CC BY
31
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
© о.В. сундуков, и.А. тулаева, Е.А. Зубанов
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
Дизруптивным отбором при инб-редном размножении были получены чувствительные и резистентные линии обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae Koch. к малатиону, бифентрину, абамектину и бромпропилату. Резистентных к малатиону клещей скрещивали с резистентными клещами других полученных линий. самок межлинейных гибридов сравнивали по уровням смертности с клещами из гомозиготных линий, проявлявших резистентность к какому-либо из этих инсектоака-рицидов. тестирование проводили посемейно диагностическими концентрациями токсикантов. смертность межлинейных гибридов во всех вариантах скрещиваний была в 2 раза выше, чем у гомозиготных клещей с геном резистентности только к действующему инсекто-акарициду. полученные результаты дают основание заключить, что взаимодействие генов резистентности у межлинейных гибридов паутинных клещей к инсектоакари-цидам различных химических классов происходит по эпистатическому типу. ген резистентности к действующему токсиканту оказывается гипостатическим.
C ключевые слова: паутинный клещ; резистентность; инсектоакарицид; генотип.
Поступила в редакцию 25.07.2015 Принята к публикации 18.03.2016
УДК 632.95.025.8:577.153 DOI: 10.17816/ecogen14127-33
эпистатическое взаимодействие генов резистентности к акарицидам у межлинейных гибридов обыкновенного паутинного клеща
ВВЕДЕНИЕ
Сроки возможного использования инсектоакарицидов для борьбы с вредными членистоногими в значительной мере связаны с преодолением постоянно формирующейся к ним устойчивости у объектов, против которых эти химические средства применяются. Успешно противодействовать быстрому развитию резистентности у вредных членистоногих можно посредством познания генетических и биохимических механизмов, лежащих в основе процессов адаптивной эволюции, происходящих у них под действием химических обработок (Croft, De Baan., 1988; McKenzie, Batterham, 1994, 1998). С этой целью проведены генетические и токсикологические эксперименты с линиями обыкновенного паутинного клеща, отселектированными по факту наличия или отсутствия признака резистентности к инсектоакарицидам различных химических классов, а также с межлинейными гибридами, полученными при скрещивании клещей этих линий.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на гомозиготных линиях обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae Koch., избирательно резистентных к какому-либо из выбранных инсектоакарицидов — малатиону, бифентрину, абамектину или к бромпропилату, а также на гибридах различных вариантов скрещивания клещей этих линий. Гомозиготные линии получены методом дизруптивного отбора при инбредном размножении (Сундуков и др., 2014, 2015).
Токсикологическое тестирование сопоставляемых генотипов проводили методом окунания отсчитанных и посаженных на кусочек кормового растения клещей в раствор диагностических (двукратно увеличенных значений СК95 для чувствительных к токсиканту клещей) весовых (в %) концентраций инсектоакарицидов, рассчитанных по действующему веществу препарата. Были использованы препаративные формы токсикантов — малатиона (50 % к. э. 1 карбофоса), бифентрина (10 % к. э. талстара), абамектина (1,8 % к. э. верти-мека) и бромпропилата (50 % к. э. неорона).
Учет смертности клещей проводили через сутки после окунания их в раствор токсиканта. На третьи сутки результат проверяли. Выживавшие после такой обработки особи считались имеющими ген резистентности к использованному инсектоакарициду.
Расчет среднелетальных концентраций и СК95 проведен методом пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону (Беленький, 1959). Статистическая обработка результатов токсикологических экспериментов — определение ошибки среднеарифметических значений процента смертности, а также ко-
1
— концентрат эмульсии.
эффициента относительного рассеивания вариант, выполнена по формулам
v=
Sp (%) = Sp (%)
4
p(100 -p) .
