966 г. наблюдается делеция обла-
шоп
сти 220—230 а.о. Такая же делеция спорадически встре-
reviews
чается в NS и NS , , но не в NS , „„. В NS также
tri clasw7 pdm09 eursw
иногда встречается делеция этой области, а также замена K227G в случае, если эта область не удалена.
В сезонных штаммах с 1940 г. стал появляться мотив RRNKMVD, расположенный в области 231—237 а. о. Его функция точно неизвестна, но он предположительно может вносить вклад в NoLS/NLS2 [63]. В этом мотиве периодически возникала замена V236A, которая окончательно зафиксировалась в клейде NSfl2W2 с 1957 г. Далее в 1960 г. появилась замена N233D, которая сохранилась в клейдах NS^ и NSfflN2. Далее мотив RR(N/D)KMAD присутствовал в сезонных вирусах до 1990 г., после чего произошла его делеция.
Заключение
Проведённый анализ аминокислотных замен в структурных и функциональных доменах белка NS1 ВГА человека показывает, что большинство из них оставались консервативными в процессе эволюции в течение последнего столетия. Наблюдаемая консервативность NS1 наряду с данными о том, что делеция открытой рамки считывания NS1 (а также некоторые замены в гене NS) существенно снижает уровень репликации и степень патогенности ВГА, делают этот белок перспективной мишенью для терапии гриппа. При дизайне лекарственных препаратов, направленных на NS1, может быть использовано несколько стратегий. Во-первых, можно блокировать синтез самого белка, например, с помощью малых интерферирующих РНК, направленных на консервативные области гена NS. Во-вторых, можно подбирать соединения (низкомолекуляр-нае соединения, пептиды, ДНК-аптамеры), специфически блокирующие сайты взаимодействия NS1 с ключевыми клеточными и вирусными факторами. В-третьих, в качестве мишеней для терапии гриппа можно рассматривать не сам NS1, а его клеточные белки-партнёры, взаимодействие с которыми необходимо для вирусной репликации. В настоящее время имеется несколько соединений, направленных на белок NS1, для которых показана противовирусная активность in vitro и даже in vivo [91]. Несмотря на то что большинство таких разработок находится в ранних стадиях, не вызывает сомнения, что данное направление будет активно развиваться в ближайшее время.
Финансирование. Данная работа выполнена при финансовой поддержке РНФ грант № 15-15-00170, а также при финансовой поддержке РФФИ грант № 16-34-01110.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (п.п. 1—15, 17—44, 46—101 см. REFERENCES)
16. Киселёв О.И. Геном пандемического вируса гриппа Ä/HlNlv—
2009. СПб.-М.: Димитрейд График Групп; 2011. 45. Плотникова М.А., Васин А.В., Клотченко С.А., Смирнова Т.Д., Даниленко Д.М., Егоров В.В. и др. Сравнение паттерна экспрессии мРНК цитокинов в эпителиальных клетках А-549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1pdm09, A/H3N2 и A/H5N1. Цитокины и воспаление. 2013; (12): 57—65.
REFERENCES
1. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O T., Chambers T.M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol. 1992; (56): 152—79.
2. Taubenberger J.K., Kash J.C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell. Host. Microbe. 2010; (7): 440—51.
3. Noronha J M., Liu M., Squires R.B., Pickett B.E., Hale B.G., Air
G.M., et al. Influenza virus sequence feature variant type analysis: evidence of a role for NS1 in influenza virus host range restriction. J. Virol. 2012; (86): 5857—66.
4. Egorov A., Brandt S., Sereinig S., Romanova J., Ferko B., Katinger D., et al. Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J. Virol. 1998; (72): 6437—41.
5. Hale B.G., Randall R.E., Ortin J., Jackson D. The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. J. Gen. Virol. 2008; (89): 2359—76.
6. Marc D. Influenza virus non-structural protein NS1: Interferon antagonism and beyond. J. Gen. Virol. 2014; (95): 2594—611.
7. Seo S.H., Hoffmann E., Webster R.G. Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat. Med. 2002; (8): 950—4.
8. Taubenberger J.K., Morens D.M. 1918 Influenza: The mother of all pandemics. Emerg. Infect. Dis. 2006; (12): 15—22.
9. Morens D.M., Taubenberger J.K., Harvey H.A., Memoli M.J. The 1918 influenza pandemic: lessons for 2009 and the future. Crit. Care Med. 2010; (38): e10—e20.
