CC BY
46
Medical Immunology (Russia)/ Медицинская иммунология ОЮЫгННаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbU Meditsinskaya Immunologiya 2016, Т. 18, № 6, стр. 545-554 F ^ ,, 1 . . 2016, Vol. 18, No 6, pp. 545-554
© 2016, СПбРО РААКИ Original articles © 2016, SPb RAACI
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛАКТОБАЦИЛЛ В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТОВ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРНОЙ ПНЕВМОКОККОВОЙ ВАКЦИНОЙ
Леонтьева Г.Ф.1, Крамская Т.А.1, Грабовская К.Б.1, Филимонова В.Ю.1, Лайно Д.2, Виллена Д.2, Альварес С.2, Даниленко В.Н.3, Суворов А.Н.1, 4
1ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия
2 Референсный центр по исследованию лактобацилл, Тукуман, Аргентина
3 ФГБУН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» РАН, Москва, Россия
4 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. Одной из наиболее актуальных задач медико-биологической науки является создание вакцинных препаратов против патогенных стрептококков — самых распространенных бактериальных возбудителей заболеваний человека, экономический ущерб от которых уступает лишь потерям от гриппозной инфекции. Входными воротами стрептококковой инфекции являются слизистые оболочки респираторного и мочеполового тракта.
Парентеральный способ введения вакцин не всегда позволяет добиваться одинаково эффективной стимуляции местного иммунитета на слизистых оболочках, а вакцины, вводимые через слизистые оболочки, способны эффективно стимулировать иммунную защиту в области введения, а также обеспечить развитие системного иммунного ответа.
Введение через слизистые оболочки вакцинных препаратов белковой природы требует использования специальных эффективных и безопасных адъювантов, поскольку рекомбинантные белки обычно проявляют недостаточную иммуногенность при таком способе введения. В работе в качестве вакцинных адъювантов при мукозальной иммунизации лабораторных животных пневмококковыми химерными рекомбинантными белками PSPF и PSP были апробированы два штамма пробиотиков — Lactobacillus rhamnosus CRL1505 и L32. Рекомбинантные химерные белки PSPF и PSP несут в своей структуре несколько иммуногенных эпитопов PspA, Spr1875, PsaA и предназначены для вакцинации против инфекции Streptococcus pneumoniae. Белки, отличие которых связано с присутствием в структуре PSPF участка молекулы флагеллина — FliC, по-разному стимулировали иммунный ответ при совместном введении с двумя штаммами пробиотиков. Установлено, что оба исследованных штамма L. rhamnosus были способны оказывать адъювантный эффект при интраназальном введении вакцинных белков, проявлявшийся в усилении секреторного и гуморального иммунного ответа на совместно введенный рекомбинантный химерный белок PSPF. Выраженной стимуляции продукции специфических IgA носовых смывов и IgG сыворотки крови на PSP под влиянием L. rhamnosus L32 не происходило. Адъювантный эффект от вводимых лактобациллярных препаратов существенно снижался после температурной инактивации бактерий, однако препарат клеточных стенок L. rhamnosus CRL1505 проявлял выраженную активность. Стимуляция иммунного ответа адъювантами приводила к усилению протективного эффекта вакцины в экспериментах на лабораторных животных, инфицированных S. pneumoniae.
Адрес для переписки: Address for correspondence:
Леонтьева Галина Федоровна Leontieva Galina F.
ФГБНУ «Институт экспериментальной медициныi», Institute of Experimental Medicine
197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12. 197376, Russian Federation, St. Petersburg,
Тел.: 8(812) 234-68-74. Acad. Pavlovstr, 12.
E-mail:[email protected] Phone: 7(812) 234-68-74.
E-mail: [email protected]
Образец цитирования:
Г.Ф. Леонтьева, Т.А. Крамская, К.Б. Грабовская, В.Ю. Филимонова, Д. Лайно, Д. Виллена, С. Альварес, В.Н. Даниленко, А.Н. Суворов «Использование лактобацилл в качестве адъювантов при интраназальной иммунизации химерной пневмококковой вакциной» //Медицинская иммунология, 2016. Т. 18, № 6. С. 545-554. doi: 10.15789/1563-0625-2016-6-545-554
© Леонтьева Г.Ф. и соавт., 2016
For citation:
G.F. Leontieva, T.A. Kramskaya, K.B. Grabovskaya,
V.Yu. Filimonova, J. Laino, J. Villena, S. Alvares, V.N. Danilenko,
A.N. Suvorov "Evaluation of Lactobacillusprobiotics as adjuvants
for nasal immunization with chimeric pneumococcal vaccine",
Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya,
2016, Vol. 18, no. 6, pp. 545-554.
doi: 10.15789/1563-0625-2016-6-545-554
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2016-6-545-554
Леонтьева Г.Ф. и др. Leontieva G.F. et al.
Установлено, что некоторые штаммы лактобацилл, в частности Lactobacillus rhamnosus CRL1505 и L32, могут быть использованы в качестве адъювантов в составе мукозальных вакцин, однако эта способность зависит от свойств вакцинного препарата и формы введения пробиотиков.