: 100 (Урбах, 1964).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Самки тетраниховых клещей спариваются только в момент их выхода из линочной шкурки с оказавшимися в этот момент около них самцами. Сперматозоиды, полученные самкой при осеменении, сохраняются в течение жизни в семяприемнике и выходят из него по мере появления очередной созревшей яйцеклетки. Из оплодотворенных яйцеклеток развиваются диплоидные самки, а из неоплодотворенных — гаплоидные самцы. Самки количественно регулируют половую принадлежность особей в воспроизводимых ими генерациях путем оплодотворения определенной части откладываемых яиц. Соотношение самок и самцов с геном резистентности к ма-латиону в потомстве одной самки из инбредной линии, дизруптивно отобранной по признаку 100 % устойчивости к малатиону, представлено в таблице 1.
Вариабельность количества чувствительных к токсиканту самок — без гена резистентности к малатиону —
Таблица 1
процентное соотношение выживающих самок и самцов при тестировании их диагностической концентрацией малатиона в семьях дочернего инбредного поколения одной резистентной к малатиону самки
Тетраниховые клещи относятся к наиболее вредоносным объектам сельскохозяйственных культур. Партено-генетический способ их размножения по типу арреното-кии и очень короткий срок онтогенетического развития позволяет им чрезвычайно быстро наращивать численность в осваиваемых биотопах.
Семьи Кол-во самок Смертность самок (%) Кол-во самцов Смертность самцов (%)
1 26 7,7 5 40,0
2 24 4,2 6 50,0
3 31 9,7 - -
4 18 16,7 9 44,4
5 22 9,1 - -
6 12 8,3 - -
7 17 11,8 5 100,0
8 22 0 - -
9 24 0 6 50,0
10 12 25,0 12 41,7
11 15 6,7 9 55,6
12 19 5,3 - -
13 12 0 5 60,0
14 23 13,0 5 20,0
15 25 4,0 - -
16 12 8,3 17 47,1
17 15 33,3 4 100,0
18 19 15,8 12 58,3
19 10 30,0 4 25,0
20 16 6,3 6 50,0
21 25 8,0 7 85,7
22 12 16,7 - -
23 26 7,7 5 40,0
24 14 14,3 - -
25 20 15,0 7 57,1
26 12 25,0 - -
27 14 21,4 - -
28 11 9,1 - -
29 14 28,6 - -
Е522 х=11,1±1,37 у=12,3±0,37 Е124 х=54,4±4,47 у=8,2±0,52
Таблица 2
Процентное соотношение самок, выживающих при действии диагностической концентрации малатиона, в семьях 20—29 и 30—39 инбредных поколений дизруптивного отбора резистентной и чувствительной к нему линий обыкновенного паутинного клеща_
Резистентная линия Чувствительная линия
семей самок(n) смертность (%) v (%) семей самок(n) смертность (%) v (%)
21 238 18,9 ± 2,5 9 75 84,0 ± 4,2
31 387 13,7 ± 1,7 6 49 95,9 ± 2,8
32 480 15,2 ± 1,6 8 79 86,1 ± 3,9
36 557 16,0 ± 1,5 8 85 92,9 ± 2,8
39 548 20,1 ± 1,7 8 81 85,2 ± 3,9
41 678 43,5 ± 1,9 5 55 74,5 ± 5,8
25 389 24,1 ± 2,2 10 101 66,3 ± 4,7
24 359 32,9 ± 2,5 8 79 79,7 ± 4,5
23 299 52,2 ± 2,9 9 86 75,6 ± 4,6
29 447 41,1 ± 2,3 5 50 82,0 ± 5,4
Z301 Z4382 х = 27,8 ± 2,1 7,5 ± 0,08 Z76 Z740 х = 82,2 ± 4,2 5,1 ± 0,13
29 551 10,9 ± 1,3 8 77 76,6 ± 4,8
24 488 14,1 ± 1,6 11 109 97,2 ± 1,6
37 880 18,1 ± 1,3 14 135 89,6 ± 2,6
28 451 16,4 ± 1,7 13 128 82,0 ± 3,4
36 704 11,3 ± 1,2 10 85 100
25 347 16,4 ± 2,0 9 89 89,9 ± 3,2
27 426 37,8 ± 2,3 10 97 99,0 ± 1,0
35 585 14,3 ± 1,4 9 87 94,2 ± 2,5
27 437 18,3 ± 1,8 15 154 92,9 ± 2,1
21 329 20,7 ± 2,2 13 128 90,6 ± 2,6
Z289 Z5198 х = 17,8 ± 1,7 9,5 ± 0,09 Z91 Z1089 х = 91,2 ± 2,4 2,6 ± 0,05
в семьях нового потомства составляла от 0 до 30 %, а у самцов — от 20 до 100 %.
