CC BY
30
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 5 (54)/2010
Сравнительное изучение адъювантных свойств различных форм хитозана при мукозальной вакцинации живой и инактивированной гриппозными вакцинами
С.Г. Маркушин ([email protected]), А.Д. Переверзев, И.Б. Коптяева,
Г.Г. Кривцов, А.С. Сухно
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва
Резюме
Проводили сравнительное изучение эффективности иммунного ответа при иммунизации мышей инактивированной и живой гриппозными вакцинами при использовании раствора глютамата хитозана и суспензии микрочастиц сульфата хитозана в качестве адъювантов. Препараты хитозана значительно повышали титр сывороточных IgG как при включении в инактивированную гриппозную вакцину, так и в комбинации с живой холодоадаптированной гриппозной вакциной (ЖХАГВ). Глютамат хитозана активнее повышал индукцию секреторных ^ у мышей, иммунизированных ЖХАГВ со штаммом-донором аттенуации А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, но обладал незначительным адъювантным эффектом при индукции секреторных ^ у мышей, иммунизированных мукозальной инактивированной гриппозной вакциной. Препараты микрочастиц сульфата хитозана обладали более выраженными адъювантными свойствами по сравнению с глютаматом хитозана. Титры секреторных ^ были заметными во всех отделах респираторного тракта и легких мышей, иммунизированных ЖХАГВ.
Ключевые слова: глютамат хитозана, сульфат хитозана, адъювант, гриппозные вакцины
Comparative Investigation of Adjuvant Properties of Different Chitosan Derivatives at Mucosal Vaccination by Live and Inactivated Influenza Vaccines
S.G. Markushin ([email protected]), A.D. Pereversev,
I.B. Koptiaeva, G.G. Krivtsov, A.S. Suchno
I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera RAMS,
Moscow
Abstract
The comparative investigation of efficacy of immune response of immunization of mice by inactivated and live influenza vaccines with using chitosan glutamate and suspension of microparticles of chitosan sulfate as adjuvants was conducted. Chitosan derivatives increased considerably the titer of serum IgG using inactivated influenza vaccines, as well as cold-adapted live influenza vaccines (CALIV). Chitosan derivatives increased more actively the induction of secretory IgA of mice, vaccinated by CALIV with strain donor of attenuation A(Н2N2)/Krasnodar/101/35/59, but have slight adjuvant effect on the induction of secretory IgA in mice, vaccinated intranasally by inactivated influenza vaccines. The microparticles of chitosan sulfate have more expressed adjuvant effect in comparison with chitosan glutamate. The titre of secretory IgA was detectable in all regions of respiratory tract and lungs of mice, vaccinated by CALIV.
Key words: glutamate chitosan, chitosan sulfate, adjuvant, influenza vaccine
Введение
Вакцинация является наиболее эффективным средством профилактики гриппозных инфекций. Помимо инактивированных гриппозных вакцин в настоящее время в нашей стране широко используются живые холодоадаптированные гриппозные вакцины (ЖХАГВ). В отличие от инактивированных гриппозных вакцин ЖХАГВ не только индуцируют нейтрализующие сывороточные ДО, но также являются стимуляторами местного иммунного ответа и вызывают иммунную защиту от дрейфовых вариантов вируса гриппа. Однако существующие живые гриппозные вакцины обладают сниженной профилактической активностью для лиц пожилого возраста. Для повышения иммуно-генности инактивированных вирусных вакцин используют адъюванты. В последнее время было показано, что инактивированные гриппозные вакцины можно использовать при мукозальном введении, применяя адъюванты, в частности катионный полисахарид есте-
ственного происхождения - хитозан [4, 9- 11]. Хи-тозан также был успешно использован в качестве адъюванта при парентеральном введении инактивированных гриппозных вакцин [6, 7]. Созданы предпосылки для использования хитозана как эффективного адъюванта при интраназальной иммунизации ЖХАГВ. Были продемонстрированы адъювантные свойства различных форм хитозана, включая растворы солей хитозана и 1\1-триметилхитозана, хитозановые наночастицы и микрочастицы [5, 7, 8, 12, 13, 17], в комбинации с различными вакцинами.
Цель настоящего исследования - провести сравнительное изучение эффективности адъювантных свойств различных форм хитозана при интраназальной иммунизации ЖХАГВ, а также сравнить эффективность иммунного ответа при интраназальной иммунизации ЖХАГВ и инактивированной гриппозной вакциной при использовании хитозана в качестве мукозо-адгезивного адъюванта.
