CC BY
34
© Кайдашев И. П., Шликова О. А., 1змайлова О. В. УДК {577.21+615] : 616-071
ЭВОЛЮЦИОНИРОВАНИЕ И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (ЧАСТЬ II)
Кайдашев И. П., Шликова О. А, 1змайлова О. В.
ВГУЗ Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия», г. Полтава
Фармакогенетика в першу чергу мае справу з терапевтичними ефектами I несприятливими наслгдками дИ л1-карських препаратгв, отрут та тших вид1в хгмгчних I екологгчних факторгв. Однак, незабаром тсля виникнен-ня фармакогенетики, ця сфера була розширена: докладно вивченг генетичнг полгморфгзми, I не т1льки щодо в1-домих перерахованих дт, але I як фактори сприйнятливост1 до хвороб вцглому. У багатьох 1з цих дослгджень причини початку розвитку хвороби були невгдомг. Паралельно з функцюнальною природою гетв у фармакоге-нетичних дослгдженнях розглядаються поряд з факторами метаболгзму ферментгв I багато тших, такI як фактори транспортування, вгдновлення ДНК, регулювання клтинного циклу I передачI сигналу. Загальне число публЫацт, що вивчають зв'язок полгморфгзмгв з ризиком розвитку захворювань, перевищуе в кшька разгв т1, як1 вивчають полгморфгзми у зв'язку з в1дпов1ддю на л1карськ1 препарати. Ц дослгдження проаналгзованг, систе-матизоват з метою пгдвищення ефективностг майбуттх стратегт у фармакогенетиц11 дослгдженнях гено-м1ки, зосереджено увагу на 1дентиф1каци генотитв, як призводять до розвитку певних мультифакторних I полггенних захворювань.
Ключовi слова: фармакогенетика, полiморфiзм геыв, клУчна фармаколопя
Фармакогенетика в первую очередь имеет дело с терапевтическими эффектами и неблагоприятными последствиями действия лекарствнных препаратов, ядов и других видов химических и экологических факторов. Однако, вскоре после того, как фармакогенетика возникла, эта сфера была расширена: обстоятельно изучены генетические полиморфизмы, и не только относительно известных перечисленных воздействий, но и как факторы восприимчивости к болезням в целом. Во многих из этих исследований причины начала развития болезни были неизвестны. Параллельно с функциональной природой генов в фармакогенетических исследованиях рассматриваются наряду с факторами метаболизма ферментов и многие другие, такие как факторы транспортировки, восстановления ДНК, регулирования клеточного цикла и передачи сигнала [1]. Общее число публикаций, изучающих связь фармакогенетики полиморфизмов с риском развития заболеваний, превышает в несколько раз те, которые изучают полиморфизмы в связи с ответом на лекарственные препараты, и поэтому в данном обзоре не возможно дать значимых сведений по исследованиям сотен генов-кандидатов факторов восприимчивости к болезни. Тем не менее, было бы интересно проанализировать, систематизировать эти исследования с целью повышения эффективности будущих стратегий в фармакогенетике и исследованиях геномики. Кроме того, почти все недавние обще-
системные скрининги генома не сосредотачивали внимание на поиске ответа организма на действие лекарственных препаратов, а на идентификации генотипов, которые предрасполагают к развитию определенных мультифакторных и полигенных заболеваний.
Химическая токсикология и канцерогенез
Реакция организма на чужеродное соединение может привести к возникновению биологически и химически активных веществ или неактивных соединений и, следовательно, набор токсикогенных и деток-сикационных генов отдельного человека может определять риск развития заболевания. Ферменты, имеющие различные варианты в кодировании белка такие, как ацетилтрансфераза, глутатион-Э-транс-фераза М1 и Т1, параоксоназа, миелопероксидаза, могут приводить к широкому спектру действия: от полного отсутствия активности до очень высокой активности в зависимости от наличия ферментов и индивидуальных генотипов. Поэтому очевидно, что такие генетические варианты могут играть определенную роль в химическом канцерогенезе, в химически индуцированных нейродегенеративных заболеваниях или химически индуцированном повреждении эндотелия и атеросклерозе. Следующие два примера, СУР206 и GSTM1, могут служить иллюстрацией некоторых общих моментов и проблем, которые также показаны на рисунке 1.
Рисунок 1. Различия между фармакогеномикой исследований восприимчивости к заболеваниям (верхняя часть), и ответа на
лекарственные препараты (нижняя часть).
В патогенезе заболеваний, в основном несколько
внутренних факторов (указанны знаки вопроса, так как эти внешние факторы, в основном, не достаточно задокументированы) взаимодействуют в различных временных точках с одним геном или с несколькими генами. С другой стороны, исследования воздействий лекарственной терапии (например, тип и доза лекарства, подбор оптимальных плазменных концентраций препаратов в зависимости от различий фармакокине-тических и фармакодинамических вариантов). В теории, это должно облегчить идентификацию генов, модулирующих ответ на лекарственные препараты, чем поиск и идентификация генов, ответственных за развитие болезни. ADR - Adverse drug reaction - Неблагоприятные реакции на препараты.
Вскоре после открытия полиморфизма CYP2D6, ученые начали исследования генетических полиморфизмов как фактора риска развития рака легкого. Мотивацию этого исследования можно понять: существуют большие индивидуальные различия в восприимчивости к раку легких, а также ученые в те времена знали, что все ферменты цитохрома P450 могут быть биоактиваторами прокарциногенеза. Более того, результаты одного из этих исследований показали, что носители генов, определяющих быстрый метаболизм имеют существенно повышенный риск [2]. Тем не менее, в настоящее время существуют сомнения в том, что CYP2D6 играет значительную роль в развитии рака легких. Есть некоторые мнения о канцерогенных веществах, которые могли бы быть биоактиваторами CYP2D6, но нет никаких доказательств того, что они являются критическими в развитии рака легких. В настоящее время хотелось бы увидеть большее число исследований, доказывающих влияние CYP2D6 на рак легких [3].
Глутатион S-трансфераза М1 является ферментом II фазы, участвующим в детоксикации ряда полициклических ароматических углеводородов. Около 50% белого населения имеют полное отсутствие
фермента вследствие большой геномной делеции [4]. Это явилось основанием для изучения этого фермента в связи с риском заболевания раком легких, а в некоторых исследованиях действительно описан повышенный риск у людей, имеющих недостаток фермента, но такие эффекты не были подтверждены в достаточно мощных мета-анализах [5]. Кроме того, первоначальный анализ генома на наличие факторов риска развития рака легких не выявили, как фактор риска, недостаток фермента детоксикации [6]. Изучение большого числа вариаций генома Подавляющее число унаследованных вариантов в геноме человека только в последнее время стало очевидным после почти полного исследования последовательности ДНК генома человека. Можно предполагать [7], что в самое ближайшее время геном будет полностью секвенирован у ряда человеческих особей и это даст более четкое понимание различий между индивидуальными изменениями в человеческом геноме. В настоящее время в человеческом геноме были выявлены около 12 миллионов однонук-леотидных полиморфизмов (SNPs) [8-10], кроме того, существует более 100000 вставок и делеций. Охарактеризован также большой класс генетических вариантов обусловленных переменным числом тандемных повторов полиморфизмов (VNTR) (табл. 1). Они включают переменное количество динуклеотидных повторов, таких как, например, различное количество ТА в TATA боксе в основном промоторе билирубина глюкуронилтрансферазы UGT1A1, и больше единиц повторов, как, например, 16 аминокислотных (48 bp) повторов в рецепторе допамина D4 [11]. Лишь недавно было показано, что существует, по крайней мере 1500 крупных геномных сегментов с переменным числом тандемных повторов. Общее число унаследованных эпигенетических вариаций может быть даже больше 20% всех генов, дифференциально метилированных в промоторных регионах или в регионах кодирования [8-10].
Таблица 1
Тип и количество межиндивидуальной изменчивости в геноме человека
Генетические изменения/варианты Абревиатура Описание Частота в геноме человека
Однонуклеотидный полиморфизм SNP Обычно два различных нуклеотида (биаллельный SNP) в определенном положении, реже может встречатся триаллельный вариант 12,000,000
Делеция/Инверсия InDel Удаления (или вставки, в зависимости от частоты аллеля) в размере от 1 до 1000 нуклеотидов. Чаще проявляются делеции одного или трех пар оснований > 1,000,000a
Изменение числа тандемных повторов VNTR Микросателлитные полиморфизмы, так называемые краткие тандемные повторы (STR), обычно тандемные повторы из двух, трех или четырех нуклеотидов, но также повторяющиеся до 10 нуклеотидов могут быть идентифицированы в этой группе > 500,000a
Минисателлитные это VNTR полиморфизмы у которых 10-100 нуклеотидов повторяются в переменном количестве. Повторяющиеся сегменты часто не имеют абсолютно идентичных последовательностей.