Ключевые слова: лактобациллы, пробиотики, рекомбинантные белки, мукозальные вакцины, адъюванты, пневмококковая инфекция
EVALUATION OF LACTOBACILLUS PROBIOTICS AS ADJUVANTS FOR NASAL IMMUNIZATION WITH CHIMERIC PNEUMOCOCCAL VACCINE
Leontieva G.F.a, Kramskaya T.A.a, Grabovskaya K.B.a, Filimonova V.Yu.a, Lain o J.b, Villena J.b, Alvares S.b, Danilenko V.N.c, Suvorov A.N.a d
a Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation b Reference Centre for Lactobacilli (CERELA-CONICET), Tucuman, Argentina с Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation d St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation
Abstract. Vaccine protection against photogenic gram-positive bacteria including different species of streptococci is an important problem of contemporary molecular biology. Streptococcal infections are most common bacterial infections surpassing by the economic losses all the infections excluding influenza. The gates of streptococcal infection, oral cavity or vagina, are covered with immune and non-immune mucosal cells that are the first line of defenses. Subcutaneous immunization not always stimulate the local immunity on mucosal surfaces. On the other hand, mucosal vaccination can provide an appropriate local immune response together with systemic protection. However, mucosal immunization often requires usage of special and effective adjuvants especially in case of vaccines based on recombinant proteins.
For protection against Streptococcus pneumoniae infection, two chimeric recombinant proteins (PSPF and PSP) have been tested as vaccines. Recombinant proteins PSPF and PSP carry immunogenic epitopes from the respiratory pathogen including PspA, Spr1875 and PsaA. PSPF structure also carries a fraction of flagellin-FliC molecule in comparison with PSP, which does not have this fragment. This portion of PSPF was included as internal adjuvant intended for the stimulation of Toll-like receptor 5.
In this work, the adjuvant capacity of two probiotic strains, Lactobacillus rhamnosus CRL1505 and L. rhamnosus L32 was evaluated. It was demonstrated that both lactic acid bacteria strains were able to provide adjuvant effects by enhancing the mucosal and systemic immune responses after their co-administration with the recombinant chimeric protein PSPF. The adjuvant effect of both Lactobacillus strains was significantly decreased after their thermal inactivation. However, the cell walls of bacteria showed a marked adjuvant activity. An improved protection against several S. pneumoniae serotypes after mucosal immunization of infant mice with PSPF vaccine with probiotic strains or their cell walls was also demonstrated here.
The recombinant chimeric protein PSPF administered with immunomodulatory probiotic strains or their bacterial components would be a promising vaccine for immunization of humans against S. pneumoniae, particularly in children.
Keywords: Lactobacillus, probiotics, recombinant proteins, mucosal vaccines, adjuvants, pneumococcal infection
Исследование выполнялось на средства субсидии из федерального бюджета в рамках соглашения № 14.613.21.0023.
Введение
Вакцинация с момента своего введения в медицинскую практику и по настоящее время является действенным средством снижения заболеваемости и смертности от инфекций. Прогресс в развитии современной биологии и медицины, связанный с появлением современных молеку-лярно-генетических технологий, способствует
разработке новых типов вакцин, эффективных в отношении широко распространенных опасных инфекционных заболеваний. В настоящее время создаются новые формы вакцинных препаратов, апробируются разнообразные адъюванты и пути введения препарата, способные обеспечить оптимальный иммунный ответ и высокую протек-тивную эффективность вакцинации.
Одной из наиболее актуальных задач медико-биологической науки является создание вакцинных препаратов против патогенных стрептококков — самых распространенных бактериальных
2016, Т. 18, № 6 2016, Vol. 18, No 6
возбудителей заболеваний человека, экономический ущерб от которых уступает лишь потерям от гриппозной инфекции. Входными воротами стрептококковой инфекции являются слизистые оболочки респираторного и мочеполового тракта. Очевидно, что одновременная индукция местного и системного иммунного ответа способствует повышению эффективности процесса вакцинации. Парентеральный способ введения вакцин не всегда позволяет добиваться одинаково эффективной стимуляции местного иммунитета на слизистых оболочках различных анатомических зон [8]. Вакцины, вводимые через слизистые оболочки, способны эффективно стимулировать иммунную защиту в области введения, а также обеспечить развитие системного иммунного ответа [17].
Введение через слизистые оболочки вакцинных препаратов белковой природы требует использования специальных эффективных и безопасных адъювантов, поскольку рекомбинантные белки обычно проявляют недостаточную имму-ногенность при таком способе введения [6].
В последние годы выявлена способность различных пробиотических штаммов лактобацилл стимулировать реакции врожденного иммунитета [12] и оказывать влияние на формирование адаптивного иммунного ответа.
В настоящей работе исследована возможность применения пробиотических штаммов Lactobacillus rhamnosus в качестве адъювантов в составе рекомбинантных химерных вакцин против Streptococcus pneumoniae.
Материалы и методы
Микроорганизмы
Штамм Lactobacillus rhamnosus L32 получен из коллекции отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «ИЭМ», штамм CRL1505 предоставлен CERELA culture collection (Chacabuco 145, San Miguel de Tucuman, Argentina). Бактерии культивировали в среде MRS в течение 24 часов при 37 °C (суточная культура) в анаэробных условиях, отмывали трехкратно центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут и концентрировали в 10 раз.
Термоинактивацию бактерий проводили при 80 °C в течение 30 минут.
Для дезинтеграции и получения компонентов клеточной стенки бактерии разрушали с помощью ультразвука (четырехкратное озвучивание, время озвучивания — 5 мин, время паузы между импульсами — 60 с, амплитуда — 9 мкм). После разрушения лизат осветляли центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин на холо-
де, компоненты бактериальных клеток осаждали центрифугированием при 20000 g в течение 1 часа при охлаждении. Осадок промывали в том же режиме и ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе.