Анализ распределения генов резистентности к ма-латиону в большой выборке клещей — 20 инбредных поколениях дизруптивного отбора показал, что общее количество самок без гена резистентности к токсиканту составляет в среднем около 20 % (табл. 2). Такое состояние гомозиготности селектируемых линий клеща вызывает необходимость экспериментировать с большими выборками и оценивать результаты по среднестатистическим показателям.
Для получения межлинейных гибридов и возможной сопоставимости их по фенотипическим показателям проявлений признака резистентности к различным токсикантам была взята в качестве базовой резистентная к малатиону линия клещей. Показатель резистентности (ПР) клещей этой линии после 40 поколений дизруптивного отбора был определен равным 1111 ± 54,1. Этот показатель являлся частным от деления среднеле-тальных концентраций для самок устойчивой (0,5 ± 0,01; п = 225) и чувствительной (0,00045 ± 0,00002; п = 238) к малатиону линий.
По результатам гибридологического анализа выяснено, что признак резистентности к малатиону у клещей является доминантным. В поколении F1 скрещивания
самок и самцов резистентной и чувствительной линий с последующим тестированием гибридных самок диагностической концентрацией малатиона распределение по уровням смертности гибридных самок было таким же, как и в резистентной родительской линии (рис. 1).
При возвратном скрещивании гибридных самок F1 с самцом чувствительной линии в семьях поколения F выявлены две группы дочерних особей после тестирования их диагностической концентрацией малатиона. Такое распределение гибридных самок по уровню смертности в зонах доминантного и рецессивного наследования признака резистентности (см. рис. 1) возможно лишь при моногенном его наследовании с комбинациями гамет у самок Rs и ss.
Молекулярным маркером наличия признака резистентности к малатиону у единичных самок паутинных клещей, как было показано выше (Сундуков и др., 2014), является значительно более высокая, чем у самок чувствительной к этому токсиканту линии, активность одной из множественных молекулярных форм карбоксилэстеразы.
Полученные показатели перекрестной резистентности (ППР) клещей резистентной к малатиону линии для бифентрина и абамектина свидетельствовали о полном отсутствии сходства биохимических механизмов устойчивости к этим токсикантам. Среднелетальные концен-
Обработка клещей резистентной и чувствительной к малатиону линий набором различных концентраций бромпропилата показала некоторое сходство механизмов противодействия отравлению этим токсикантом и малатионом. Среднелетальная концентрация бром-пропилата для резистентных к малатиону самок была в 30 раз более высокой, чем для клещей чувствительной к малатиону линии (см. табл. 3).
Вариантами различных комбинаций скрещивания резистентных к малатиону клещей с клещами, отселек-тированными по факту проявления признака резистентности к бифентрину, абамектину и бромпропилату, исследован характер взаимодействия у межлинейных гибридов генов резистентности к этим токсикантам. Сопоставление проводили по токсикологическим показателям при дифференцированной обработке получаемых генотипов клещей диагностическими концентрациями инсектоакарицидов.