10. Smith G.J.D., Bahl J., Vijaykrishna D., Zhang J., Poon L.L.M., Chen
H., et al. Dating the emergence of pandemic influenza viruses. Proc. Natl. Acad Sci. USA. 2009; (106): 11709—12.
11. Xu J., Zhong H.A., Madrahimov A., Helikar T., Lu G. Molecular phylogeny and evolutionary dynamics of influenza A nonstructural (NS) gene. Infect. Genet. Evol. 2014; (22): 192—200.
12. Vasin A.V, Petrova A.V., Egorov V.V, Plotnikova M.A., Klotchenko S.A., Karpenko M.N., et al. The influenza A virus NS genome segment displays lineage-specific patterns in predicted RNA secondary structure. BMC Res. Notes. 2016; (9): 279.
13. Vincent A., Awada L., Brown I., Chen H., Claes F., Dauphin G., et al. Review of Influenza A Virus in Swine Worldwide: A Call for Increased Surveillance and Research. Zoonoses Public Health. 2014; (61): 4—17.
14. Trifonov V., Khiabanian H., Rabadan R. Geographic dependence, surveillance, and origins of the 2009 influenza A (H1N1) virus. N. Engl. J. Med 2009; 361: 115—9.
15. Nakajima K., Desselberger U., Palese P. Recent human influenza A (H1N1) viruses are closely related genetically to strains isolated in 1950. Nature. 1978; 274: 334—9.
16. Kiselev O.I. Genome of Pandemic Influenza A / HINlv virus—2009 [Genom pandemicheskogo virusa grippa A/HlNlv—2009]. St. Petersburg-Moscow: Dimitreyd Grafik Grupp; 2011. (in Russian)
17. Garten R.J., Davis C.T., Russell C.A., Shu B., Lindstrom S., Balish A., et al. Antigenic and genetic characteristics of swine-origin 2009 A(H1N1) influenza viruses circulating in humans. Science. 2009; 325: 197—201.
18. Komadina N., McVernon J., Hall R., Leder K. A Historical Perspective of Influenza A(H1N2) Virus. Emerg. Infect. Dis. 2014; (20): 6—12.
19. Gaydos J.C., Top F.H., Hodder R.A., Russell P.K. Swine influenza A outbreak, Fort Dix, New Jersey, 1976. Emerg. Infect. Dis. 2006; (12): 23—8.
20. de Wit E., Munster V.J., van Riel D., Beyer W.E.P., Rimmelzwaan G.F., Kuiken T., et al. Molecular determinants of adaptation of highly pathogenic avian influenza H7N7 viruses to efficient replication in the human host. J. Virol. 2010; (84): 1597—606.
21. Vasin A.V., Temkina O.A., Egorov V.V., Klotchenko S.A., Plotnikova M.A., Kiselev O.I. Molecular mechanisms enhancing the proteome of influenza A viruses: an overview of recently discovered proteins. Virus Res. 2014; 185: 53—63.
22. García-Sastre A., Egorov A., Matassov D., Brandt S., Levy D.E., Durbin J.E., et al. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology. 1998; 252: 324—30.
23. Robb N.C., Jackson D., Vreede F.T., Fodor E. Splicing of influenza A virus NS1 mRNA is independent of the viral NS1 protein. J. Gen. Virol. 2010; 91: 2331—40.
24. Chua M.A., Schmid S., Perez J.T., Langlois R.A., and Tenoever B.R. Influenza A virus utilizes suboptimal splicing to coordinate the timing of infection. Cell Rep. 2013; (3): 23—9.
25. Paterson D., Fodor E. Emerging Roles for the Influenza A Virus Nuclear Export Protein (NEP). PLoSPathog. 2012; 8(12): e1003019.
26. Shaw M.L., Stone K.L., Colangelo C.M., Gulcicek E.E., Palese P. Cellular proteins in influenza virus particles. PLoS Pathog. 2008; (4): 1—13.
27. Hutchinson E.C., Charles P.D., Hester S.S., Thomas B., Trudgian D.,
0E30Pbl
Martinez-Alonso M., et al. Conserved and host-specific features of influenza virion architecture. Nat. Commun. 2014; (5): 4816.
28. Greenspan D., Palese P., Krystal M. Two nuclear location signals in the influenza virus NS1 nonstructural protein. J. Virol. 1988; 62: 3020—6.
29. Schneider J., Wolff T. Nuclear functions of the influenza A and B viruses NS1 proteins: Do they play a role in viral mRNA export? Vaccine. 2009; 27: 6312—6.