VNTRs с большими единицами повторов (100-1000 Ьр) называются сателлитами
Изменение числа копий CNV Наследуемые удаления или увеличения ДНК сегментов длиной > 1500 локусов, ох-
Генетические изменения/варианты Абревиатура Описание Частота в геноме человека
более чем 1 кЬ. В настоящее время известно около 1500 CNV распостраненных в хромосомах, что составляет 12% от длины всего генома. ватывающих 12% генома
Главный вопрос, возникающий после определения этих массовых геномных и эпигеномных вариаций заключается в том, чтобы определить биологическую и медицинскую значимость таких геномных изменений (рис. 2). Полиморфизмы, влияющие на экспрессию генов, могут находиться где угодно - как непосредственно в основном промоторе, так и через несколько сотен или несколько десятков тысяч оснований (в 5' направлении, или даже в 3' направлении в интроне и нетранслируемых областях (иТРБ) этого гена). Учитывая, что первичные транскрипты представляют собой весь регион между транскрипционным стартом и 3' концом транскрипта, все полиморфизмы в этом сегменте могут повлиять на сплайсинг. Интересно, что более чем половина всех генов имеют несколько транскрипционных стартовых точек. Расположение точек начала транскрипции зависит от вида ткани, где экспрессируется ген [12]. Полиморфизмы в кодируемом регионе могут быть несинонимическими - т.е. приводить к замене аминокислот в белковой последовательности, или они могут быть синонимическими. Синонимические полиморфизмы, тем не менее, могут отражаться на функциональных свойствах клетки, вследствии изменения стабильности мРНК или нарушения транскрипции белка, так как тРНК для различных синонимических кодонов присутствует в клетках с неравной частотой. Использование таких различных кодонов может не только привести к различиям в эффективности трансляции, но, основываясь на приведенном примере функциональных полиморфизмов в Р-гликопротеине, такие полиморфизмы могут даже привести к возникновению различий в структуре белка [13].
Изменчивость наблюдаемая в числе копий: CYP2A6, CYP2D6, GSTM1, GSTT1 и 1500 других подобных участков.
Делеции или дубликации больших фрагментов генома размером от 1 кб до более чем 100 кб традиционно считались специфическими для нестабильных опухолевых геномов и исключительно редкими для генома здоровых незлокачественных клеток. Современные исследования целостного генома (genome-wide analyses) с использованием SNP-микрочипов и сравнительного гибридизационного анализа, которые показали наличие более 1400 делеций или удвоений, охватывающих 12% последовательности генома "здорового" человека [10, 14-19], заставили пересмотреть традиционные взгляды. Этот класс генетических полиморфизмов, называется изменчивостью числа копий (CNV), и представляет собой стабильные генетические вариации, которые подчиняються Менделевскому распределению как SNP, InDel или VNTR полиморфизмы. Собственно, такие CNV полиморфизмы не настолько новы в фармакогенетике. Большие делеции CYP2A6 и глутатион-S трансфера-зы (GSTs) M1 и T1 [4, 20]. Последние результаты, свидетельствуют о том, что такие частые геномные вариации - (1500 CNV полиморфизмов) имеют такое же большое влияние на предрасположенность к болезни или на эффект лекарственных препаратов, как и 12 млн. однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs). Для системного исследования этих видов генных вариаций сегодня необходимо разработать точные и доступные аналитические методики, так как существующие 500-k или 1000-k микрочиповые методы и количественные ПЦР методы, специфичные только для одного локуса, например для CYP2D6 или GSTs [21, 22], по-прежнему имеют ряд ограничений.
н—■—■ I I I
1 1 1 1 1 ■ 1 1 1 ■ 1 1 1 •
Функциональное расположение: 11 ропотор регул)ггорных элементов Несинонимический кодом Синонимический колон НН1рОН Нетранслируемая область (иТЮ
Функциональный (ффекгт Транс крипанионная рефляция экспрессии генов Белковая активное! ь. стабильность, взаимодействие Стабильность мРИК Сплайсинг РНК Эффективность транскрипции РНК сплайсинг мРНК устойчивость эффективность трансляции (напр.. связывание мнРНК)
Аналитические методы 11редставляк>-ЩИЙ генный анализ. КМЯА, ЧЙТ-РС К, СЫР, дисбаланс экспрессии аллелей 1 етерологичная экспрессия, кинетика фермента, ВесТерн Влоттннг, дрожжевые ли гибридные системы Анализ стабильности мРНК, КТ-РСЯ. захват экзона, двойной-представляю-шийсплайсинг КТ-РСИ захват экзона, двойной-представляю-щкй сплайсинг Анализ стабильности мРНК Вестерн Блоттинг
Рисунок 2. Несколько возможных функциональных эффектов генетических полиморфизмов (однонуклеотидный полиморфизм (SNP), небольшие инверсии-делеции InDels, различное число тандемных повторов VNTRs), в зависимости от
их локализации в геноме.
Фармакогеномика по ту сторону геномной зародышевой линии наследования
Приобретенные генные вариации
Дополнительные сложности для фармакогенети-ческих исследований возникают вследствии хромосомных аберраций и изменения числа хромосом (анеуплоидии) в опухолевых клетках. Неозлокачеств-ленные клетки, например, клетки периферической крови, которые обычно используются для изучения геномной ДНК в фармакогенетическом анализе, обладают диплоидным геномом. В опухолевых же клетках, часто наблюдается анеуплоидия и различные хромосомные аберрации. Эти нарушения затрудняют прогнозирование фенотипов при обычных процедурах генотипирования, которые не используют ДНК из самой опухоли. Было показано, что в лейкемических клетках с дополнительной хромосомой, содержащей не мутировавший (дикий тип) аллеля гена ТРМТ, наблюдалось существенно сниженное накопление тио-гуанин нуклеотидов и метотрексат полиглютамата [23]. Тем не менее генотип ТРМТ, определенный в здоровых неозлокачествленных клетках, ассоциировался с ответом на меркаптопурин в начальных курсах лечения [24].
Влияние генетических и эпигенетических факторов
Исследователям и врачам, занимающимся фар-макогенетикой и геномикой известно и многократно преподавалось следующее: анализ наследственных генетических вариаций имеет большое преимущество, потому что анализ генома одной клетки организма дает достоверную информацию о всех других клетках независимо от возраста, тканевой локализации или экологических факторов. Однако существуют соматические мутации клеток, а также тканеспецифические эпигенетические эффекты, такие как, метилирование ДНК, модификация гистонами или экспрессией микро-
РНК, которые значительно и постоянно могут изменять модель экспрессии гена в клетке. Такие изменения могут существенно изменить эффективность действия лекарственных препаратов или инициировать неблагоприятные последствия и, следовательно, они должны учитываться в клинической фармакологии [25]. Таким образом, перспективным направлением фармакогенетики станут научные исследования в области эпигеномики и малых регуляторных РНК. Уже сегодня получены первые результаты возможной химиотерапии рака с помощью микро РНК.
Примеры эпигеномных изменений: DPD и MGMT
Экспрессия генов, кодирующих дигидропиримидин дегидрогеназу (DPD), является хорошим маркером диагностики DPD дефицита и возможной токсичности 5-фторурацила. С помощью унаследованных генетических полиморфизмов можно объяснить лишь около одной трети случаев недостаточности фермента DPD и токсичности 5-фторурацила [26, 27], но на метилирование в DPYD промоторе может приходиться значительная часть пока еще необъясненной DPD низкой активности как в опухоли, так и здоровой ткани, которая имеет столь важное значение для неблагоприятного исхода в ответ на лекарственные препараты [28-31]. Другим примером является опухоль-специфическое гиперметилирование в MGMT. MGMT является ДНК-репарирующим ферментом и его инактивация в результате изменений в структуре его метилирования может привести к увеличению чувствительности опухоли к алкилирующим препаратам, таким, как циклофосфамид или кармустин [32].
РНК интерференция, малые интерферирующие РНК и микро РНК
Явление интерференции РНК (RNAi), регулирующей экспрессию генов, было впервые описано у нематод Caenorhabditis elegans [33]. У позвоночных животных и человека, малые, 19 - 22 нуклеотидов дли-
ной, молекулы микро-РНК присутствуют почти во всех клетках. Они генетически закодированны и регулируют экспрессию специфических последовательностей генов путем угнетения трансляции и деградации мРНК участвуя в нормальном развитии и регуляции клеток, а также в онкогенезе [34, 35]. Было установлено, что однонуклеотидный полиморфизм в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) AGTR1 гена (rs5186), влияет на распознавание этого участка микро РНК-155 и изменяет угнетающее действие микро РНК [36]. Эти данные показывают, что генетические различия не только в кодирующих регионах промотерах и участках сплайсинга интронов генов, но и в их 3'-UTR могут иметь функциональное значение для регуляции с помощью микро-РНК. Кроме того, 14 областей человеческого генома с вариациями числа копий CNV вмещает 21 из известных микро РНК человека, что может приводить к делеции всех этих микро РНК [18]. Однако, пока несуществует данных о фенотипических изменениях у носителей этих CNVs.
Искусственные двуспиральные молекулы РНК, длиной 21 -22 п.о. называемые малыми интерферирующими РНК (миРНК), сегодня могут применяться для экспериментального выключения экспрессии гена [37]. Интерференция РНК представляет общий интерес в качестве инструмента для анализа генных функций. МиРНК оказались способны не только заглушить экспрессию гена, но и сделать это аллель-специфическим образом, даже если разница между аллелями составляет одно основание (SNP) [38-39]. Это дает большие возможности терапии направленной на конкретный ген, где болезнетворные аллели могут быть специально ориентированны на миРНК. При этом миРНК может быть специфично направлена на аллель, содержащий болезнетворный ген , что позволяет решить ряд практических проблем [40].