Об эффективности термоинактивации и дезинтеграции судили по результатам высева материала на плотную ростовую среду MRS агара (HIMEDIA, Индия). Отсутствие роста подтверждало полноту разрушения бактериальных клеток.
Подготовку всех вариантов адъюванта проводили из одной и той же суспензии бактерий. Одна доза живых бактерий составила 108 КОЕ/мышь. Одна доза термоинактивированного варианта пробиотика содержала равное количество бактерий. Компоненты стенок бактериальных клеток, полученные из общей бактериальной взвеси, ресуспендировали в физиологическом растворе до исходного объема и далее в соответствии с конечным разведением живой культуры пробиотика.
Штаммы Streptococcus pneumoniae 3, 6В, 14, 19F серотипов получали из коллекции Института детских инфекций, Санкт-Петербург. Бактерии культивировали в среде ТХБ (HIMEDIA, Индия) с 20% сыворотки лошади (Биолот, Россия) в течение 24 часов при +37 °C в анаэробных условиях, отмывали PBS трехкратным центрифугированием при 3500 об/мин в течение 20 минут.
Животные
Исследования проводили на беспородных мышах (самки, возраст 10 недель), полученных из питомника лабораторных животных «Рапполо-во». Мыши albano Swiss (самки, возраст 3 недели) предоставлены Reference Centre for Lactobacilli (CERELA-CONICET), Tucuman, Argentina.
Вакцинные препараты
В работе использованы два белковых химерных рекомбинантных вакцинных препарата — PSPF и PSP-гибридные молекулы, составленные из линейно соединенных иммунодоминантных фрагментов нескольких поверхностных белков патогенных пневмококков. Молекулы первоначально моделировании сначала in silico, на компьютере, а затем в лаборатории с применением технологии, включающей химический синтез полноразмерной ДНК молекулы, ее клонирование в экспрессионных векторах с последующей экспрессией белков в эффективных продуцентах [21].
Компьютерное моделирование было осуществлено с помощью пакетов компьютерных программ BLAST (NCBI) ExPASy и алгоритма I-Tasser CASPs (Critical Assessment of protein Structure Prediction) с целью создания реалисти-
Леонтьева Г.ф. и др. Leontieva O.F. et aL
ческих моделей белков. Для объединения доменов был осуществлен докинг эпитопных детерминант. Все рекомбинантные белки выделяли и очищали методом аффинной хроматографии на колонке с №-сефарозой (GE Healthcare, Швеция) согласно процедуре, рекомендованной производителем.
Чистоту и количественное содержание белка контролировали с помощью электрофореза в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) в вертикальном пластинчатом аппарате Mini-PROTEAN II (BioRad, США) и методом Лоури соответственно. Уровень содержания ЛПС определяли с помощью ЛАЛ-теста.
Аранжировка эксперимента
В экспериментах по оценке адъювантного эффекта Lactobacillus rhamnosus L32 живые, тер-
моинактивированные и дезинтегрированные
бактерии вводили четыре раза. В первый день
животные получали только пробиотические адъ-юванты или физиологический раствор. Во второй день проводили иммунизацию смесью адъ-юванта и химерных белков в дозе 2° мкг/мышь. Через 21 день после первого введения процедуру повторяли в той же последовательности. Исследуемые препараты вводили интраназально под легким эфирным наркозом, объем материала был
равен 0,05 мл. ^Последовательность манипуляций схематически представлена на рисунке 1A.
В экспериментах по оценке адъювантного эффекта ^сЬЫсШш rhamnosus CRL1505 термо-
инактивированную форму бактерий и их клеточные стенки вводили интраназально в смеси с по-0 1 21 22 28
липептивдом РБРР в дозе 20 мкг/мышь триады с интервалом в две недели. Последовательность манипуляций схематически представлена на рисунке 1Б.
Забор крови
Образцы крови от каждого животного собирали в указанные выше сроки из подчелюстной вены. Образцы сыворотки замораживали и хранили при -8° °С.
Получение смывов
Для определения специфических секреторных 1§А мышам внутрибрюшинно вводили 0,1 мл °,5% раствора пилокарпина и через 1-2 минуты собирали 50 мкл секретов непосредственно сразу после начала повышенного слюноотделения. В пробы вносили ингибитор протеаз рМБР до конечной концентрации 1 тМ.
Исследуемые специфические антитела и средства их оценки
Содержание специфических определяли в ИфА с использованием конъюгатов соответствующих козьих антимышиных антител (81ёта, США).
Огатистический анализ
Эксперименты были выполнены в трех повторах. результаты представлены в виде средних
значений и соответствующих им стандартных
отклонений. Данные обрабатывали с использованием пакета программ анализа данных в Ехсе1 (однофакторный дисперсионный анализ, описательная статистика). °тличия считались статистически достоверными при р < 0,°5.