30. Li Y., Yamakita Y., Krug R.M. Regulation of a nuclear export signal by an adjacent inhibitory sequence: the effector domain of the influenza virus NS1 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95: 4864—9.
31. Boulo S., Akarsu H., Ruigrok R.W.H., Baudin F. Nuclear traffic of influenza virus proteins and ribonucleoprotein complexes. Virus Res. 2007; 124: 12—21.
32. Bornholdt Z.A., Prasad B.V.V. X-ray structure of influenza virus NS1 effector domain. Nat. Struct. Mol. Biol. 2006; (13): 559—60.
33. Carrillo B., Choi J.-M., Bornholdt Z.A., Sankaran B., Rice A.P., Prasad B.V.V. The influenza A virus protein NS1 displays structural polymorphism. J. Virol. 2014; 88: 4113—22.
34. Hale B.G. Conformational plasticity of the influenza A virus NS1 protein. J. Gen. Virol. 2014; 95(Pt. 10): 2099—105.
35. Shin Y.K., Li Y., Liu Q., Anderson D.H., Babiuk L.A., Zhou Y. SH3 binding motif 1 in influenza A virus NS1 protein is essential for PI3K/ Akt signaling pathway activation. J. Virol. 2007; 81: 12730—9.
36. Li Y., Anderson D.H., Liu Q., and Zhou Y. Mechanism of influenza A virus NS1 protein interaction with the p85ß, but not the p85a, subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and up-regulation of PI3K activity. J. Biol. Chem. 2008; 283: 23397—409.
37. Ehrhardt C., Ludwig S. A new player in a deadly game: influenza viruses and the PI3K/Akt signalling pathway. Cell. Microbiol. 2009; (11): 863—71.
38. Ehrhardt C., Wolff T., Pleschka S., Planz O., Beermann W., Bode J.G., et al. Influenza A virus NS1 protein activates the PI3K/Akt pathway to mediate antiapoptotic signaling responses. J. Virol. 2007; 81: 3058—67.
39. Jackson D., Hossain M.J., Hickman D., Perez D.R., Lamb R.A. A new influenza virus virulence determinant: the NS1 protein four C-terminal residues modulate pathogenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 4381—6.
40. Golebiewski L., Liu H., Javier R.T., Rice A.P. The avian influenza virus NS1 ESEV PDZ binding motif associates with Dlg1 and Scribble to disrupt cellular tight junctions. J. Virol. 2011; 85: 10639—48.
41. Bavagnoli L., Dundon W.G., Garbelli A., Zecchin B., Milani A., Pa-rakkal G., et al. The PDZ-ligand and Src-homology type 3 domains of epidemic avian influenza virus NS1 protein modulate human Src kinase activity during viral infection. PLoS One. 2011; (6): 1—12.
42. Peng X., Chan E.Y., Li Y., Diamond D.L., Korth M.J., Katze M.G. Virus-host interactions: from systems biology to translational research. Curr. Opin. Microbiol. 2009; (12): 432—8.
43. Geiss G.K., Salvatore M., Tumpey T.M., Carter V.S., Wang X., Basler C.F., et al. Cellular transcriptional profiling in influenza A virus-infected lung epithelial cells: the role of the nonstructural NS1 protein in the evasion of the host innate defense and its potential contribution to pandemic influenza. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99: 10736—41.
44. Kash J.C., Tumpey T.M., Proll S.C., Carter V., Perwitasari O., Thomas M.J., et al. Genomic analysis of increased host immune and cell death responses induced by 1918 influenza virus. Nature. 2006; 443: 578—81.
45. Plotnikova M.A., Vasin A.V., Klotchenko S.A., Smirnova T.D., Da-nilenko D.M., Egorov V.V., et al. Comparison of the cytokine mRNA expression pattern in epithelial cells A-549 infected with the influenza viruses A / H1N1pdm09, A / H3N2 and A / H5N1. Tsitokiny i vospalenie. 2013; (12): 57—65. (in Russian)
46. Mi H., Huang X., Muruganujan A., Tang H., Mills C., Kang D., et al. PANTHER version 11: Expanded annotation data from Gene Ontology and Reactome pathways, and data analysis tool enhancements. Nucleic Acids Res. 2017; 45: D183—9.
47. Fabregat A., Sidiropoulos K., Garapati P., Gillespie M., Hausmann K., Haw R., et al. The reactome pathway knowledgebase. Nucleic Acids Res. 2016; 44: D481—7.