Материалы и методы
Вирусы. В работе использовалась ЖХАГВ в виде штамма А(Н2И2)/Краснодар/101/35/59, полученного путем длительных пассажей в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах при субоптимальной температуре [2].
В качестве инактивированной гриппозной вакцины применялась инактивированная расщепленная вакцина Ваксигрипп (Sanofi Pasteur, Франция).
Как антиген при проведении ИФА с вакциной Ваксигрипп использовали производственный штамм вируса гриппа человека A(H1N1)/IVR-116.
Хизотан. В качестве адъювантов для гриппозных вакцин были взяты глютамат хитозана (М.В. 300 кДа), деацетилированного на 85% (в конечной концентрации - 0,5%) в 0,2 М глютаматном буфере (рН 6,2) [3], а также микрочастицы сульфата хитозана диаметром 1000 - 3000 нМ. Микрочастицы были получены путем добавления к раствору хитозана сульфата натрия (25 мМ) - фактора, способствующего разделению фаз. В экспериментах применяли 0,5% суспензию микрочастиц хитозана в 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,14 М NaCl.
В работе использовали беспородных мышей весом 10- 12 г. При интраназальной иммунизации мышей ЖХАГВ к различным дозам (1010 - 1050 ЭИД^/0,05 мл) добавляли 1% раствор глютамата хитозана (рН 6,2), чтобы получить 0,5% концентрацию соли хитозония с глютаминовой кислотой. Мышей под легкой эфирной анестезией интраназально иммунизировали двукратно различными дозами ЖХАГВ с хитозаном и без него, вводя по 25 мкл в каждую ноздрю. Вторую иммунизацию проводили на 21-й день после первой. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь и затем препарировали, извлекая различные отделы респираторного тракта и легкие. При иммунизации инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп мышам вводили под эфирным наркозом 0,05 мл вакцины, содержащей 0,75 мкг вирусного белка каждого се-ротипа и 0,5% глютамата хитозана или 0,5% суспензии микрочастиц сульфата хитозана в конечной концентра-
ции. В контрольных экспериментах препараты хитозана заменяли физиологическим раствором.
Эвтаназию мышей проводили согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных.
ИФА для определения вирус-специфических IgG и IgA проводили по описанной методике [17] в 96-лу-ночных планшетах (Corning Incorporated 3591), которые предварительно сенсибилизировали 400 ГАЕ/0,1 мл концентрированного и очищенного вируса A(H1N1)/IVR-116 или концентрированного и очищенного А(Н^1)/Краснодар/101/35/59. За конечное разведение принимали наивысшее значение оптической плоскости образца при 490 нм, превышающее средний показатель в контрольных образцах более чем на три стандартных отклонения. Достоверность различий устанавливали с помощью двувыборочного t-теста Стьюдента при Р < 0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе нашей работы было проведено сравнительное изучение адъювантных свойств раствора глютамата хитозана и суспензии микрочастиц сульфата хитозана при интраназальной иммунизации мышей штаммом-донором аттенуации А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59. С этой целью десятикратные разведения вируссодержащей жидкости штамма-донора аттенуации, содержащие в конечной концентрации 0,5% раствор глютамата хитозана или 0,5% суспензию микрочастиц сульфата хитозана, вводили двукратно интраназально лабораторным животным и сравнивали титр сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию в РТГА. Как видно из таблицы 1, введение различных форм хитозана в состав живой гриппозной вакцины приводило к существенному повышению титра сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию. При интраназальной иммунизации ЖХАГВ в сочетании с 0,5% суспензией микрочастиц сульфата хитозана титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, были несколько выше (см. табл. 1). Следует отметить, что
Таблица 1.
Сравнение адъювантных свойств 0,5% раствора глютамата хитозана и 0,5% суспензии микрочастиц сульфата хитозана в конечной концентрации при интраназальной иммунизации мышей ЖХАГВ (штамм-донор А(Н2^)/Краснодар/101/35/59)
Доза вакцинного материала (ЭИД5О/0,05 мл) Титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, у мышей, иммунизированных различными дозами ЖХАГВ с добавлением различных форм хитозана
добавление р-ра глютамата хитозана добавление суспензии микрочастиц сульфата хитозана контроль (добавление физ. р-ра)
104 0 1:320 1:640 1:80
103 0 1:320 1:320 1:40
102 0 1:80 1:160 * 4
1010 1:40 1:80 Н.д.