Молекулярные маркеры, определяющие лекарственную терапию
Терапия, определяемая использованием молекулярных маркеров, становится все более и более рас-постраненной в медицинской практике. Состояние экспрессии HER2/neu и рецепторов к эстрогенам при раке молочной железы определяет терапию вещест-
вами, которые нацелены на HER2 или рецепторы эстрогена (ER), а именно трастузумаб (Herzeptin) и та-моксифен. Для анализа Her2 рекомендуется применять иммуногистохимические тесты (для определения самого белка) или прямое обнаружение экспрессии гена HER2 с помощью флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) [41,42]. В случае HER2, может применяться количественная ПЦР как для выявления HER2 амплификации на уровне хромосом, так и транскрипции HER2 в крови. Результаты этого метода хорошо совпадают с данными иммуногистохимического анализа и in situ гибридизации, но метод пока еще не получил широкого диагностического применения [43-47].
Однако, на сегодняшний день геномный анализ не всегда может быть полноценно применим. По современным данным нет количественного метода, подобного ПЦР в реальном времени, который мог бы быть клинически рекомендован для определения уровней мРНК ESR1 (ген, кодирующий а эстрогеновый рецептор) или HER2 или чтобы оценить события амплификации гена на уровне геномной ДНК. В случае эстро-генового рецептора причина заключается в том, что уровень концентрации рецептора на опухолевых клетках (собственно статус эстрогеновой чувствительности опухоли) определяется не экспрессией мРНК, а стабильностью белка рецептора [48].
Сегодня такой целевой подход получил высокоэффективную технологию на основе микрочипов, которые с большой точностью позволяют одновременно количественно определить мРНК 25000 известных генов человека, а также экспрессию некоторых известных миРНК, и даже определение вариантов сплайсинга. Эти подходы могут служить для дифференциальной диагностики заболеваний, прогностических целей и для предвидения реакций на медикаментозную терапию [49-51].
Технические основы фармакогенетики и геномики
Прогресс и успех клинической фармакологии зависит от надежности биоаналитических методов и понимания их возможностей и ограничений. В данной работе мы сконцентрируем наше внимание на основных технологиях, которые применяются в лабораториях фармакогенетики и геномики (таблицы 2 и 3).
Метод Короткое описание и цель, достигаемая при выполнении
Дидеокси (концевое) секвенирование Чтение последовательностей ДНК, идентификация новых полиморфизмов
Денатурирующая высокоэффективная жидкостная хроматография (ДВЭЖХ) Вариантные и дикие формы ДНК образуют различные гибридные молекулы (гомодуплексные и гетеродуплексные), которые можно разделить ионпарной обращено фазовой хроматографией, чтобы установить полиморфизм.
PCR-RFLP Геномная область амплифицируется с помощью ПЦР и разрезается ферментами, специфичными к определенным последовательностям (эндонуклеазы рестрикции). Образовавшиеся фрагменты потом анализируются методом электрофореза.
Пиросеквенирование Метод ДНК секвенирования, основанный на синтетическом принципе [134]. Применяется в SNP типировании и анализе метилирования ДНК. Принцип лежащий в основе метода также является базисом современного крупноступенчатого секвенирования ДНК, известного как 454 «следующее поколение» способное обеспечить секвенирование более чем 100 миллионов пар оснований в день.
Одно-основное (праймерное) накопление Короткие нуклеотиды отжигаются так, что их З'-концы прямо направлены к по-
Таблица 2
Важнейшие технологии, применяемые для генотипического анализа в фармакогенетике и геномике
(также известно как мини-секвенирование) лиморфному участку. Элонгация только одного отдельного основания осуществляется путем использования смеси флюоресцентно меченых ddNTP без dNTP. Продукты определяются или секвенированием, или детекционной системой MALDI-TOF. Используется как мультиплексная реакция в генотипирова- нии SNP.
ДНК микрочипы (микроплатформа) ДНК молекулы, связанные с твердой фазой микрочипов для одновременного генотипирования большого числа SNP (до миллиона) в одном образце. Применяется в исследовании больших частей генома.
РНК/кДНК микрочипы (микроплатформы) Применяются в анализе экспрессии генов путем количественной оценки транс- криптов в отдельном образце или при сравнении между двумя образцами. Удобно для определения количества большого числа различных транскриптов (также для больших областей генома) в отдельных образцах.
ПЦР ПЦР является базовой/основной технологией во всех современных фармако-генетических геномных исследованиях.
ПЦР в реальном времени Определение образования продуктов ПЦР во время прохождения ПЦР достигается использованием различных флюоресцентных меток или методов переноса энергии флюоресценции для генотипирования отдельных SNP во множестве образцов.
qRT-PCR (количественная обратно-транскриптазная ПЦР) Применяется для определения количества транскриптов в образце после об-ратнотранскриптазной реакции. Удобно для определения числа РНК в большом количестве образцов.
Статистика, биоинформатики и системная биология
Существуют почти 12 млн. ОНП в человеческом геноме
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/Notes/build127 annou nce.txt).
В самом ближайшем будущем, клиническому фармакологу придется иметь дело не только с клиническими и лабораторными данными о своих добровольцах и больных, но и с данными о 500000 или 1 млн. ОНП у пациентов [52-53]. Биолог, изучающий клетки в лабораторных условиях, будет также иметь дело с таким же количеством вариантов генетических изменений в клетке. И это не только эти 1 или 3 млн. ОНП взятые отдельно, но и взаимодействие многих из них - это явление известно в генетике, как эпистаз - способность образовывать определенные фенотипы. Таким образом, необходимо будет принимать во внимание огромное количество взаимодействующих факторов, что явится предметом транскриптомики, метаболомики и множества других широких подходов. Эти взаимосвязи могут быть довольно сложными -отчасти антагонистическими, частично дополняющими и усиливающими друг друга и они, безусловно, не будут ограничиваться только взаимодействием между двумя генами, а реализовываться интерактивными связями нескольких генов. Число эпигенетических различий будет больше, поскольку существуют мно-
жественные различия между типами тканей, возрастом человека и т.д. Таким образом, развитие биоинформатики и генетической статистики играет решающую роль в дальнейшем развитии фармакогенетики и геномики. Еще существует слишком много вариаций и взаимодействий, которые только еще должны быть экспериментально изучены, поэтому необходимо срочно разработать методы выявления тех изменений, которые являются наиболее биологически значимыми.
Некоторые подходы к идентификации потенциально наиболее важных областей генома уже развиваются и будут развиваться дальше. Начиная с первых межвидовых сравнений гемоглобина, поиск гомо-логий между белковыми последовательностями стал важным инструментом обнаружения таких последовательностей в геноме, которые имеют решающее значение для реализации биологических функций некоторых белков. Связь между разными генетическими вариантами, имеющимися в одной хромосоме, является основным методом генетической статистики. Если человек имеет определенный генетический вариант в определенной позиции, то, вероятно, что он также будет иметь другие варианты, расположенные рядом на расстоянии от 10000 до 50000 п.о. и те же группы можно будет найти у нескольких родственников этого человека (рис. 3).
Рисунок 3. Взаимоотношения между геномными изменениями, изменениями РНК и белковой экспрессии с биологическими и клиническими эффектами. Указаны также несколько - но не все - механизмы регуляции.
Взаимосвязь между различными генетическими вариантами уже учитывалась при проведении ранних исследований, таких как, например, описание генетической изменчивости в цитохроме P450 [54], а также учитывалась при исследовании человеческого генома (www.hapmap.org) [8]. Стало очевидным, что существуют рекомбинации «горячих точек» и гаплотипных блоков, то есть участки жесткой связи. Знание таких связей может существенно облегчить генотипирова-ние, поскольку из всех взаимосвязанных полиморфизмов должен быть проанализирован только один. Можно сосредоточиться на изучении так называемых ОНП, что даст нам знания обо всех вариантах, поскольку все варианты взаимосвязаны между собой. Основываясь на селекции типов вариантов, можно ввести большее количество вариантов в каждом конкретном геноме и тем самым иметь очень высокую плотность генетических маркеров в карте [55-56].
Хотя изменения располагаются в хромосомах в линейной последовательности, известна их организация в так называемые гаплотипные блоки, в которых есть десятки, сотни или даже тысячи вариантов довольно плотных сочетаний. Вне гаплотипных блоков между гаплотипами существует лишь сравнительно редкая связь. Системный анализ продленно-сти специфических линкерных блоков может быть информативным с точки зрения функциональной и эволюционной роли конкретных вариантов и гаплоти-пов. Расширение гомозиготных гаплотипов - указывающая индикация таких вариантов, которые продуцируются эволюционно в последнее время. Таким образом, этот анализ может существенно помочь выявить действительно важные варианты среди более чем 12 млн. Б^б в геноме человека [58-59]. Однако пока нет убедительных перспективных подтверждений этого подхода (табл. 3).