48. Davidson S., McCabe T.M., Crotta S., Gad H.H., Hessel E.M., Beinke S., et al. IFNA. is a potent anti-influenza therapeutic without the inflammatory side effects of IFNa treatment. EMBO Mol. Med. 2016; (8): 1099—112.
49. Shimizu K., Iguchi A., Gomyou R., Ono Y. Influenza virus inhibits cleavage of the HSP70 pre-mRNAs at the polyadenylation site. Virology. 1999; 88: 14078—9.
50. Cao M., Wei C., Zhao L., Wang J., Jia Q., Wang X., et al. DnaJAl/ Hsp40 Is Co-Opted by Influenza A Virus To Enhance Its Viral RNA Polymerase Activity. J. Virol. 2014; 254: 213—9.
51. Li T., Li X., Zhu W.F., Wang H.Y., Mei L., Wu S.Q., et al. NF90 is a novel influenza A virus NS1-interacting protein that antagonizes the inhibitory role of NS1 on PKR phosphorylation. FEBS Lett. 2016; 590(16): 2797—810.
52. Downey J., Pernet E., Coulombe F., Allard B., Meunier I., Jaworska J., et al. RIPK3 interacts with MAVS to regulate type I IFN-mediated immunity to Influenza A virus infection. PLoS Pathog. 2017; (13): e1006326.
53. Thulasi Raman S.N., Zhou Y. Networks of Host Factors that Interact with NS1 Protein of Influenza A Virus. Front. Microbiol. 2016; (7): 654.
54. Zhang C., Yang Y., Zhou X., Yang Z., Liu X., Cao Z., et al. The NS1 protein of influenza a virus interacts with heat shock protein Hsp90 in human alveolar basal epithelial cells: Implication for virus-induced apoptosis. Virol. J. 2011; (8): 181.
55. Wang L., Fu B., Li W., Patil G., Liu L., Dorf M.E., et al. Comparative influenza protein interactomes identify the role of plakophilin 2 in virus restriction. Nat. Commun. 2017; (8): 13876.
56. de Chassey B., Aublin-Gex A., Ruggieri A., Meyniel-Schicklin L., Pradezynski F., Davoust N., et al. The Interactomes of Influenza Virus NS1 and NS2 Proteins Identify New Host Factors and Provide Insights for ADAR1 Playing a Supportive Role in Virus Replication. PLoS Pathog. 2013. (9): e1003440.
57. Shapira S.D., Gat-Viks I., Shum B.O.V., Dricot A., de Grace M.M., et al. A Physical and Regulatory Map of Host-Influenza Interactions Reveals Pathways in H1N1 Infection. Cell. 2009; 139: 1255—67.
58. Ayllon J., García-Sastre A. The ns1 protein: A multitasking virulence factor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2015; 386: 73—107.
59. Calderone A., Licata L., Cesareni G. VirusMentha: A new resource for virus-host protein interactions. Nucleic Acids Res. 2015; 43: D588—92.
60. Marc D., Barbachou S., Soubieux D. The RNA-binding domain of influenzavirus non-structural protein-1 cooperatively binds to virus-specific RNA sequences in a structure-dependent manner. Nucleic Acids Res. 2013; 41: 434—49.
61. Cheng A., Wong S.M., Yuan Y.A. Structural basis for dsRNA recognition by NS1 protein of influenza A virus. Cell Res. 2009; 19: 187—95.
62. Yin C., Khan J.A., Swapna G.V.T., Ertekin A., Krug R.M., Tong L., et al. Conserved surface features form the double-stranded RNA binding site of non-structural protein 1 (NS1) from influenza A and B viruses. J. Biol. Chem. 2007; 282: 20584—92.
63. Melén K., Kinnunen L., Fagerlund R., Ikonen N., Twu K.Y., Krug R.M., et al. Nuclear and nucleolar targeting of influenza A virus NS1 protein: striking differences between different virus subtypes. J. Virol. 2007; 81: 5995—6006.
64. Liu J., Lynch P.A., Chien C.Y., Montelione G.T., Krug R.M., Berman H.M. Crystal structure of the unique RNA-binding domain of the influenza virus NS1 protein. Nat. Struct. Biol. 1997; (4): 896—9.
65. Wang W., Riedel K., Lynch P., Chien C.Y., Montelione G.T., Krug R.M. RNA binding by the novel helical domain of the influenza virus NS1 protein requires its dimer structure and a small number of specific basic amino acids. RNA. 1999; 5: 195—205.