* Не делали.
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 5 (54)/2010
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 5 (54)/2010
существенное повышение титра сывороточных антител наблюдалось при интраназальном введении незначительных количеств живого вакцинного вируса.
На следующем этапе работы мы попытались сравнить эффективность иммунного ответа при интраназальном введении мышам инактивированной гриппозной вакцины и ЖХАГВ. С этой целью были исследованы титры сывороточных ДО и секреторных ДО у мышей, интраназально иммунизированных инактивированной вакциной Вакси-грипп и ЖХАГВ со штаммом-донором аттенуации А(Н2И2)/Краснодар/101/35/59. Как видно из таблицы 2, титры сывороточных ДО-антител у мышей, иммунизированных гриппозными вакцинами, содержащими адъювант, как инактивированной, так и живой, намного превосходили титры у иммунизированных аналогичными вакцинами без адъюванта. При этом следует отметить, что титр ДО при иммунизации ЖХАГВ несколько превышал таковой у мышей, иммунизированных интраназаль-но инактивированной гриппозной вакциной. Из данных, представленных в таблице 2, видно, что живая холодоадаптированная гриппозная вакцина в комбинации с глютаматом хитозана намного активнее повышает продукцию секреторных ДО по
сравнению с инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп, также содержащей адъювант. Эти факты указывают на слабый адъювантный эффект хитозана в отношении продукции секреторных ДО при его комбинации с инактивированной гриппозной вакциной и ставят под сомнение перспективность мукозального применения адъювантных инактивированных гриппозных вакцин.
На заключительном этапе работы было проведено сравнительное исследование наличия секреторных ДО в различных отделах респираторного тракта у мышей, иммунизированных живой и инактивированной гриппозными вакцинами с хи-тозаном и без хитозана. Полученные данные представлены в таблице 3. Согласно ей, распределение секреторных антител в различных отделах респираторного тракта и в легких было неравномерным. Высокая концентрация секреторных ДО-антител наблюдалась в легких, а самая низкая - в трахее. Таким образом, ЖХАГВ в сочетании с адъювантом индуцирует значительное повышение титра секреторных ДО-антител во всех отделах респираторного тракта и в легких, в то время как инактивированная гриппозная вакцина индуцирует образование секреторных антител преимущественно в носоглотке и легких.
Таблица 2.
Иммунный ответ у мышей, иммунизированных интраназально инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп и ЖХАГВ (штамм А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59) с адъювантом и без него
Вакцины Титры сывороточных 1д0 у иммунизированных мышей в ИФА Титры секреторных 1дА у иммунизированных мышей в ИФА
Ваксигрипп 0,75 мкг/0,05 мл + физ. р-р 1:800 1:200
Ваксигрипп 0,75 мкг/0,05 мл + 1% р-р глютамата хитозана 1:12 000 1:400
ЖХАГВ - 105 ЭИД50/0,05 мл + физ. р-р 1:1600 1:400
ЖХАГВ - 105 ЭИД50/0,05 мл + 1% р-р глютамата хитозана 1:25 000 1:3200
Контроль (неиммунизированные мыши) < 1:200 < 1:100
Таблица 3.
Сравнение индукции секреторных IgA при интраназальном введении мышам ЖХАГВ (штамм-донор аттенуации А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59) и инактивированной гриппозной вакцины Ваксигрипп с адъювантом и без него
Материал от иммунизированных мышей Титры секреторных 1дА у мышей, иммунизированных интраназально ЖХАГВ Титры секреторных 1дА у мышей, иммунизированных интраназально вакциной Ваксигрипп
с добавлением глютамата хитозана без добавления глютамата хитозана с добавлением глютамата хитозана без добавления глютамата хитозана
Носоглотка 1:160 1:40 1:40 < 1:20
Трахея 1:80 1:40 < 1:20 < 1:20
Легкие 1:6400 1:1600 1:80 1:80
Выводы
В данной работе мы попытались сравнить эффективность иммунного ответа при использовании инактивированной и живой гриппозных вакцин в сочетании с одним и тем же адъювантом - глю-таматом хитозана. Из полученных нами данных следует, что хитозан значительно повышает титр сывороточных ^-антител как при включении в инактивированную гриппозную вакцину, так и в комбинации с живой гриппозной холодоадаптированной вакциной. Однако что касается секреторных ^-антител, то хитозан значительно активнее повышает их индукцию у мышей, иммунизированных ЖХАГВ (А/Краснодар/101/35/59), обладая незначительным адъювантным эффектом при индукции секреторных ^ у мышей, иммунизированных мукозально инактивированной гриппозной вакциной.