35 37 38
Взятие проб сыворотки и смывов Интраназальная иммунизация (25 ^.L): различные формы L. rhamnosus L32
Т
Заражение стрептококками
Получение селезенок для подсчета бактерий
Интраназальная иммунизация (50 ^.L): 20 ^.g антиген/мышь (25 ^.L) + различные формы L. rhamnosus L32 0 14 28 33 35
▲ J 1 1. i 1 Взятие прс Заражение 1 , б сыворот S. pneumo 1 (и и смывов niae
Получение легких для подсчета бактерий Интраназальная иммунизация (50 ц1): 20 антиген/мышь (25 ц!) + различные формы I. гИотпоБиБ СРИ505 Рисунок! Схема постановки эксперимента
2016, Т. 16, № 6 2016, Vol. 16, No 6
Результаты
Изучение адъювантных свойств L. rhamnosus CRL1505
Адъювантный потенциал пробиотического штамма CRL1505 иоучали в отно1^енио химерного белка PSPF. Мыши линоо Swiss в возрасте 3 нодель были трехкратно иммунизированы ин-траназально свободном полипопт-идоом, а также его смесью с термоииоктивированнош пробио-тиком или клеточными стенками бактерий в с о-ответствио со схемой экспорименоа (рио. 1А). Установлено, что клеточные стенки пробиотического штамма L. rhamnosus CRL1505 проявляли выраженной адъювантннш эффект и достоверно стимулировали продукцию споцифических сывороточных IgM и IgG, а также IgA и IgG бронхоальвеолярннгс смывов в отличие от тер-моиноктивированной формы лактобацилл, которая достоверно повышала только коннинтрацию PSPF-споцифических IgM (рис. 2).
Протективный потеиоиол иммунного ответа соответствовал уровню иммунной реакцио на споцифическио аиоигеи. Процесс выведения излегких S. pneumoniae всех) четырех ^следовано ных серотипов был более интенсивным в груло по, иммуннзированной белком PSPF совместно с клеточными стенками пробиотика. tía момент конороля протективности количество пннвмо-кокка в легких животных из этой групиы было с^мым низким, а отличия от других групи достоверны (рис. 3).
Изучениеадъювантныгх cboííct^L. rhamnosus L12
ИмауномoдулируюIцие свойства пробиотио ческого штамма L. rhramnosus L322 в отношении белков PSPF и P SP и сследовали и о м одели беспородных мышей по схеме, указанной на рисуемое 1Б. 13 процессе развития иммунного ответа но двукратную интраназальную вакциноцию проводили сравнительный аннлиз содержания аноигенспоцифических антител классов А и G в иосовых смывах и сыворотках животных. Ре-комбинононые химерные вакцииннIе препораты PSPF, PSP вводили индивидуально или совместно с различными форммми пробиотика.
Установлено, что совместное использован— живой культуры L. rhamnosus L322 и белка PSPS приводило к стимуляция уровня споцифических IgA и IgG антиоел. После повторной вакциноции средн— показатели кoнненорации сывороточных IgG в труп— жавотных, получавших пробзио отик, достоверно превышали показатели в контрольной груп— без пробиотика. Под влиян—м живого пробиотического штамма происходило ускоренное нокoпление секреторных антител
Сывороточные IgM
1000
800
600
ж 400
200
0
L
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированная ■ PSPF + мембраны CRL1505
6ОО 4ОО 2ОО О
Сывороточные IgG
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированные ■ PSPF + мембраны CRL1505
2ОО
100
Сывороточные IgA
0
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированная ■ PSPF + мембраны CRL1505
40
20
0
IgA смывов *
m
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированная ■ PSPF + мембраны CRL1505
IgG смывов
_*
6
■5 4 51 2
0
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированный ■ PSPF + мембраны CRL1505
Рисунок 2. Иммунный ответ на вакцинацию белком PSPF совместно с L. rhamnosus CRL1505
*
Леонтьева Г.Ф. и др. Leontieva G.F. e t a l.
о
о
о
о
S. pneumoniae 68
S. pneumoniae 14 -i-
S. pneumoniae 3
6 4 2 0 8 6
4 2 0
6
5 4
3 2 1 0
8
6
4 2 0
□ PSPF
□ PSPF + CRL1505 термоинактивированный ■ PSPF + клеточные стенки CRL1505
Рисунок 3 . С о держание S. pneumoniae в легких мышей, и ммунизированных белком P SPF совместно с L. rhaeenenumCRL1505, через 48 ч асов п осле инфекции
Примечаиие. * - отличия от контрольной группы достоверны, p < 0,05.
в носовых смывах;, что было зарегистрировано на 28 и 35 день от начала эксперимента (рис. 4А).
Термоинактивация L. rhamnosus L32 полностью устраняла адъювантный эффект в отношении agG антител. В группе животных, вакцинированных пробиотиком после его дезинтеграции ультразвуком, отмечен а тенденция к повышению средних показателей концентрации спецефиче-ских IgG. В отношении секреторного иммунного отеета как термоинаетивированная, так и детин-тегрированная форма L. rhamnosus L32 обеспечи-
S. pneumoniae 19F -I-
вали превышение средних показателей на протяжении всего срока наблюдения.
В отношении белеа PSP адъюваннный эффека живоК культуры L. rhnmmosus L32 не проявился. средние показатели секреторного и гуморального иммунного ответа в кантрольноК и опытно-группе прокуичсску не отличались (рнс. 4Б).
Сравнение уровня протекаивноК эффективности иммунитета, стимулированного вакуина-цией мышей белеами PSPF и PSP в сво-едноК форме и в присутствии про-иотическаго адъю-ванта, протодили на модели пневмокакуавой инфекции у мышей после внутриТрюшинтого заражения штаммом 7 3 S. pneummniae (рос. 5А).
Через 24 часа после зарожения о—енивали содержание бекаерой в селезентах инфицированных животных. Устанотлено, что в группе мышей, вакцинированных PSPF в присутствии живо— и дезиннегриротанной проТиитическаК культуры, наблюдалесь ускурьнтот выведение бектерий из организма по сравнению с кантроль-ными мышами, вакуиниротантыми в отсутствие адъюванна. Тeрмоинактитировантый вароанн проКиотииескаго штамма не спосоКствовал повышению устойчивости к инфекуии.