Таблица 3
Биоинформационные базы данных и программное обеспечение для фармакогенетики и геномики
Цель Компьютерные оболочки Вебсайт
Базы данных
Геном человека Национальный центр по информационной биотехнологии в США (NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/
Ensembl www.ensembl.org/Homo sapiens/
Базы данных однонуклео-тидных полиморфизмов (ОНП (вЫР)) Американская (dbSNP at NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
Японская (db JSNP) http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/
Парное неравновесное сцепление и гаплотипы HapMap программа www.hapmap.org
Анализ экспрессии генов Объемная генная экспрессия (GEO) в NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Метаболические пути Киотская энциклопедия генов и генотипов (KEGG) www.genome.jp/kegg/
Программное обеспечение
Изучение гомологий BLAST at NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
Линейное секвенирование и идентификация новых вЫР Gap4 http://staden.sourceforge.net/
Картирование гаплотипа (поэтапное) Fastphase http://stephenslab.uchicago.edu/software.html (существует также программа для подсчета проанализированных in-silico связанных SNP)
Парные неравновесные связи и визуализация блоков гаплотипов Haploview www. broad.mit.ed u/m pg/haploview/
Расширение гаплотипов гомозиготности (ЕНН) Обзор www. broad.mit.ed u/m pg/sweep/
Анализ вЫР полиморфизмов затрагивающих функцию промотера TRANSFAC http://transfac.bioinf.med.uni-goettingen.de/
Анализ вЫР полиморфизмов затрагивающих сайт сплайсинга и ЕвЕБ Автоматические аналитические сплайсинг сайты (Детская больница милосердия Миссури, США) https://splice.cmh.edu/
ESEидентификатор 3.0 (Cold Spring Harbor Laboratory) http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home
Очевидно, что риск развития заболевания и ответ на лекарственные препараты, может зависеть от комбинации нескольких генов, это привело к тому, что в последние годы сделаны попытки коммерциализации использования прогностических маркеров. Прогностические сочетанные маркеры (ПСМ) могут быть определены как выражения взаимодействия в кросс-таблицах, анализе дисперсии и логистическом регрессионном анализе данных. Ситуации, в которых такие рекурсивные разметки должны быть выполнены в сканировании целого генома, еще окончательно не установлены.
Исследование широких геномных ассоциаций Исследование риска заболеваемости Подавляющее большинство выполненных фарма-когенетических исследований, использовали подход -исследования генов кандидатов. Суть подхода заключается в предварительном анализе генов, которые могут быть актуальны в соответствии с биологической целесообразностью. Альтернативный - общегеномный линкерный анализ - еще редко применяется в фармакогенетике. Этот подход был успешно
применен в связи с исследованием семейных карт причинных мутации для многих моногенных болезней, а также наборы из нескольких сотен VNTR маркеров, были достаточными, чтобы определить например локус гена муковисцидоза.
Изучение широких геномных ассоциаций у индивидуумов стали применять совсем недавно, но уже есть основания считать его успешным подходом в выявлении медико-ассоциированных полиморфизмов. Такой подход начал активно развиваться после того, когда стало технически возможным исследование одиночных нуклеотидных полиморфизмов в геноме [60]. Уже в первых широких геномных микрочип-ных зондированиях "всего лишь" 10000 ОНП стали полезны в семейных исследованиях. Сейчас возможно микрочипное зондирование для 500000 или 1000000 ОНП маркеров равномерно распределенных в едином геноме человека. Более экономичный подход заключается в тестирование ОНП гаплотипных блоков, как доказано многими исследованиями (табл. 4).
Таблица 4
Обобщенная информация о некоторых заболеваниях, ассоциированных с генетическими маркерами
Заболевание Размер выборки N случаев/контроль Техника3 Идентифицируемый локус (ген) Определяемый полиморфизм PNSGb Отношение шансов (95% доверительный интервал)с Источник
Коронарная болезнь сердца 1926/2938 A500k 9p21 ГБ1333049 Нет 1.90 (1.61-2.24) [68]
Гипертензия 1952/2938 A500k None [68]
Ревматоид ный артрит PTPN22 ГБ6679677 Да 3.32 (1.93-5.69)
1860/2938 A500k HLA-DRB1 ГБ6457617 Да 5.21 (4.31-6.30) [68]
7q32 ГБ11761231 Нет 1.64 (1.35-1.99)
PTPN22 ГБ6679677 Да 5.19 (3.15-8.55)
Диабет 1 типа HLA-DRB1 ГБ9272346 Да 18.5 (12.7-27.0)
1963/2938 A500k 12q13 ГБ1 1171739 Нет 1.75 (1.48-2.06) [68]
12q24 ГБ1 7696736 Нет 1.94 (1.65-2.29)
PTPN2 ГБ1 2708716 Нет 1.55 (1.27-1.89)
Диабет 2 типа TCF7L2 ГБ4506565 Да 1.88 (1.56-2.27)
1924/2938 A500k CDKAL1 ГБ9465871 Нет 2.17 (1.60-2.95) [68]
FTO ГБ9939609 Нет 1.55 (1.30-1.84)
Желчнокаменная болезнь 2113 /1965е1 A500k ABCG8 ГБ11887534 (Р19Н) Да 7.10 (0.90-158.6) 1671
Инфаркт миокарда 4587/12767е1 IH300k 9p21 ГБ1 0757278 Нет 1.64 (1.47-1.82) [69]
PPARG ГБ1801282 Да 1.20 (1.07-1.33)
SLC30A8 ГБ1 3266634 Да 1.18 (1.09-1.29)
HHEX ГБ1111 875 Да 1.10 (1.01-1.19)
TCF7L2 ГБ7903146 Да 1.34 (1.21-1.49)
Диабет 2376/24321 IH300k KCNJ11 ГБ521 9 Да 1.11 (1.02-1.21) ГЯСП
2 типа IGF2BP2 ГБ4402960 Нет 1.18 (1.08-1.28)
CDKAL1 ГБ7754840 Нет 1.12 (1.03-1.22)
9p21 ГБ1 0811661 Нет 1.20 (1.07-1.36)
Chr11 ГБ9300039 Нет 1.48 (1.28-1.71)
FTO ГБ8050136 Нет 1.11 (1.02-1.20)е
SLC30A8 ГБ1 3266634 Да 1.07 (1.00-1.16)
HHEX ГБ1111 875 Да 1.14 (1.06-1.22)
TCF7L2 ГБ7903146 Да 1.38 (1.31-1.46)
Диабет 6529/72521 A500k KCNJ11 ГБ521 9 Да 1.15 (1.09-1.21) [71]
2 типа PPARG ГБ1801282 Да 1.09 (1.01-1.16)
9p21 ГБ1 0811661 Нет 1.20 (1.12-1.28)
IGF2BP2 ГБ4402960 Нет 1.17 (1.11-1.23)
CDKAL1 ГБ7754840 Нет 1.08 (1.03-1.14)е
Ревматоидный артрит 1522/1850 IH300 IH550 TRAF1 ГБ3761 847 Нет 1.32 (1.23-1.42) е [72]
Эксфолиа-тивная глаукома 290/14672е IH300 LOXL1 гб1 048661 +ГБ38 25942 Нет 27.05 (14.9-49.2) [66]
Продолжение таблицы 4
Заболевание Размер выборки N случаев/контроль Техник Идентифицируемый локус (ген) Определяемый полиморфизм РЫЭОЬ Отношение шансов (95% доверительный интервал)0 Источник
РОРР2 ГБ2981 582 Нет 1.63 (1.52-1.72)
ТШС9 гэ12443620 Нет 1.23 (1.17-1.30)
Рак молочной железы Custom array ТШС9 ГБ8051 542 Нет 1.19 (1.12-1.27)
4398/4316d МАР3К1 ГБ889312 Нет 1.27 (1.19-1.36) [73]
ЬвР1 ГБ3817198 Нет 1.17 (1.08-1.25)
Н19 ГБ21 07425 Нет 0.95 (0.89-1.01)
гб1 3281615 Нет 1.18 (1.10-1.25)
Рак толстой и прямой кишки 7334/5246d IH550 8q24 ГБ6983267 1.47 (1.34-1.62) [74]
Примечаниеаанализ микрочипов;
ь Ранее был известен ген восприимчивости или локус;
сЕсли не указано другое, то ссылаются на шансы относительного риска носителей гомозиготного варианта по сравнению с носителями дикого типа;
6Первоначальный скрининг генома был проведен только с подмножества установленных размеров образцов для окончательного анализа;
еОтношение шансов наличия аллеля по сравнению с его отсутствием (аллельное отношение шансов)
Одним из первых успешных результатов анализа ОНП генома было определение полиморфизма комплементарного фактора Н (CFH) ЫБ402Туг с отношением шансов больше 7 для носителей гомозиготных вариантов [61]. В этом исследовании, включавшем 96 случаев, и 50 контролей, были проанализированы 116,204 ОНП; впоследствии были подтверждены эти результаты в двух других исследованиях, и согласованны с линкерными последовательностями локуса, полученными ранее в семейных исследованиях [6265]. Данные, доказывающие успех ассоциированного исследования генома, были получены при выявления генетического полиморфизма основной части субтипа открытоугольной глаукомы, так называемой эксфолиативной глаукомы [66] и желчекаменной болезни. Согласно этим данным, определение гаплоти-пов из двух не-синонимических вариантов или ОНП увеличивает риск развития заболевания более чем в 30 и 7 раз, соответственно [67]. К сожалению, эти случаи не являются репрезентативными для других многофакторных заболеваний, и вероятность соотношения 7 или 30 для одного гены не типичны, как правило, следует ожидать полигенетические заболевания. Тем не менее, вероятность соотношения между 1.0 и 2.0 прослеживается во многих недавно опубликованных работах по ассоциированным исследованиям генома (табл. 4), но возникает целый ряд вопросов, связанных с причинно-следственной связью, лежащей в основе этих выводов, а также относительно медицинского значения этих результатов.