Среднестатистический показатель процента смертности межлинейных гибридов с генами резистентности к малатиону и к бифентрину от диагностической концентрации малатиона (табл. 4) был в реципрокных вариантах скрещивания в 1,5—2 раза выше, чем у самок
Таблица 3
показатели перекрестной резистентности к бифентрину, абамектину и бромпропилату устойчивых к малатиону самок обыкновенного паутинного клеща
Действующий токсикант Среднелетальные концентрации (СК50, %) Показатели перекрестной резистентности (СК50 R / СК50 s)
линия s-малатион линия R-малатион
Бифентрин 0,00015 ± 0,00005 0,0001 ± 0,00003 0,6 ± 2,7
Абамектин 0,000085 ± 0,000005 0,00015 ± 0,00002 1,7 ± 2,5
Бромпропилат 0,0001 ± 0,00001 0,003 ± 0,0002 30 ± 3,6
Таблица 4
смертность межлинейных гибридных самок обыкновенного паутинного клеща с различными комбинациями аллелей резистентности в геноме от диагностических концентраций инсектоакарицидов
Действующий токсикант Варианты скрещивания Кол-во семей Кол-во $$ Смертность $$ (х ± Sp, %) Коэффициент вариации (v, %)
малатион $ R-мал х S r-биф 28 275 26,8 ± 5,9 2,7 ± 0,26
$ r-биф х S R-мал 28 219 32,8 ± 6,6 3,2 ± 0,15
Бифентрин $ R-мал х S r-биф 30 252 80,2 ± 5,0 2,5 ± 0,11
$ r-биф х S R-мал 26 241 75,0 ± 5,7 2,8 ± 0,13
малатион $ R-мал х S R -абам 25 1б7 27,1 ± 6,0 3,4 ± 0,19
$ R-абам х S R-мал 28 179 38,1 ± 6,2 3,6 ± 0,19
Абамектин $ R-мал х S R-абам 22 219 б0,3 ± 5,5 3,3 ± 0,16
$ R-абам х S R-мал 19 1б0 б7,7 ± б,1 3,7 ± 0,20
малатион $ R-мал х S r-бром 26 203 33,8 ± 5,6 3,3 ± 0,16
$ r-бром х S R-мал 34 2б8 37,9 ± 5,6 2,9 ± 0,13
Бромпропилат $ R-мал х S r-бром 26 194 б9,5 ± 5,1 3,3 ± 0,17
$ r-бром х S R-мал 34 322 б1,8 ± 4,8 2,7 ± 0,10
100
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 i—R (17) —ь [10) — F 1(10) —o-Fa(lî) Смертность, %
Рис. 1. Гибридологический анализ распределения семей по уровням смертности самок в родительских — чувствительной (S) и резистентной (R) к малатиону линиях, а также гибридов поколения Ft и возвратного скрещивания F|j после обработки диагностической концентрацией малатиона. В скобках указано количество взятых семей
трации бифентрина и абамектина для самок и чувствительной (s), и резистентной (R) к малатиону линии были статистически одинаковыми (табл. 3).
Рис. 2. Распределение по уровням смертности межлинейных гибридных самок с генами резистентности к малатиону и к бифентрину после обработки диагностической концентрацией малатиона. В скобках указано количество взятых семей
Рис. 3. Распределение по уровням смертности межлинейных гибридных самок с генами резистентности к малатиону и к бифентрину после обработки диагностической концентрацией бифентрина. В скобках указано количество взятых семей
родительской линий с геном резистентности только к малатиону (см. табл. 2).
При действии на таких же гибридных самок диагностической концентрацией бифентрина их среднестатистическая смертность увеличивалась более чем в 2 раза (см. табл. 4), по сравнению с уровнем смертности самок (28,9 ± 5,0 %) в линии клещей с признаком резистентности только к бифентрину (Сундуков и др., 2015).
Увеличение процента смертности межлинейных гибридных самок от диагностических концентраций токсикантов по сравнению с клещами гомозиготных линий, проявлялось также при совмещении в их геноме аллелей резистентности к малатиону и аба-мектину, малатиону и бромпропилату (см. табл. 4). Среднестатистическое значение процента смертности самок от диагностической концентрации абамектина в линии клещей с геном резистентности только к этому токсиканту составляло 29,4 ± 4,0 %, а при действии бромпропилата в отселектированной на устойчивость к нему линии — 26,6 ± 2,3 % (Сундуков и др., 2015).
Уровень смертности гибридных самок различался в зависимости от того, совмещались ли в геноме клещей доминантные аллели резистентности (к малатиону) с рецессивными аллелями химически неродственного по механизму действия токсиканта (см. табл. 3) — бифентрина или с доминантными аллелями резистентности также совершенно неродственного по токсическому действию соединения — абамектина. Процент смертности гибридных самок с генами резистентности к малатиону и к бифентрину от диагностической концентрации бифентрина был существенно выше, чем от диагностической концентрации абамектина у гибридов с генами резистентности к малатиону и к абамектину (см. табл. 4).