Пневмокакуавая инфекуит у мышей, имму-низиротанныт PSP в своКодной форме и в сочетании с живым проТиттическум штаммом L32, протекаю одинакавот Колитество бакаерий в селезенке через 24 чеса от начала инфекуии поок-тически не отличал ось (рис. 5Б).
Обсуждение
Пневмокекуевая инфекуия. приводящая к развитию бельшинства бектериальных пневмот ний и острых отитов у детей, входит в число наиболее острых проКлем здровотхранения во всех странах миро. Несмотря на успехи антиТиотикат теропии, средств диигноттииу и профилакаику забелеваний, показатели смеронотти от пневмот к-ку-вых з абелеваний оттаюдся высокуми.
Полисахарииные и канъюгированные пнев-мотакуавые вакцины, имеющиеся на рынке вакуинаых препоратов, не могут oТоcпeчить не-оКходимой эффективности профитактическут мероприятий из-за присущих им недостаткев, связанаыт со спецификей иммунного ответа к политахарвдным аннигенам и о^ен^ен^т стью аIзаIьгeнтотo состава существующий вари-аIза(ьв. В настояпцее время выявлено отало 100 различных серотипов пневмокеКУет, претем ит распределение в резных странах варьирует в зависимости от аннигeнтoтo состава наибелее широта используемоК вакуины. На мировом рынк-
2016, Т. 18, № 6 2016, Vol. 18, No 6
А
40 35 30 25 20 15 10 5 0
^ смывов
Сывороточные ^
16 14 12 10 8 6 4 2 0
ш
J_L
□ 28 день П35 день IgA смывов
1
600 500 400 300 200 100 0
300 250
200
150
100
50
0
* * т Т
ш
1 2 3
□ 28 день П35 день
Сывороточные ^
□ 28 день П35 день
1 2 □ 28 день П35 день
Рисунок 4. Иммунный ответ на вакцинацию белками РБРР (А) и РБР (Б) совм естно с L. гНатповив Ь32.
Примечание. Вакцинным препарат содержал: 1- белок без адъюванта; 2 - белок и живую форму L32; 3 - белок и термоинактивированныо 1_32; 4 - белоки клеточны1е стенки 1.32!; * - отличия от контрольной группы достоверны, р < 0,05.
выпускаются четыре пневмококковые вакцины: 23-валентная полисахаридная, доступная с 1980 года и коньюгированные 7, 10 и 13-валентные, которые присутствуют на рынке с 2009 года, причем первая из них постепенно теряет популярность в силу нестойкости иммунитета [2]. В связи с необходимостью качественного усовершенствования вакцин и расширения их количества в 2001 году в рамках инициативы ВОЗ (IVR) были приняты специальные программы содействия различным проектам в области исследований и разработки вакцин против инфекционных болезней, имеющих наибольшую значимость для общественного здравоохранения [25]. С развитием молекулярных технологий в последнее время появилась возможность конструирования рекомбинантных вакцин на основе поверхностных бактериальных белков. Преимуществом такого рода вакцин является существенно более длительный иммунитет и консерватизм поверхностных белковых антигенов.
Исследованные в работе вакцинные препараты — белки PSPF и PSP — представляют собой рекомбинантные химерные молекулы, которые составлены из последовательно соединенных фрагментов нескольких поверхностных белков S. pneumoniae. Молекулы рекомбинатных бел-
ков первоначально моделировали in silico, а затем получали экспериментально с применением технологии, включающей химический синтез полноразмерной ДНК-молекулы, ее клонирование в экспрессионных векторах с последующей экспрессией белков в эффективных продуцентах [21].
Проектирование химерных конструкций проводилось на основе результатов собственных экспериментальных исследований рекомбинантных аналогов ряда поверхностных белков патогенных стрептококков [3, 20, 24].
Аминокислотную последовательность белков PSPF и PSP составляют иммунодоминантные фрагменты поверхностных белков S. pneumoniae — PsaA, PspA and Spr1875, а в состав PSPF входят C- и N-концевые фрагменты флагеллина. Ранее было показано, что химерные белки иммуноген-ны, а специфический иммунный ответ обеспечивает защиту от пневмококковой инфекции [21].
Входными воротами инфекций, вызываемых многими патогенными бактериями, является слизистая оболочка респираторного тракта. Эффективность вакцинации определяется свойствами вакцинного препарата, способом их введения и природой использованных адьювантов [11, 18, 222]. Подобно тому как респираторные инфекции
Б
Леонтьева Г.Ф. и др. Leontieva G.F. et al.
А
10000000 1000000
ё 100000
10000 1000
□ PSPF DPSPF + живая L32 □ PSPF + термоинакт. L32 ■ PSPF + кл.стенки L32
о
10000000 1000000 100000 10000 1000
— Г1-!
□ PSP □ PSP + живая L32
Рисунок5.Содержание S. pneumoniae в селезенках мышей, ессндерж^ваддых (знлкесе PSPF (А) е psp (Б) еофместно с L. rhamnosus L32, через 24 часа после едфнкцее
Примечание. * - отличия от контрольной группы достоверны, p <0,05.
стимулируют развитие местного д системного иммунного отвеса, введение вакцин непосред-гтвенно через слизисные оболочки также приводит к разситию иммунны1х реакций на слизистытх д в крсви [4, 13, 14, 16]. Парентеральный путь иммунизадии обеспачивает сформирование системного иммунитета, нд не всегда спосоГктву-нт индукции достаточной иммунной реакции на слизистыох оболочках [5,7, 14 ].