Некоторые геномные анализы полигенных болезней, приведены в таблице 4 [59, 57, 70, 73, 75, 76]. Было проведено крупнейшее исследование, включающее 14000 пациентов, страдающих от семи болезней и 3000 человек общего контроля [75]. Запланированное исследование имело достаточную мощ-
ность для того, чтобы обнаружить ассоциации с низким коэффициентом отношения шансов, коэффициентом 1.5, и эти исследования обнаружили ряд ранее неизвестных и неожиданных генетических локусов восприимчивости. Наиболее интересным был факт, что некоторые из выявленных локусов восприимчивости являются общими для различных болезней, с указанием общей этиологии [70, 75-77]. Как показано в колонке 2 таблицы 4, наиболее важным приоритетом во многих геномных ассоциативных исследованиях было получение подтверждения сразу множества вопросов, насколько это возможно, видимо, чтобы избежать риска малой мощности исследований. Тем не менее, изучение методов разработки исследований, не менее важны, чем статистические возможности, в плане получения надежных и воспроизводимых данных [78,79].
Кроме того, были учтены некоторые общие вопросы, касающиеся таких типов анализов. Самое главное, разработана стратегия практических стандартов в этих исследованиях [80], которая, являлась уроком, извлеченным из полученных многочисленных данных за 20 лет исследований фармакогенетики и геномной ассоциации заболеваний. Способность к воспроизводимости является важным шагом, оправдывающим дальнейшие поисковые работы, но это не исключает некоторые систематические ошибки. Кроме того, также важны, как ложноположительный данные, так и ложнонегативные, и действительно, число генных вариантов не имеющих связи с различными заболеваниями (табл. 4), может быть довольно большим. Воспроизводимость исследований ген-ассоциированных болезней остается открытым, центральным вопросом. Причиной этого являются нетолько нерешенные вопросы многократного тестирования, но также и комплекс взаимодействий между
различными генами, а также между генами и факторами внешней среды (этническая принадлежность, сезон, место проведения и т. д.).
Важно, отметить, что ряд локусов были выявлены практически во всех исследованиях. Тем не менее, мы не будем рассматривать ассоциированные исследования генома как рецепт гарантированного успеха. В связи с известным феноменом публикационной предвзятости, мы не можем предположить, что все такие геномные исследования, в достаточной степени находятся в открытом доступе. Следует отметить, однако, что было одно отрицательное вспомогательное исследование, приведенное в таблице 4. Автор объяснял отсутствие значимых ассоциаций в исследовании тем, что исследования не были оптимальными для гипертензии, по-прежнему существуют недостатки тестирования вариантов и возможных муль-тифакториальных причин гипертензии, которые пока не могут быть обнаружены применяемыми подходами [68].
Как указано в таблице 4, многие отличия по конкретным заболеваниям, идентифицированые в ассоциативных исследованиях генома, были столь малы, что не имеют значения в лечении отдельных пациентов, но они могут дать новое представление об этих болезнях.
Исследование терапевтического эффекта лекарственных препаратов
Исследование болезней, ассоциациированных с геномом, могут предоставить важные подсказки для дальнейших клинических фармакогенетических исследований, в которых мы захотим определить прогностические геномные маркеры ответа на терапию лекарственными препаратами или их побочные действия. Одна из проблем, возникающая во многих исследованиях лекарственного ответа это способность находить отличия между ответом на применение лекарственного препарата и различными формами естественного течения болезни. Это является особой проблемой при заболеваниях, с циклическим течением (обострение, ремиссия и т.д.).
Перспективы дальнейших исследований
Множество фактов накоплено после более чем 40 лет фармакогенетических и фармакогеномных исследований. Проведены многочисленные масштабные исследования генома в 2007 году и данные этих исследований будут оптимизированы для медицинского применения. Тем не менее фармакогенетические и геномные научные исследования базируются на едином принципе (рис. 4), и существует множество подходов для улучшения возможностей каждого из его этапов. С точки зрения клинической фармакологии, исследования должны начинаться с четко определенных и хорошо спланированных клинических исследований, и, должны заканчиваться усовершенствованием в лечении пациентов.
Рисунок 4. Основной принцип фармакогенетических и
фармакогеномных исследований. Показанные здесь маршруты не могут быть единственными, но они должны показать, как различные подходы могут быть объединены для получения фармакогенетических знаний, являющимися ценными как для развития новой терапии, так и усовершенствования существующей.
Тем не менее, в процессе всего исследования должно применятся множество молекулярных и информационных наук. Наличие постоянной структуры фармакогенетических научных исследований с начала исследований (определения раковых CYP2D6-ассоциаций), и до новых ассоциированных исследований генома заключается в том, что генетические полиморфизмы по всей видимости, связаны с медицинскими фенотипами, но остается неясным, как именно это происходит. Поэтому существует потребность провести различие между теми ассоциациями, которые являются подлинными и ведущими к окончательным результатам, и те, в которых еще необходимо выяснить основные механизмы. Пока это требование не было выполнено.
Для таких целей хорошо подходят иссдедования фармакологии, но с успехом могут также применятся ex vivo исследования с использованием человеческих клеток. Например, было определено, что клеточные линии от генетически неродственных индивидуумов, из различных органов и тканей могут существенно помочь в функциональной проверке ОНП в клинико-генетических исследованиях фенотипических ассоциаций [81]. Лимфобластные и фибробластные клеточные линии из HapMap проекта, в которых уже ге-нотипировали более 4000000 ОНП, в настоящее время в мире используются именно для таких исследований. В отличие от экспериментов с первичной клеткой, эти клетки позволяют проводить повторяющиеся измерения со всеми разными генотипами и в то же время в значительной степени улучшают возможность для межлабораторной проверки. Есть, конечно, ограничения с артефактами, которые могут возникать всвязи с использованием бластных клеточных культур или с иммортализацией. Необходимо вести вне-
дрение других типов клеток. Экстракорпоральные подходы уже значительно изменили клиническую фармакологию. Например, взаимодействия лекарственных препаратов при их употреблении, не могут быть достаточно точно предсказаны в исследованиях лекарственного метаболизма in vitro. Аналогичные подходы разрабатываются в научных исследованиях фармакодинамики, относительно показаний и побочных эффектов лекарственных препаратов [82].
Что касается приоритетов в области научных исследований, определение генетических аберраций на пути трансдукции сигнала могут стать самыми интересными новыми направлениями, при изучении многих типов рака. Тем не менее, до сих пор существует сравнительно мало данных о влиянии полиморфизмов на внутриклеточную трансдукцию сигнальных путей. Основной проблемой сегодня для прогресса всей медико-биологической науки становится введение профессиональной специализации врачей, способной интегрировать подходы геномики, транскриптомики, протеомики, эпигеномики и клинических потребностей [83].
Литература
1. Kalow W, Meyer UA, Tyndale R (2005) Pharmacogenomics, 2nd edn. Taylor & Francis, Oxford.
2. Ayesh R, Idle JR, Ritchie JC, Crothers MJ, Hetzel MR (1984) Metabolic oxidation phenotypes as markers for susceptibility to lung cancer. Nature 312:169-170.
3. Roots I, Drakoulis N, Ploch M, Heinemeyer G, Loddenkemper R, Minks T, Nitz M, Otte F, Koch M (1988) Debrisoquine hydroxylation phenotype, acetylation phenotype, and ABO blood groups as genetic host factors of lung cancer risk. Klin Wochenschr 66[Suppl 11]:87-97.
4. Seidegard J, Vorachek WR, Pero RW, Pearson WR (1988) Hereditary differences in the expression of the human gluta-thione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. Proc Natl Acad Sci USA 85:7293-7297.
5. Benhamou S, Lee WJ, Alexandrie AK, Boffetta P, Bouchardy C, Butkiewicz D, Brockmoller J, Clapper ML, Daly A, Dolzan V, Ford J, Gaspari L, Haugen A, Hirvonen A, Husgafvel-Pursiainen K, Ingelman-Sundberg M, Kalina I, Kihara M, Kremers P, Le Marchand L, London SJ, Nazar-Stewart V, Onon-Kihara M, Rannug A, Romkes M, Ryberg D, Seide-gard J, Shields P, Strange RC, Stucker I, To-Figueras J, Brennan P, Taioli E (2002) Meta- and pooled analyses of the effects of glutathione S-transferase M1 polymorphisms and smoking on lung cancer risk. Carcinogenesis 23:1343-1350.