При сравнении адъювантного эффекта раствора глютамата хитозана (рН 6,2) и суспензии микро-
частиц сульфата хитозана в отношении индукции сывороточных антител, ингибирующих гемагглюти-нацию, было выявлено некоторое преимущество суспензии микрочастиц сульфата хитозана. Однако объективные данные о сравнительной адъювантной эффективности этих двух форм хитозана можно будет получить только после детального изучения стимуляции всех звеньев иммунного ответа у вакцинированных животных. В частности, имеются многочисленные сведения о существенной стимуляции клеточного звена иммунного ответа при использовании в качестве адъювантов для вирусных вакцин микрочастиц различных полимеров, в том числе и хитозана [1, 14, 15].
Изучение индукции секреторных ^ при интра-назальном введении мышам ЖХАГВ и инактивированной вакцины показало, что титры секреторных ^ были существенно выше во всех отделах респираторного тракта и легких мышей, иммунизированных ЖХАГВ. ш
Литература
1. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А. и др. Влияние хитозана на иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей при иммунизации инактивированной противогриппозной вакциной // ЖМЭИ. 2008. № 6. С. 31 - 35.
2. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Акопова И.И. и др. Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа А(Н2N2)/Краснодар/ 101/35/59 для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины. Патент № 2354695 РФ.
3. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Кривцов Г.Г. и др. Способ повышения иммуногенности инактивированной гриппозной вакцины. Патент № 2323742 РФ.
4. Bacon A., Makin J., Sizer PJ. et al. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 5764 - 5770.
5. Воrges O., Silva M., de Sousa A. et al. Alginate coated chitosan nanoparticles are an effective subcutaneous adjuvant for hepatitis B surface antigen // Int. Immunopharmacol. 2008. V. 8. P. 1773 - 1780.
6. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G., Akopova I. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. 2008. V. 153. P. 831 - 837.
7. Ghendon Y., Markushin S., Vasiliev Y. et al. Evaluation of properties of chi-tosan as an adjuvant for inactivated influenza vaccines administered parenterally // J. of Medical Virology. 2009. V. 81. P. 494 - 506.
8. Hagenaars N., Verheul R.J., Mooren I. et al. Relationship between structure and adjuvanticity of N-trimethyl chitosan (TMC) structural variants in a nasal influenza vaccine // J. Control Release. 2009. V. 140. P. 126 - 133.
9. Illum L., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M. et al. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 51. P 81 - 96.
10. Illum L. Nasal drug delivery - possibilities, problems and solutions // J. Control Release. 2003. V. 87. P. 187 - 198.
11. Illum L. Nanoparticulate systems for nasal delivery of drugs: a real improvement over simple systems // J. Pharm. Sci. 2007. V. 96. P 473 - 483.
12. Kang M.L., Cho C.S., Yoo H.S. Application of chitosan microspheres for nasal delivery of vaccines // Biotechnol. Adv. 2009. V. 27. P 857 - 865.
13. Khatri K., Goyal A.K., Gupta PN. Plasmid DNA loaded chitosan nanoparticles for nasal mucosal immunization against hepatitis B // Int. J. Pharm. 2008. V. 354. P. 235 - 241.
14. Peluso G., Petillo O., Ranieri M. et al. Chitosan mediated stimulation of macrophage function // Biomaterials. 1994. V. 15. P. 1215 - 1220.
15. Porporatto C., Bianco I.D., Correa S.G. Local and systemic activity of the poplysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration // J. Leukocyte Biology. 2005. V. 78. P. 715 - 723.
16. Prego C., Paolicelly P., Diaz B. et al. Chitosan based nanoparticles for improving immunization against hepatitis infection // Vaccine. 2010. V. 28. V. 2607 - 2614.
17. Rowe T., Abernathy R., Hu-Primmer J. et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serological assays // J. Clin. Microbiology. 1999. V. 37. P. 937 - 943.
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 5 (54)/2010