Исолердоднде адъювантныех свойств проГн-нтиков проводили в динамике развития иммун-ннго ответа на вакцинныле препарата, введенныге интраназгльно. Известно, что дакцинныд е препараты^ введенны1е интраназально, обыыдно трдбуют использования безопасного и эффективного адъ-юванта для повышения иммуногенности. В разрешенных к применению бактериальных вакцинах «Dukoral» и «Vivotif» адъювантами являются самд инактивированныле или аттещтфдванные егктердд VWrio Cholerae д SalmmeUa Thyphi [17], о некдтдрых ва^дн^ нгхддящдхся нг стгддд клдндпескдх дсследдогндй о качестве адъюоан-тдо дспдлвзгются дскгсстоеннд дслгеленные егктердалвные тдксдны [9]. Некдтдрые полезные для пелдоека прдеддтдпескде лактдеацдллы также спдсдены пдоышатв гстдйпдодств дрга-ндзма к днрекцдд, дказыоая олдянде на меха-ндзмы орджденндгд дмиундтета [3, 5].
В настоящем исследовании в качестве вакцинных адъювантов были апробированы проби-отические штаммы L. rhamnosus CRL 1505 и L32. Их адъювантные свойства были сопоставлены при мукозальной вакцинации лабораторных животных рекомбинантными химерными белками PSPF и PSP.
Штамм L. rhamnosus CRL1505, выделенный в Аргентине, был ранее всесторонне исследован, доказаны его иммуномодулирующие свойства как в качестве препарата живых бактерий, так и в случае его термоинактивации [23]. Отечественный штамм L. rhamnosus L32 был выделен из микробиоты человека, полностью генетически охарактеризован, его иммуномодулирующие свойства исследованы на культуре ткани и в организме лабораторных животных [1].
Клеточные стенки L. rhamnosus CRL1505 достоверно повышали концентрацию IgA, IgM и IgG в сыворотке крови и в бронхоальвеоляр-ных смывах мышей. После предварительной инактивации прогреванием данный пробиоти-ческий штамм не оказывал влияния на уровень иммунного ответа на белок PSPF. В то же время клеточные стенки, выделенные после ультразвуковой дезинтеграции бактерий, стимулировали продукцию специфических антител.
Протективная эффективность иммунного ответа в условиях интраназальной пневмококковой инфекции у иммунных мышей коррелировала с данными иммунологического анализа. Уровень защиты был выше в группе, получавшей вакцину с препаратом клеточных стенок проби-отика. Существенно, что адъювантный эффект препарата проявлялся по отношению к штаммам пневмококков четырех различных серотипов, что подтверждает универсальный характер вакцины по отношению к пневмококкам с различными полисахаридными антигенами. Последнее связано с широкой специфичностью химерного рекомбинантного белка PSPF благодаря включению в его состав фрагментов поверхностных бактериальных белков с консервативной структурой, общей для большинства серотипов S. pneumoniae [21].
Иммуномодулирующее влияние L. rhamnosus L32 зависело от формы введения пробиотическо-го штамма. Наибольшей иммуностимулирующей активностью обладали живые бактерии.
Интактная форма лактобацилл усиливала секреторный ответ на PSPF. В носовых секретах после второй вакцинации происходило ускоренное накопление IgA антител. Пробиотик также
*
2016, Т. 18, № 6 2016, Vol. 18, No 6
повышал уровень специфических IgG в сыворотках крови мышей.
Клеточные стенки бактерий стимулировали специфический иммунный ответ в меньшей степени по сравнению с живой культурой. Термоинактивация полностью устраняла стимулирующий эффект аналогично L. rhamnosus CRL1505.
В отличие от PSPF иммунный ответ на реком-бинантный белок PSP практически не изменялся под влиянием совместно введенного L. rhamnosus L32, независимо от его формы. Обнаруженный феномен, возможно, объясняется тем, что в структуру PSPF входит С- и N-концевые фрагменты флагеллина, а белок PSP их не содержит. Флагеллин, структурный компонент грамотри-цательных бактерий, обладает иммуностимулирующим эффектом благодаря высокому сродству к Toll-like рецепторам 5 типа, активирующим механизмы врожденной защиты. Связываясь с TLR5 на поверхности CD11c+ антигенпред-ставляющих клеток, флагеллиновый фрагмент химерного рекомбинантного белка способен обеспечить преимущество такой молекулы в стимуляции CD4+T-зависимого гуморального иммунного ответа [15].
Ранее нами было показано, что в одинаковых условиях иммунизации рекомбинантный белок PSPF обеспечивал более высокий уровень выработки специфических IgG, чем PSP [21]. Таким образом, адъювантный эффект лактобацилл проявлялся только в отношении белка PSPF, обладавшего собственным внутренним адъювантом.
Контроль за инфекцией у мышей, иммунизированных различными вариантами вакцин, позволяет заключить, что ускорение процесса очищения тканей инфицированных животных отмечено там, где наблюдается повышенный уровень иммунного ответа. Таким образом, адъ-
Список литературы / References
1. Аверина О.В., Ермоленко Е.И., Ратушный А.Ю., Тарасова Е.А., Борщев Ю.Ю., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А., Котылева М.П., Даниленко В.Н., Суворов А.Н. Влияние пробиотиков на продукцию цитокинов в системах in vitro и in vivo // Медицинская иммунология, 2015. Т. 17, № 5. C. 443-454. [Averina O.V., Ermolenko E.I., Ratushniy A.Yu., Tarasova E.A., Borschev Yu.Yu., Leontieva G.F., Kramskaya T.A., Kotyleva M.P., Danilenko V.N., Suvorov A.N. Influence of probiotics on cytokine production in the in vitro and in vivo systems. Meditsinskaya immunologiya = Medical Immunology (Russia), 2015, Vol. 17, no. 5, pp. 443-454. (In Russ.)] http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2015-5-443-454
2. Европейское региональное бюро ВОЗ // Еженедельный эпидемиологический бюллетень, 87-й год. № 14, 2012. Т. 87. C.129-144. [European Region WHO Bureau. Ezhenedel'nyy epidemiologicheskiy byulleten' = Weekly Epidemiological Record (WER), 87year, 2012, Vol. 87, no. 14, pp. 129-144. (In Russ.)]