6. Spinola M, Meyer P, Kammerer S, Falvella FS, Boettger MB, Hoyal CR, Pignatiello C, Fischer R, Roth RB, Pastorino U, Haeussinger K, Nelson MR, Dierkesmann R, Dragani TA, Braun A (2006) Association of the PDCD5 locus with lung cancer risk and prognosis in smokers. J Clin Oncol 24:16721678.
7. Levy S, Sutton G, Ng PC, Feuk L, Halpern AL, Walenz BP, Axelrod N, Huang J, Kirkness EF, Denisov G, Lin Y, Macdonald JR, Pang AW, Shago M, Stockwell TB, Tsiamouri A, Bafna V, Bansal V, Kravitz SA, Busam DA, Beeson KY, McIntosh TC, Remington KA, Abril JF, Gill J, Borman J, Rogers YH, Frazier ME, Scherer SW, Strausberg RL, Venter JC (2007) The diploid genome sequence of an individual human. PLoS Biol 5:e254.
8. The International HapMap Consortium (2005) A haplotype map of the human genome. Nature 437:1299-320.
9. Eckhardt F, Lewin J, Cortese R, Rakyan VK, Attwood J, Burger M, Burton J, Cox TV, Davies R, Down Ta, Haefliger C, Horton R, Howe K, Jackson DK, Kunde J, Koenig C, Lid-dle J, Niblett D, Otto T, Pettett R, Seemann S, Thompson C, West T, Rogers J, Olek A, Berlin K, Beck S (2006) DNA me-thylation profiling of human chromosomes 6, 20 and 22. Nat Genet 38:1378-1385.
10. Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TD, Fiegler H, Shapero MH, Carson AR, Chen W, Cho EK, Dallaire S, Freeman JL, Gonzalez JR, Gratacos M, Huang J, Kalaitzopoulos D, Komura D, MacDonald JR, Marshall CR,
Mei R, Montgomery L, Nishimura K, Okamura K, Shen F, Somerville MJ, Tchinda J, Valsesia A, Woodwark C, Yang F, Zhang J, Zerjal T, Zhang J, Armengol L, Conrad DF, Estivill X, Tyler-Smith C, Carter NP, Aburatani H, Lee C, Jones KW, Scherer SW, Hurles ME (2006) Global variation in copy number in the human genome. Nature 444:444-454.
11. Kaiser R, Konneker M, Henneken M, Dettling M, MullerOerlinghausen B, Roots I, Brockmoller J (2000) Dopamine D4 receptor 48-bp repeat polymorphism: no association with response to antipsychotic treatment, but association with catatonic schizophrenia. Mol Psychiatry 5:418-424.
12. Tzvetkov MV, Meineke C, Oetjen E, Hirsch-Ernst K, Brockmoller J (2007) Tissue-specific alternative promoters of the serotonin receptor gene HTR3B in human brain and intestine. Gene 386:52-62.
13. Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM (2007) A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science 315:525-528.
14. Conrad DF, Andrews TD, Carter NP, Hurles ME, Pritchard JK (2006) A high-resolution survey of deletion polymorphism in the human genome. Nat Genet 38:75-81.
15. Hinds DA, Kloek AP, Jen M, Chen X, Frazer KA (2006) Common deletions and SNPs are in linkage disequilibrium in the human genome. Nat Genet 38:82-85.
16. Khaja R, Zhang J, MacDonald JR, He Y, Joseph-George AM, Wei J, Rafiq MA, Qian C, Shago M, Pantano L, Aburatani H, Jones K, Redon R, Hurles M, Armengol L, Estivill X, Mural RJ, Lee C, Scherer SW, Feuk L (2006) Genome assembly comparison identifies structural variants in the human genome. Nat Genet 38:1413-1418.
17. McCarroll SA, Hadnott TN, Perry GH, Sabeti PC, Zody MC, Barrett JC, Dallaire S, Gabriel SB, Lee C, Daly MJ, Altshuler DM (2006) Common deletion polymorphisms in the human genome. Nat Genet 38:86-92.
18. Wong KK, deLeeuw RJ, Dosanjh NS, Kimm LR, Cheng Z, Horsman DE, MacAulay C, Ng RT, Brown CJ, Eichler EE, Lam WL (2007) A comprehensive analysis of common copy-number variations in the human genome. Am J Hum Genet 80:91-104.
19. Beckmann JS, Estivill X, Antonarakis SE (2007) Copy number variants and genetic traits: closer to the resolution of phenotypic to genotypic variability. Nat Rev Genet 8:639646.
20. Pemble S, Schroeder KR, Spencer SR, Meyer DJ, Hallier E, Bolt HM, Ketterer B, Taylor JB (1994) Human glutathione S-transferase theta (GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic polymorphism. Biochem J 300:271-276.
21. Schaeffeler E, Schwab M, Eichelbaum M, Zanger UM (2003) CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR. Hum Mutat 22:476-485.
22. Sprenger R, Schlagenhaufer R, Kerb R, Bruhn C, Brockmoller J, Roots I, Brinkmann U (2000) Characterization of the glutathione S-transferase GSTT1 deletion: discrimination of all genotypes by polymerase chain reaction indicates a tri-modular genotype-phenotype correlation. Pharmacogenetics 10:557-565.
23. Cheng Q, Yang W, Raimondi SC, Pui CH, Relling MV, Evans WE (2005) Karyotypic abnormalities create discordance of germline genotype and cancer cell phenotypes. Nat Genet 37:878-882.
24. Stanulla M, Schaeffeler E, Flohr T, Cario G, Schrauder A, Zimmermann M, Welte K, Ludwig WD, Bartram CR, Zanger UM, Eichelbaum M, Schrappe M, Schwab M (2005) Thiopu-rine methyltransferase (TPMT) genotype and early treatment response to mercaptopurine in childhood acute lymphoblastic leukemia. JAMA 293:1485-1489.
25. Dolinoy DC (2007) Epigenetic gene regulation: early environmental exposures. Pharmacogenomics 8:5-10.
26. Collie-Duguid ES, Etienne MC, Milano G, McLeod HL (2000) Known variant DPYD alleles do not explain DPD deficiency in cancer patients. Pharmacogenetics 10:217-223.
27. van Kuilenburg AB, Muller EW, Haasjes J, Meinsma R, Zoe-tekouw L, Waterham HR, Baas F, Richel Dj, van Gennip AH (2001) Lethal outcome of a patient with a complete dihydro-pyrimidine dehydrogenase (DPD) deficiency after administration of 5-fluorouracil: frequency of the common IVS14+1G>A mutation causing DPD deficiency. Clin Cancer Res 7:1149-1153.
28. Ezzeldin HH, Lee AM, Mattison LK, Diasio RB (2005) Methy-lation of the DPYD promoter: an alternative mechanism for dihydropyrimidine dehydrogenase deficiency in cancer patients. Clin Cancer Res 11:8699-8705.
29. Noguchi T, Tanimoto K, Shimokuni T, Ukon K, Tsujimoto H, Fukushima M, Noguchi T, Kawahara K, Hiyama K, Nishiya-ma M (2004) Aberrant methylation of DPYD promoter, DPYD expression, and cellular sensitivity to 5-fluorouracil in cancer cells. Clin Cancer Res 10:7100-7107.
30. Yu J, Shannon WD, Watson MA, McLeod HL (2005) Gene expression profiling of the irinotecan pathway in colorectal cancer. Clin Cancer Res 11:2053-2062.
31. Zhang X, Soong R, Wang K, Li L, Davie JR, Guarcello V, Diasio RB (2007) Suppression of DPYD expression in RKO cells via DNA methylation in the regulatory region of the DPYD promoter: a potentially important epigenetic mechanism regulating DPYD expression. Biochem Cell Biol 85:337346.
32. Esteller M, Garcia-Foncillas J, Andion E, Goodman SN, Hidalgo OF, Vanaclocha V, Baylin SB, Herman JG (2000) In-activation of the DNA-repair gene MGMT and the clinical response of gliomas to alkylating agents. N Engl J Med 343:1350-1354.
33. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 75:843-854.
34. Calin GA, Ferracin M, Cimmino A, Di Leva G, Shimizu M, Wojcik SE, lorio MV, Visone R, Sever NI, Fabbri M, luliano R, Palumbo T, Pichiorri F, Roldo C, Garzon R, Sevignani C, Rassenti L, Alder H, Volinia S, Liu CG, Kipps TJ, Negrini M, Croce CM (2005) A MicroRNA signature associated with prognosis and progression in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 353:1793-1801.
35. Schier AF (2007) The maternal-zygotic transition: death and birth of RNAs. Science 316:406-407.
36. Sethupathy P, Borel C, Gagnebin M, Grant GR, Deutsch S, Elton TS, Hatzigeorgiou AG, Antonarakis SE (2007) Human microRNA-155 on chromosome 21 differentially interacts with its polymorphic target in the AGTR1 3' untranslated region: a mechanism for functional single-nucleotide polymorphisms related to phenotypes. Am J Hum Genet 81:405413.
37. Dorsett Y, Tuschl T (2004) siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov 3:318-329.
38. Feng X, Zhao P, He Y, Zuo Z (2006) Allele-specific silencing of Alzheimer's disease genes: the amyloid precursor protein genes with Swedish or London mutations. Gene 371:68-74.