66. Long J.X., Peng D.X., Liu Y.L., Wu Y.T., Liu X.F. Virulence of H5N1 avian influenza virus enhanced by a 15-nucleotide deletion in the viral nonstructural gene. Virus Genes. 2008; 36: 471—8.
67. Zhou H., Zhu J., Tu J., Zou W., Hu Y., Yu Z., et al. Effect on virulence and pathogenicity of H5N1 influenza A virus through truncations of NS1 eIF4GI binding domain. J. Infect. Dis. 2010; 202: 1338—46.
68. Gallacher M., Brown S.G., Hale B.G., Fearns R., Olver R E., Randall R.E., et al. Cation currents in human airway epithelial cells induced by infection with influenza A virus. J. Physiol. 2009; 587: 3159—73.
69. Hale B.G., Jackson D., Chen Y.-H., Lamb R.A., Randall R.E. Influenza A virus NS1 protein binds p85beta and activates phosphati-dylinositol-3-kinase signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103:14194—9.
70. Hale B.G., Kerry P.S., Jackson D., Precious B.L., Gray A., Killip
reviews
M.J., et al. E., and Russell R.J. Structural insights into phosphoinosit-ide 3-kinase activation by the influenza A virus NS1 protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107: 1954—9.
71. Gack M.U., Albrecht R.A., Urano T., Inn K.-S., Huang I.-C., Carnero E., et al. Influenza A virus NS1 targets the ubiquitin ligase TRIM25 to evade recognition by the host viral RNA sensor RIG-I. Cell Host Microbe. 2009; (5): 439—49.
72. Spesock A., Malur M., Hossain M.J., Chen L.-M., Njaa B.L., Davis C.T., et al. The virulence of 1997 H5N1 influenza viruses in the mouse model is increased by correcting a defect in their NS1 proteins. J. Virol. 2011; 85: 7048—58.
73. Kuo R.-L., Krug R.M. Influenza a virus polymerase is an integral component of the CPSF30-NS1A protein complex in infected cells. J. Virol. 2009; 83: 1611—6.
74. Kochs G., García-Sastre A., Martínez-Sobrido L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 2007; 81: 7011—21.
75. Das K., Ma L.-C., Xiao R., Radvansky B., Aramini J., Zhao L., et al. Structural basis for suppression of a host antiviral response by influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 13093—8.
76. Hale B.G., Steel J., Medina R.A., Manicassamy B., Ye J., Hickman D., et al. Inefficient control of host gene expression by the 2009 pandemic H1N1 influenza A virus NS1 protein. J. Virol. 2010; 84: 6909—22.
77. Noah D.L., Twu K.Y., Krug R.M. Cellular antiviral responses against influenza A virus are countered at the posttranscriptional level by the viral NS1A protein via its binding to a cellular proteinrequired for the 3' end processing of cellular pre-mRNAS. Virology. 2003; 307: 386—95.
78. Twu K.Y., Kuo R.-L., Marklund J., Krug R.M. The H5N1 influenza virus NS genes selected after 1998 enhance virus replication in mammalian cells. J. Virol. 2007; 81: 8112—21.
79. Min J.-Y., Li S., Sen G.C., Krug R.M. A site on the influenza A virus NS1 protein mediates both inhibition of PKR activation and temporal regulation of viral RNA synthesis. Virology. 2007; 363: 236—43.
80. Narasaraju T., Sim M.K., Ng H.H., Phoon M.C., Shanker N., Lal S.K., et al. Adaptation of human influenza H3N2 virus in a mouse pneumonitis model: insights into viral virulence, tissue tropism and host pathogenesis. Microbes Infect. 2009; (11): 2—11.
81. Hale B.G., Barclay W.S., Randall R.E., Russell R.J. Structure of an avian influenza A virus NS1 protein effector domain. Virology. 2008; 378: 1—5.
82. Imai H., Shinya K., Takano R., Kiso M., Muramoto Y., Sakabe S., et al. The HA and NS genes of human H5N1 influenza A virus contribute to high virulence in ferrets. PLoS Pathog. 2010; (6): e1001106.
83. Heikkinen L.S., Kazlauskas A., Melén K., Wagner R., Ziegler T., Julkunen I., et al. Avian and 1918 Spanish influenza a virus NS1 proteins bind to Crk/CrkL Src homology 3 domains to activate host cell signaling. J. Biol. Chem. 2008; 283: 5719—27.
84. Hale B.G., Knebel A., Botting C.H., Galloway C.S., Precious B.L., Jackson D., et al. CDK/ERK-mediated phosphorylation of the human influenza A virus NS1 protein at threonine-215. Virology. 2009; 383: 6—11.