3. Крамская Т.А., Леонтьева Г.Ф., Грабовская К.Б., Королева И.В., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Суворов А.Н. Исследование защитных механизмов действия препарата поливалентной рекомбинантной вакцины на основе консервативных белков для профилактики инфекций, вызываемых стрептококками группы В // Медицинский алфавит, 2014. № 3. С. 95-98 (Больница). [Kramskaya T.A., Leontieva G.F., Grabovskaya K.B., Koroleva I.V., Gupalova T.V., Kuleshevitch E.V., Suvorov A.N. Evaluation of defense mechanisms of polyvalent recombinant vaccine based on conservative proteins for Streptococcus Group B diseases protection. Meditsinskiy alfavit = Medical Alfabeth, 2014, no. 3, pp. 95-98 (Hospital). (In Russ.)]
4. Baron S.D., Singh R., Metzger D.W. Inactivated Francisella tularensis live vaccine strain protects against respiratory tularemia by intranasal vaccination in an immunoglobulin A-dependent fashion. Infect. Immun., 2007, Vol. 75, pp. 2152-2162.
5. Belyakov I.M., Derby M.A., Ahlers J.D., Kelsall B.L., Earl P., Moss B., Strober W., Berzofsky J.A. Mucosal immunization with HIV-1 peptide vaccine induces mucosal and systemic cytotoxic T lymphocytes and protective immunity in mice against intrarectal recombinant HIV-vaccine challenge Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol. 95, pp. 1709-1714.
ювантный эффект пробиотических штаммов, вводимых одновременно с рекомбинантными химерными белками, повышает иммуногенность вакцины и способствует усилению устойчивости экспериментальных животных к пневмококковой инфекции.
Проведенные исследования показали, что два различных штамма L. rhamnosus были способны оказывать адъювантный эффект, проявлявшийся в усилении иммунного ответа на совместно введенный рекомбинантный химерный белок PSPF. Оба исследованных штамма теряли данное свойство после термоинактивации. Штамм L. rhamnosus L 32 был активен в интактном состоянии, клеточные стенки пробиотика также обеспечивали умеренный адъювантный эффект. Штамм L. rhamnosus CRL1505 в данной работе в форме живых бактерий не был исследован, однако его клеточные стенки обладали выраженным адъювантным эффектом. Все вышесказанное свидетельствует о том, что пробиотические лактобациллы могут быть использованы в составе мукозальных вакцин в качестве адъюван-тов, однако эта способность зависит от свойств вакцинного препарата и формы введения про-биотика.
С одной стороны, возможность избежать использования живых бактериальных культур повышает безопасность и стабильность адъюван-та. С другой стороны, исключая использование живых бактерий при иммунизации, можно потерять собственно пробиотический эффект живых культур, а именно повышение общей устойчивости организма [12]. Последнее в сочетании с усилением адаптивного иммунитета способно обеспечить усиленную защиту на пути развития пневмококковых инфекций.
Леонтьева Г.Ф. и др. Leontieva G.F. et al.
6. Bergmann-Leitner E.S., Leitner W.W. Adjuvants in the driver's seat: How magnitude, type, fine specificity and longevity of immune responses are driven by distinct classes of immune potentiators. Vaccines (Basel), 2014, no. 2, pp. 252-296.
7. Gallichan W.S., Rosenthal K.L. Long-lived cytotoxic T lymphocyte memory in mucosal tissues after mucosal but not systemic immunization. J. Exp Med., 1996, Vol. 184, pp. 1879-1890.
8. Holmgren J., Czerkinsky C. Mucosal immunity and vaccines. Nat. Med., 2005, no. 4, pp. 45-53.
9. Savelkoul H.F., Ferro V.A., Strioga M.M., Schijns V.E. Choice and design of adjuvants for parenteral and mucosal vaccines. Vaccines (Basel), 2015, Vol. 3, no. 1, pp. 148-171.
10. Jain, S., Yadav, H., Sinhá, P.R. Stimulation of innate immunity by oral administration of dahi containing probiotic Lactobacillus casei in mice. J. Méd. Food, 2008, Vol. 11, pp. 652-656.
11. Kinnear C.L., Strugnell R.A. Vaccination method affects immune response and bacterial growth but not protection in the Salmonella Typhimurium animal model of typhoid. PLoS One, 2015, Vol.10, no. 10, p. e0141356.
12. Kitazawa H., Alvarez S., Suvorov A., Melnikov V., Villena J., Sánchez B. Recent advances and future perspective in microbiota and probiotics. Biomed. Res. Int., 2015, Vol. 2015, Art. 275631.
13. Li F.V., Moon J.J., Abraham W., Suh H., Elkhader J., Seidman M.A., Yen M., Im E.-J., Foley M.H., Barouch D.H., Irvine D.J. Generation of effector memory T cell-based mucosal and systemic immunity with pulmonary nanoparticle vaccination. Sci. Transl. Med., 2013, Vol. 5, no. 204.