39. Gonzalez-Alegre P, Bode N, Davidson BL, Paulson HL (2005) Silencing primary dystonia: lentiviral-mediated RNA interference therapy for DYT1 dystonia. J Neurosci 25:10502-10509.
40. Miller VM, Xia H, Marrs GL, Gouvion CM, Lee G, Davidson BL, Paulson HL (2003) Allele-specific silencing of dominant disease genes. Proc Natl Acad Sci USA 100:7195-7200.
41. Xia X, Zhou H, Huang Y, Xu Z (2006) Allele-specific RNAi selectively silences mutant SOD1 and achieves significant therapeutic benefit in vivo. Neurobiol Dis 23:578-586.
42. Rodriguez-Lebron E, Paulson HL (2006) Allele-specific RNA interference for neurological disease. Gene Ther 13:576581.
43. Carlson RW, Moench SJ, Hammond ME, Perez EA, Burstein HJ, Allred DC, Vogel CL, Goldstein LJ, Somlo G, Gradishar WJ, Hudis CA, Jahanzeb M, Stark A, Wolff AC, Press MF, Winer EP, Paik S, Ljung BM (2006) HER2 testing in breast cancer: NCCN Task Force report and recommendations. J Natl Compr Canc Netw 4[Suppl 3]:S1-S22 .
44. Schnitt SJ (2006) Estrogen receptor testing of breast cancer in current clinical practice: what's the question? J Clin Oncol 24:1797-1799.
45. Lamy PJ, Nanni I, Fina F, Bibeau F, Romain S, Dussert C, Penault Llorca F, Grenier J, Ouafik LH, Martin PM (2006) Reliability and discriminant validity of HER2 gene quantification and chromosome 17 aneusomy analysis by real-time PCR in primary breast cancer. Int J Biol Markers 21:20-29.
46. Savino M, Garrubba M, Parrella P, Baorda F, Copetti M, Murgo R, Zelante L, Carella M, Valori VM, Santini SA (2007) Development of real-time quantitative reverse transcription-PCR for Her2 detection in peripheral blood from patients with breast cancer. Clin Chim Acta 384:52-56.
47. Tse C, Brault D, Gligorov J, Antoine M, Neumann R, Lotz JP, Capeau J (2005) Evaluation of the quantitative analytical methods real-time PCR for HER-2 gene quantification and ELISA of serum HER-2 protein and comparison with fluorescence in situ hybridization and immunohistochemistry for determining HER-2 status in breast cancer patients. Clin Chem 51:1093-1101.
48. Chu I, Arnaout A, Loiseau S, Sun J, Seth A, McMahon C, Chun K, Hennessy B, Mills GB, Nawaz Z, Slingerland JM (2007) Src promotes estrogen-dependent estrogen receptor alpha proteolysis in human breast cancer. J Clin Invest 117:2205-2215.
49. Cheok MH, Evans WE (2006) Acute lymphoblastic leukaemia: a model for the pharmacogenomics of cancer therapy. Nat Rev Cancer 6:117-129.
50. Joyce T, Pintzas A (2007) Microarray analysis to reveal genes involved in colon carcinogenesis. Expert Opin Pharmacother 8:895-900.
51. Miller LD, Liu ET (2007) Expression genomics in breast cancer research: microarrays at the crossroads of biology and medicine. Breast Cancer Res 9:206.
52. Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, Uhlen M, Nyren P (1996) Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal Biochem 242:84-89.
53. Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, Berka J, Braverman MS, Chen YJ, Chen Z, Dewell SB, Du L, Fierro JM, Gomes XV, Godwin BC, He W, Helgesen S, Ho CH, Irzyk GP, Jando SC, Alenquer ML, Jarvie TP, Jirage KB, Kim JB, Knight JR, Lanza JR, Leamon JH, Lefkowitz SM, Lei M, Li J, Lohman KL, Lu H, Makhijani VB, McDade KE, McKenna MP, Myers EW, Nickerson E, Nobile JR, Plant R, Puc BP, Ronan MT, Roth GT, Sarkis GJ, Simons JF, Simpson JW, Srinivasan M, Tartaro Kr, Tomasz A, Vogt KA, Volkmer GA, Wang SH, Wang Y, Weiner MP, Yu P, Begley RF, Rothberg JM (2005) Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437:376-380.
54. Daly AK, Brockmöller J, Broly F, Eichelbaum M, Evans WE, Gonzalez FJ, Huang JD, Idle JR, Ingelman-Sundberg M, Ishizaki T, Jacqz-Aigrain E, Meyer UA, Nebert DW, Steen VM, Wolf CR, Zanger UM (1996) Nomenclature for human CYP2D6 alleles. Pharmacogenetics 6:193-201.
55. The International HapMap Consortium (2005) A haplotype map of the human genome. Nature 437:1299-320.
56. Marchini J, Howie B, Myers S, McVean G, Donnelly P (2007) A new multipoint method for genome-wide association studies by imputation of genotypes. Nat Genet 39:906-913 .
57. Thorisson GA, Smith AV, Krishnan L, Stein LD (2005) The International HapMap Project Web site. Genome Res 15:1592-1593.
58. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ (2005) Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics 21:263-265.
59. Warren LL, Hughes AR, Lai EH, Zaykin DV, Haneline SA, Bansal AT, Wooster AW, Spreen WR, Hernandez JE, Scott TR, Roses AD, Mosteller M (2007) Use of pairwise marker combination and recursive partitioning in a pharmacogenetic genome-wide scan. Pharmacogenomics J 7:180-189.
60. Kulle B, Schirmer M, Toliat MR, Suk A, Becker C, Tzvetkov MV, Brockmoller J, Bickeboller H, Hasenfuss G, Nurnberg P, Wojnowski L (2005) Application of genomewide SNP arrays for detection of simulated susceptibility loci. Hum Mutat 25:557-565.
61. Klein RJ, Zeiss C, Chew EY, Tsai JY, Sackler RS, Haynes C, Henning AK, SanGiovanni JP, Mane SM, Mayne ST, Bracken MB, Ferris FL, Ott J, Barnstable C, Hoh J (2005) Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science 308:385-389.
62. Edwards AO, Ritter R 3rd, Abel KJ, Manning A, Panhuysen C, Farrer LA (2005) Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science 308:421-424.
63. Haines JL, Hauser MA, Schmidt S, Scott WK, Olson LM, Gallins P, Spencer KL, Kwan SY, Noureddine M, Gilbert JR, Schnetz-Boutaud N, Agarwal A, Postel EA, Pericak-Vance MA (2005) Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science 308:419-421.
64. Abecasis GR, Yashar BM, Zhao Y, Ghiasvand NM, Zarepar-si S, Branham KE, Reddick AC, Trager EH, Yoshida S, Bahl-ing J, Filippova E, Elner S, Johnson MW, Vine AK, Sieving PA, Jacobson SG, Richards JE, Swaroop A (2004) Age-
related macular degeneration: a high-resolution genome scan for susceptibility loci in a population enriched for late-stage disease. Am J Hum Genet 74:482-494.
65. Weeks DE, Conley YP, Tsai HJ, Mah TS, Schmidt S, Postel EA, Agarwal A, Haines JL, Pericak-Vance MA, Rosenfeld PJ, Paul TO, Eller AW, Morse LS, Dailey JP, Ferrell RE, Go-rin MB (2004) Age-related maculopathy: a genomewide scan with continued evidence of susceptibility loci within the 1q31, 10q26, and 17q25 regions. Am J Hum Genet 75:174-189.
66. Thorleifsson G, Magnusson KP, Sulem P, Walters GB, Gudbjartsson DF, Stefansson H, Jonsson T, Jonasdottir A, Jonasdottir A, Stefansdottir G, Masson G, Hardarson GA, Petursson H, Arnarsson A, Motallebipour M, Wallerman O, Wadelius C, Gulcher JR, Thorsteinsdottir U, Kong A, Jonas-son F, Stefansson K (2007) Common sequence variants in the LOXL1 gene confer susceptibility to exfoliation glaucoma. Science 317:1397-1400.
67. Buch S, Schafmayer C, Volzke H, Becker C, Franke A, von Eller-Eberstein H, Kluck C, Bassmann I, Brosch M, Lammert
F, Miquel JF, Nervi F, Wittig M, Rosskopf D, Timm B, Holl C, Seeger M, ElSharawy A, Lu T, Egberts J, Fandrich F, Folsch UR, Krawczak M, Schreiber S, Nurnberg P, Tepel J, Hampe J (2007) A genome-wide association scan identifies the hepatic cholesterol transporter ABCG8 as a susceptibility factor for human gallstone disease. Nat Genet 39:995-999.
68. he Wellcome Trust Case Control Consortium (2007) Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature 447:661-678.
69. Helgadottir A, Thorleifsson G, Manolescu A, Gretarsdottir S, Blondal T, Jonasdottir A, Jonasdottir A, Sigurdsson A, Baker A, Palsson A, Masson G, Gudbjartsson DF, Magnusson KP, Andersen K, Levey AI, Backman VM, Matthiasdottir S, Jons-dottir T, Palsson S, Einarsdottir H, Gunnarsdottir S, Gylfason A, Vaccarino V, Hooper WC, Reilly MP, Granger CB, Austin H, Rader DJ, Shah SH, Quyyumi AA, Gulcher JR, Thor-geirsson G, Thorsteinsdottir U, Kong A, Stefansson K (2007) A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction. Science 316:1491-1493.