85. Li Y., Chen Z.Y., Wang W., Baker C.C., Krug R.M. The 3'-end-pro-cessing factor CPSF is required for the splicing of single-intron pre-mRNAs in vivo. RNA. 2001; (7): 920—31.
86. Chen Z., Li Y., Krug R.M. Influenza A virus NS1 protein targets poly(A)-binding protein II of the cellular 3'-end processing machinery. EMBO J. 1999; (18): 2273—83.
87. Zielecki F., Semmler I., Kalthoff D., Voss D., Mauel S., Gruber A.D., et al. Virulence determinants of avian H5N1 influenza A virus in mammalian and avian hosts: role of the C-terminal ESEV motif in the viral NS1 protein. J. Virol. 2010; (84): 10708—18.
88. Soubies S.M., Volmer C., Croville G., Loupias J., Peralta B., Costes P., et al. Species-specific contribution of the four C-terminal amino acids of influenza A virus NS1 protein to virulence. J. Virol. 2010; (84): 6733—47.
89. Liu H., Golebiewski L., Dow E.C., Krug R.M., Javier R.T., Rice A.P. The ESEV PDZ-binding motif of the avian influenza A virus NS1 protein protects infected cells from apoptosis by directly targeting Scribble. J. Virol. 2010; 84: 11164—74.
90. Obenauer J.C., Denson J., Mehta P.K., Su X., Mukatira S., Finkel-stein D.B., et al. Large-scale sequence analysis of avian influenza isolates. Science. 2006; 311: 1576—80.
91. Engel D.A. The influenza virus NS1 protein as a therapeutic target. Antiviral Res. 2013; 99: 409—16.
92. Chien C., Xu Y., Xiao R., Aramini J.M., Sahasrabudhe P.V, Krug R.M., et al. Biophysical characterization of the complex between double-stranded RNA and the N-terminal domain of the NS1 protein from influenza A virus: evidence for a novel RNA-binding mode. Biochemistry. 2004; 43: 1950—62.
93. Jiao P., Tian G., Li Y., Deng G., Jiang Y., Liu C., et al. A single-amino-acid substitution in the NS1 protein changes the pathogenicity of H5N1 avian influenza viruses in mice. J. Virol. 2008; 82: 1146—54.
94. Aragón T., de la Luna S., Novoa I., Carrasco L., Ortín J., Nieto A. Eukaryotic translation initiation factor 4GI is a cellular target for NS1 protein, a translational activator of influenza virus. Mol. Cell. Biol. 2000; (20): 6259—68.
95. Plant E.P., IlyushinaN.A., Sheikh F., Donnelly R.P., Ye Z. Influenza Virus NS1 Protein Mutations at Position 171 Impact Innate Interferon Responses by Respiratory Epithelial Cells. Virus Res. 2017; 240: 81—6.
96. Han X., Li Z., Chen H., Wang H., Mei L., Wu S., et al. Influenza virus A/Beijing/501/2009(H1N1) NS1 interacts with ß-tubulin and induces disruption of the microtubule network and apoptosis on A549 cells. PLoS One. 2012; (7): e48340.
97. Murayama R., Harada Y., Shibata T., Kuroda K., Hayakawa S., Shi-mizu K., et al. Influenza A virus non-structural protein 1 (NS1) interacts with cellular multifunctional protein nucleolin during infection. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 362: 880—5.
98. Melén K., Tynell J., Fagerlund R., Roussel P., Hernandez-Verdun D., Julkunen I. Influenza A H3N2 subtype virus NS1 protein targets into the nucleus and binds primarily via its C-terminal NLS2/NoLS to nucleolin and fibrillarin. Virol. J. 2012; (9): 167.
99. Kumar M., Liu H., Rice A.P., Nourry C., Grant S., Borg J., et al. Regulation of Interferon-ß by MAGI-1 and Its Interaction with Influenza A Virus NS1 Protein with ESEV PBM. PLoS One. 2012; (7): e41251.
100. Yu J., Li X., Wang Y., Li B., Li H., Li Y., et al. PDlim2 selectively interacts with the PDZ binding motif of highly pathogenic avian H5N1 influenza a virus NS1. PLoS One. 2011; (6): e19511.
101. Zhao L., Xu L., Zhou X., Zhu Q., Yang Z., Zhang C., et al. Interaction of influenza virus NS1 protein with growth arrest-specific protein 8. Virol. J. 2009; (6): 218.
Поступила 18.08.17 Принята в печать 25.08.17