Достоверных различий в проценте смертности межлинейных гибридных самок от диагностических концентраций токсикантов в вариантах реципрокных скрещиваний, когда одни и те же аллели резистентности оказывались в геноме гибридных особей от диплоидных самок или от гаплоидных самцов, не выявлено (см. табл. 4).
Графический анализ количественного распределения по уровням смертности гибридных самок с совмещенными аллелями резистентности к малатиону и к бифентри-ну выявил различия в проявляющейся у них ответной физиологической реакции на отравление отдельно каждым из этих токсикантов. При обработке таких межлинейных гибридов диагностической концентрацией малати-она основная масса выживающих самок располагалась в зоне доминантного наследования признака (рис. 2), как в поколении F1 гибридологического скрещивания клещей чувствительной и резистентной к этому токсиканту линий (см. рис. 1).
При обработке таких же гибридных самок с аллелями резистентности к малатиону и к бифентрину диагностической концентрацией бифентрина процентные градации выживающих в семьях особей (рис. 3) соответствовали расположению кривой поколения F1, получаемого от скрещивания резистентностых и чувствительных к бифентрину клещей (Сундуков и др., 2014), в области рецессивного наследования признака.
Эти результаты позволяют заключить, что характер физиолого-биохимической ответной реакции на отравление гибридных самок обыкновенного паутинного клеща с совмещенными в геноме аллелями резистентности к ин-сектоакарицидам различного механизма действия зависит только от того, какой из токсикантов действует на них в каждом конкретном случае. Присутствующие в геноме межлинейных гибридов аллели резистентности к инсекто-
32
генетическая токсикология
акарициду с другим физиологическим механизмом токсического эффекта подавляют фенотипическое выражение гена устойчивости к действующему токсиканту.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Чередование применяемых для защиты сельскохозяйственных культур от вредных членистоногих ин-сектоакарицидов с различными механизмами токсического действия считается способом, затрудняющим формирование резистентных к ним популяций. Такая антирезистентная стратегия по устоявшемуся представлению, приводит к появлению мультиустойчивых форм вредителей с кумулятивным эффектом устойчивости ко всем компонентам системы в ротационной схеме химических обработок (Leeuwen et al., 2004; Roush, McKenzie, 1987).
Как свидетельствуют полученные экспериментальные данные, взаимодействие аллелей резистентности в геноме межлинейных гибридов обыкновенного паутинного клеща является не комплементарным, а эпи-статическим. Во всех скомбинированных совмещениях генов резистентности к токсикантам различного механизма действия как минимум в полтора раза увеличивается смертность межлинейных гибридов при отравлении их любым инсектоакарицидом, аллели резистентности к которому присутствуют в геноме гибридных клещей, по сравнению с гомозиготными особями, имеющими ген резистентности только к этому токсиканту.
Экстраполируя полученные сведения на проводимые в сельскохозяйственной практике защитные мероприятия можно утверждать, что при замене используемого против членистоногих инсектоакарицида на препарат с другим механизмом токсического действия первоначально всегда будет выявляться ожидаемый удовлетворительный токсический эффект. Высокий уровень резистентности к какому-либо из токсикантов проявится при существенном сдвиге популяционного баланса генотипов в сторону увеличения количества гомозиготных по этому признаку особей. Быстрота такого генотипиче-ского преобразования популяции будет зависеть от числа проводимых каждым инсектоакарицидом обработок и количества сезонных генераций вида, против которого направлены истребительные мероприятия. Биология и партеногенетический способ размножения тетран-иховых клещей дают им преимущества по сравнению с другими членистоногими для быстрого наращивания численности и ускоренного развития устойчивости к любому пестициду.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки
фармакологического эффекта. Рига: АН Латв. ССР,
1959. [Belenkiy ML. Elements of quantitative estimate
of pharmacological action. Riga: AN Latv. SSR; 1959. (In Russ).]