70. Gudbjartsson DF, Arnar DO, Helgadottir A, Gretarsdottir S, Holm H, Sigurdsson A, Jonasdottir A, Baker A, Thorleifsson
G, Kristjansson K, Palsson A, Blondal T, Sulem P, Backman VM, Hardarson GA, Palsdottir E, Helgason A, Sigurjonsdottir R, Sverrisson JT, Kostulas K, Ng MC, Baum L, So WY, Wong KS, Chan JC, Furie KL, Greenberg SM, Sale M, Kelly P, MacRae CA, Smith EE, Rosand J, Hillert J, Ma RC, Elli-nor PT, Thorgeirsson G, Gulcher JR, Kong A, Thorsteinsdot-tir U, Stefansson K (2007) Variants conferring risk of atrial fibrillation on chromosome 4q25. Nature 448:353-357.
71. Saxena R, Voight BF, Lyssenko V, Burtt NP, de Bakker PI, Chen H, Roix JJ, Kathiresan S, Hirschhorn JN, Daly MJ, Hughes TE, Groop L, Altshuler D, Almgren P, Florez JC, Meyer J, Ardlie K, Bengtsson Bostrom K, Isomaa B, Lettre G, Lindblad U, Lyon HN, Melander O, Newton-Cheh C, Nils-son P, Orho-Melander M, Rastam L, Speliotes EK, Taskinen MR, Tuomi T, Guiducci C, Berglund A, Carlson J, Gianniny L, Hackett R, Hall L, Holmkvist J, Laurila E, Sjogren M, Sterner M, Surti A, Svensson M, Svensson M, Tewhey R, Blumenstiel B, Parkin M, Defelice M, Barry R, Brodeur W, Camarata J, Chia N, Fava M, Gibbons J, Handsaker B, Hea-ly C, Nguyen K, Gates C, Sougnez C, Gage D, Nizzari M, Gabriel SB, Chirn GW, Ma Q, Parikh H, Richardson D, Ricke D, Purcell S (2007) Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels. Science 316:1331-1336.
72. Plenge RM, Seielstad M, Padyukov L, Lee AT, Remmers EF, Ding B, Liew A, Khalili H, Chandrasekaran A, Davies LR, Li W, Tan AK, Bonnard C, Ong RT, Thalamuthu A, Pet-tersson S, Liu C, Tian C, Chen WV, Carulli JP, Beckman EM, Altshuler D, Alfredsson L, Criswell LA, Amos CI, Seldin MF, Kastner DL, Klareskog L, Gregersen PK (2007) TRAF1-C5 as a risk locus for rheumatoid arthritis-a genomewide study. N Engl J Med 357:1199-209.
73. Easton DF, Pooley KA, Dunning AM, Pharoah PD, Thompson D, Ballinger DG, Struewing JP, Morrison J, Field H, Lu-
ben R, Wareham N, Ahmed S, Healey CS, Bowman R, Meyer KB, Haiman CA, Kolonel LK, Henderson BE, Le Marchand L, Brennan P, Sangrajrang S, Gaborieau V, Odefrey F, Shen CY, Wu PE, Wang HC, Eccles D, Evans DG, Peto J, Fletcher O, Johnson N, Seal S, Stratton MR, Rahman N, Chenevix-Trench G, Bojesen SE, Nordestgaard BG, Axels-son CK, Garcia-Closas M, Brinton L, Chanock S, Lissowska J, Peplonska B, Nevanlinna H, Fagerholm R, Eerola H, Kang D, Yoo KY, Noh DY, Ahn SH, Hunter DJ, Hankinson SE, Cox DG, Hall P, Wedren S, Liu J, Low YL, Bogdanova N, Schurmann P, Dork T, Tollenaar RA, Jacobi CE, Devilee P, Klijn JG, Sigurdson AJ, Doody MM, Alexander BH, Zhang J, Cox A, Brock IW, MacPherson G, Reed MW, Couch FJ, Goode EL, Olson JE, Meijers-Heijboer H, van den Ouweland A, Uitterlinden A, Rivadeneira F, Milne RL, Ribas G, Gonza-lez-Neira A, Benitez J, Hopper JL, McCredie M, Southey M, Giles GG, Schroen C, Justenhoven C, Brauch H, Hamann U, Ko YD, Spurdle AB, Beesley J, Chen X, Mannermaa A, Kosma VM, Kataja V, Hartikainen J, Day NE, Cox DR, Ponder BA (2007) Genome-wide association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature 447:10871093.
74. Tomlinson I, Webb E, Carvajal-Carmona L, Broderick P, Kemp Z, Spain S, Penegar S, Chandler I, Gorman M, Wood W, Barclay E, Lubbe S, Martin L, Sellick G, Jaeger E, Hubner R, Wild R, Rowan A, Fielding S, Howarth K, Silver A, Atkin W, Muir K, Logan R, Kerr D, Johnstone E, Sieber O, Gray R, Thomas H, Peto J, Cazier JB, Houlston R (2007) A genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility variant for colorectal cancer at 8q24.21. Nat Genet 39:984-988.
75. Huang Y (2007) Pharmacogenetics/genomics of membrane transporters in cancer chemotherapy. Cancer Metastasis Rev 26:183-201.
76. Kuivenhoven JA, Jukema JW, Zwinderman AH, de Knijff P, McPherson R, Bruschke AV, Lie KI, Kastelein JJ (1998) The role of a common variant of the cholesteryl ester transfer protein gene in the progression of coronary atherosclerosis. The Regression Growth Evaluation Statin Study Group. N Engl J Med 338:86-93 .
77. Zeggini E, Weedon MN, Lindgren CM, Frayling TM, Elliott KS, Lango H, Timpson NJ, Perry JR, Rayner NW, Freathy RM, Barrett JC, Shields B, Morris AP, Ellard S, Groves CJ, Harries LW, Marchini JL, Owen KR, Knight B, Cardon LR, Walker M, Hitman GA, Morris AD, Doney AS, McCarthy MI, Hattersley AT (2007) Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes. Science 316:1336-1341.
78. Brockmoller J, Cascorbi I, Henning S, Meisel C, Roots I (2000) Molecular genetics of cancer susceptibility. Pharmacology 61:212-227.
79. Serretti A, Kato M, Kennedy JL (2007) Pharmacogenetic studies in depression: a proposal for methodologic guidelines. Pharmacogenomics J.
80. Chanock SJ, Manolio T, Boehnke M, Boerwinkle E, Hunter DJ, Thomas G, Hirschhorn JN, Abecasis G, Altshuler D, Bailey-Wilson JE, Brooks LD, Cardon LR, Daly M, Donnelly P, Fraumeni JF Jr, Freimer NB, Gerhard DS, Gunter C, Gutt-macher AE, Guyer MS, Harris EL, Hoh J, Hoover R, Kong CA, Merikangas KR, Morton CC, Palmer LJ, Phimister EG, Rice JP, Roberts J, Rotimi C, Tucker MA, Vogan KJ, Wacholder S, Wijsman EM, Winn DM, Collins FS (2007) Replicating genotype-phenotype associations. Nature 447:655660.
81. Shukla SJ, Dolan ME (2005) Use of CEPH and non-CEPH lymphoblast cell lines in pharmacogenetic studies. Pharmacogenomics 6:303-310.
82. Shah RR (2005) Drug-induced QT interval prolongation-regulatory guidance and perspectives on hERG channel studies. Novartis Found Symp 266:251-280 discussion 280285.
83. Merikangas KR, Risch N (2003) Genomic priorities and public health. Science 302:599-601.
Summary
THE EVOLUTION AND CURRENT CONDITION OF PHARMACOGENETIC RESEARCHES I.P. Kaidashev, O.A. Shlykova, O.V. Izmaylova
Key words: pharmacogenetics, genes polymorphism, clinical pharmacology
Pharmacogenetics primarily deals with the therapeutic effects and adverse action consequences of medications, poisons and other chemical and environmental factors. However, shortly after the origination of pharmacogenetics, this area has extended: genetic polymorphisms have been thoroughly studied, not only with respect to these known effects, but also as factors in susceptibility to diseases in general. In many of these early studies the causes of the diseases were unknown. In parallel with the functional nature of the genes in pharmacogenetic studies, along with factors of metabolic enzymes, many other factors such as transport, DNA resumption, cell cycle regulation and signal transduction are considered. Total number of publications studying the relationship of polymorphisms with the risk of disease, are in large excess over those which study the polymorphisms in relation to the response to medications. These studies are analyzed and systematized in order to improve future strategies in pharmacogenetics and genomics research. The attention is focused upon the identification of genotypes which predispose to certain multifactorial and polygenic diseases. Ministry of Public Health of Ukraine
Higher State Educational Establishment of Ukraine "Ukrainian Medical Stomatological Academy", Poltava
Mamepian nadiurnoB do pedaKqii 9.02.2011 p.