14. Lycke N. Recent progress in mucosal vaccine development: potential and limitations. Nat. Rev. Immunol., 2012, Vol. 12, pp. 592-605.
15. Mizel S.B., Bates J.T. Flagellin as an adjuvant: cellular mechanisms and potential. J. Immunol, 2010, Vol. 185, no. 10, pp. 5677-5682.
16. Mora J.R., Bono M.R., Manjunath N., Weninger W., Cavanagh L.L., Rosemblatt M., Von Andrian U.H. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature, 2003, Vol. 424, pp. 88-93.
17. Nizard M., Diniz M.O., Rousse H., Tran T., Ferreira L.C.S., Badoua C., Tartour E. Mucosal vaccines Novel strategies and applications for the control of pathogens and tumors at mucosal sites Mucosal immunity and vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics, 2014, Vol. 10, no. 8, pp. 2175-2187.
18. Peng S., Qiu J., Yang A., Yang B., Jeang J., Wang J.-W., Chang Y.-N., Brayton C., Roden B.S., Hung C., Wu T.-C. Optimization of heterologous DNA-prime, protein boost regimens and site of vaccination to enhance therapeutic immunity against human papilloma virus-associated disease. Cell Biosci., 2016, Vol. 6, p. 16.
19. Salva S., Villena J., Alvarez S. Immunomodulatory activity of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from goat milk: impact on intestinal and respiratory infections. International Journal of Food Microbiology, 2010, Vol. 141, pp. 82-89.
20. Suvorov A., Ustinovich I., Meringova L., Grabovskaya K., Leontieva G., Vorobieva E., Totolian A.. Construction of recombinant polypeptides based on beta antigen C (Bac) protein and their usage for protection against group B streptococcal infection. Indian J. Med. Res., 2004, pp. 228-232.
21. Suvorov A., Dukhovlinov I., Leontieva G., Kramskaya T., Koroleva I., Grabovskaya K., Fedorova E., Chernyaeva E., Klimov N., Orlov A., Uversky V. Chimeric protein PSPF, a potential vaccine for prevention Streptococcus. Vaccines and Vaccination, 2015, Vol. 6, Iss. 6.
22. Trivedi S., Ranasinghe C. The influence of immunization route, tissue microenvironment, and cytokine cell milieu on HIV-specific CD8+ T cells measured using fluidigm dynamic arrays. PLoS One, 2015, Vol. 10, no. 5, p. e012648
23. Villena J., Salva S., Núñez M., Corzo J., Tolaba R., Faedda J., Font de Valdez G., Alvarez S. Probiotics for everyone! The novel immunobiotic Lactobacillus rhamnosus CRL1505 and the beginning of social probiotic programs in Argentina. IJBWI, 2012, pp. 189-198.
24. Vorobieva E., Meringova L., Leontieva G., Grabovskaya K., Suvorov A. Analysis of recombinant group B streptococcal protein ScaAB and evaluation of its immunogenicity. Folia Microbiol., 2005, pp. 172-176.
25. WHO initiative for Vaccine Research. http://www.who.int/immunization/research/en
Авторы:
Леонтьева Г.Ф. — к.б.н., ведущий научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Крамская Т.А. — к.б.н., старший научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Грабовская К.Б. — к.м.н., старший научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Филимонова В.Ю.— научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург, Россия Лайно Джонатан — научный сотрудник лаборатории иммунобиотехнологии, Референсный центр по исследованию лактобацилл, Тукуман, Аргентина
Виллена Джулио — профессор, руководитель лаборатории иммунобиотехнологии, Референсный центр по исследованию лактобацилл, Тукуман, Аргентина Альварес Сусанна — научный сотрудник лаборатории иммунобиотехнологии, Референсный центр по исследованию лактобацилл, Тукуман, Аргентина
Даниленко В.Н. — д.б.н., профессор, заведующий отделом генетических основ биотехнологии ФГБУН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова» РАН, Москва, Россия Суворов А.Н. — д.м.н., профессор, заведующий отделом молекулярной микробиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; заведующий кафедрой фундаментальных проблем медицины и медицинской технологии, Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
Поступила 27.07.2016 Отправлена на доработку 29.08.2016 Принята к печати 01.09.2016
Authors:
Leontieva G.F., PhD (Biology), Leading Research Associate, Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Kramskaya T.A., PhD (Biology),Senior Research Associate, Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Grabovskaya K.B., PhD (Medicine), Senior Research Associate, Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Flimonova V.Yu., Research Associate, Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Jonathan Laino, Research Associate, Laboratory of Immunobiotechnology, Reference Centre for Lactobacilli (CERELA-CONICET), Tucuman, Argentina
Julio Villena, Professor, Head, Laboratory of Immunobiotechnology, Reference Centre for Lactobacilli (CERELA-CONICET), Tucuman, Argentina
Susanna Alvares, Research aAssociate, Laboratory of Immunobiotechnology, Reference Centre for Lactobacilli (CERELA-CONICET), Tucuman, Argentina
Danilenko V.N., PhD, MD (Biology), Head, Division of Fundamental Genetic Studies in Biotechnology, Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation Suvorov A.N., PhD, MD (Medicine), Head, Division of Molecular Microbiology, Research Institute of Experimental Medicine, St. Petersburg, Russian Federation
Received 27.07.2016 Revision received 29.08.2016 Accepted 01.09.2016