2. Суцдуков О.В., Тулаева И.А., Зубанов Е.А. Наследование признаков резистентности к акарицидам в инбред-ных линиях обыкновенного паутинного клеща // Экол. генетика. — 2014. — Т. 12. — № 3. — С. 43-51. [Sundukov OV, Tulaeva IA, Zubanov YA. Ecol. Genetics. 2014;12 (3):43-51. (In Russ).]
3. Сундуков О.В., Тулаева И.А., Зубанов Е.А. Проявление признаков резистентности к инсектоака-рицидам в инбредных линиях обыкновенного паутинного клеща при дизруптивном отборе // Экол. генетика. — 2015. — Т. 13. — № 3. — С. 76-84. [Sundukov OV, Tulaeva IA, Zubanov Y A. Ecol. Genetics. 2015;13(3):78-84. (In Russ).]
4. Урбах В.Ю. Биометрические методы. — М.: Наука, 1964. [Urbah VY. Biometrical methods. Moscow: Nau-ka; 1964. (In Russ).]
5. Croft BA, De Baan HE van. Ecological and genetic factors influencing evolution of pesticide resistance in tetranychid and phytoseid mites. Exp Appl Acarol. 1988;4:277-300. doi: 10.1007/BF01196191.
6. Leeuwen T van, Stillatus V, Tirry L. Genetic analysis and cross-resistance spectrum of a laboratory-selected chlorfenapyr resistant strain of two-spotted spider mite (Acari: Tetranychidae). Exp Appl Acarol. 2004;32:249-261. doi: 10.1023/B:APPA.0000023240.01937.6d.
7. McKenzie JA, Batterham P. The genetic, molecular and phenotypic consequences of selection for insecticide resistance. Trends Ecol Evol. 1994;9:166-169. doi: 10.1016/0169-5347(94)90079-5.
8. McKenzie JA, Batterham P. Predicting insecticide resistance: mutagenesis, selection and response. Philos Trans Royal Sos Lond B. 1998;353:1729-1734. doi: 10.1098/rstb.1998.0325.
9. Roush RT, McKenzie JA. Ecological genetics of insecticide and acaricide resistance. Ann Rev En-tomol. 1987;32:361-380. doi: 10.1146/annurev. en.32.010187.002045.
epistatic interaction of resistance
GENES TO acaricides IN INTERLINE HYBRIDS OF TWO-SPOTTED SPIDER MITE
O.V. Sundukov, ¡.A. Tulaeva, E.A. Zubanov
C SuMMARY: background. Study of the genetic bases of pesticide resistance of arthropods for sustainable rational pest control is important. materials and methods. The disruptive selection cycles were conducted with inbred arrhenotokous reproduction of two-spotted spider mites Tetranychus urticae Koch. The resistant and susceptible lines of two-spotted spider mites to malathion, bifenthrin, abamectin and bromopropylate were obtained. The tests were performed by diagnostic concentrations of toxicants. Results. The resistant spider mites to malathion were crossed with resistant spider mites to bifenthrin, abamectin and bromopropylate. Mortality of interline hybrids
in all variants of crosses were 2 times higher than mortality of spider mites with the gene resistance only to the current toxicant. conclusion. The interaction of resistance genes to various toxic compounds in interline hybrids of spider mites is the type of epistasis. The resis-
tance gene to the current pesticide in heterogeneous spider mites is hypostatic.
C KEYWORDS: spider mite Tetranychus urticae; resistance; pesticide; genotype.
C Информация об авторах
олег Вениаминович сундуков — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ФГБНУ ВИЗР). E-mail: [email protected].
Мрина Анатольевна тулаева — канд. биол. наук, научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ФГБНУ ВИЗР). E-mail: [email protected].
Евгений Александрович Зубанов — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, лаборатория экотоксикологии. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ФГБНУ ВИЗР). E-mail: [email protected].
Oleg V. Sundukov — PhD, Senior scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection (FSBSI VIZR). E-mail: [email protected].
Irina A. Tulaeva — PhD, scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection (FSBSI VIZR). E-mail: [email protected].
Evgeniy A. Zubanov — scientist, Laboratory ecotoxicology. All-Russian Institute of Plant Protection (FSBSI VIZR). E-mail: [email protected].
