CC BY
50
Кузник Б. И.1, Хавинсон В. X.2,3, Тарновская С. И.3, Линькова Н. С.3
1 ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», г. Чита;
2 Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН, Санкт-Петербург;
3 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН
ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ НА ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ И СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА
Многочисленные исследования, проведенные нами и нашими сотрудниками (Хавинсон В. Х. и др., 1982-2012; Кузник Б. И. и др., 1982-2012; Патеюк А. В. и др., 1990-2012), показали, что регуляторные пептиды (РП) — тималин, вилон, эпиталамин, эпиталон, кортексин и др. — при введении больным с различной патологией способствовали ликвидации вторичных иммунодефицитов, восстанавливали баланс в содержании про- и противовоспалительных цитокинов, а также нормализовали состояние системы гемостаза. Приведенные факты свидетельствовали о том, что существуют общие механизмы действия РП на гуморальные защитные системы организма. Одним из таких механизмов могло быть эпигенетическое влияние РП на систему иммунитета и гемостаза.
Для проверки высказанной гипотезы из базы данных GenBank [Benson D.A., Karsch-Mizrachi]
нами были взяты нуклеотидные последовательности генов провоспалительных (1Ь-1а, 1Ь-6, 1Ь-17 А, ТОТ а), противово спалительных (1Ь-4, 1Ь-10), гемопоэтических (1Ь-3) и иммунных (1Ь-2, 1Ь-5) цитокинов, генов тканевого фактора (TF), антитромбина III (АТ-111), протеина С (РС), плазми-ногена (Р1), тканевого (1>РА), и урокиназного (и-РА) активаторов плазминогена, а также ингибитора активатора плазминогена-1 (РА1-1). Изучалось наличие сайтов связывания в промотор-ных зонах указанных генов с РП, обладающими геропротекторными и иммуномодулирующими свойствами: Ьу8^1и (вилон) и А1а^1и-А8р^1у (эпиталон).
Оказалось, что Ьу8^1и способен взаимодействовать с генами про- (1Ь-6, 1Ь-17А и ТОТа) и противовоспалительных цитокинов (1Ь-4 и 1Ь-10), а также иммунного цитокина 1Ь-5. А1а-G1u-Asp-G1y, кроме того, может вступать во вза-
«ПАТОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА — ОБЩЕКЛИНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА» НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ___________________
имосвязь с геном IL-1a и IL-2. Последовательности нуклеотидов, вступающих во взаимодействие с Lys-Glu, представлены GCAG и в меньшей мере — CGTC, а для Ala-Glu-Asp-Gly — ATTTC, TAAAC, ATTTG, CTTTG и TAAAG. Число сайтов связывания для Lys-Glu и Ala-Glu-Asp-Gly в гене IL-6 одинаково; в гене TNFa для Lys-Glu в 2,5 раза, а IL-17A — в 2 раза больше, чем для Ala-Glu-Asp-Gly. Число последовательностей, связывающихся с Ala-Glu-Asp-Gly, в генах IL-4 и IL-10 в 2-3 раза превышает число таковых для Lys-Glu. Число последовательностей в гене IL-5, способных реагировать с Ala-Glu-Asp-Gly, в 10 раз превышает содержание таковых для Lys-Glu. В промоторной зоне гена IL-2 не содержатся сайты связывания к Lys-Glu, тогда как к Ala-Glu-Asp-Gly их число достигает 16. Наконец, для дипептида Lys-Glu в промоторном участке гена IL-3 имеется два сайта связывания, представленные последовательностями ATTTG и TAAAG, и три сайта связывания для тетрапептида Ala-Glu-Asp-Gly, являющиеся GACG. Сайтов связывания исследуемых пептидов в промо-торных участках генов IL-8, IL-16, IL-18 и IL-33 нами не найдено.
Установлено, что важнейшим фактором жирового перерождения артериальной стенки является цитокин из семейства аларминов HMGB1 (High-mobility group box chromosomal protein 1), поддерживающий хроническое воспаление в атеросклеротической бляшке. Одновременно под воздействием HMGB1 падает уровень тромбо-модулина, являющегося ингибитором HMGB1, что, наряду с возрастанием экспрессии TF, способствует развитию гиперкоагуляции и тромботических осложнений.
Нами установлено, что в промоторном участке гена HMGB1 отсутствуют сайты связывания для тетрапептида, но имеется 10 последовательностей нуклеотидов для взаимодействия с Lys-Glu, представленные CGTC, GACG, GCAG. В меньшей степени находятся сайты связывания для дипептида Lys-Glu в промоторах генов HMGB2, HMGB3 и HMGB4. Однако в промоторных участках генов HMGB2 и HMGB4 имеются единичные последовательности для взаимодействия с пептидом Ala-Glu-Asp-Gly.
После сенсационной публикации в 2011 г. в журнале «Nature» коллектива авторов, руководимых Tony Wyss-Coray, стало ясно, что регулятором процесса старения и когнитивных функций является хемокин CCL11. В то же время известно, что в процессе старения развивается гиперкоагуляция и тормозится фибринолиз. Нами
не обнаружено сайтов связывания в гене ССЫ1 для тетрапептида A1a-G1u-Asp-G1y, но выявлено пять последовательностей для взаимодействия с дипетидом Lys-G1u, представленные сайтом GCAG. Следовательно, дипептид Lys-G1u претендует на роль регулятора гена ССЬ11.
Исследуемые нами РП способны взаимодействовать с последовательностями нуклеотидов генов TF, АТ-111 и РС. Сайтами связывания в гене TF для Lys-G1u являются последовательности GCAG и комплементарная ей CGTC, а для A1a-G1u-Asp-G1y — CAAAG, СТЛА, САААГ, GTTTC и СТЛА. Сайты связывания в гене АТ-111 для A1a-G1u-Asp-G1y представлены последовательностями АУЛС, GTTTC, TAAAG, СТЛА и CTTTG, а для Lys-G1u — лишь GCAG, встречаемый всего один раз. В промоторном участке гена РС сайтами связывания для A1a-G1u-Asp-G1y служат последовательности: ATTTG, СЛААХ, ATTTG, а для Lys-G1u — GCAG. Во всех промо-торных участках исследуемых генов, имеющих отношение к фибринолизу, были найдены специфические сайты связывания для обоих исследуемых пептидов. Вместе с тем, сайтами связывания для дипептида Lys-G1u в промоторах всех исследуемых генов является GCAG, комплементарный ему GACG, а для тетрапептида А1а-ОЫ-Asp-G1y в генах р1 и 1-РА — А^ПС, TAAAG, в гене ^РА — СТЛА АХ^С, а в гене РА1-1 — АЛТС и СГГГС.
Влияние РП Lys-G1u и A1a-G1u-Asp-G1y на состояние клеточного и гуморального иммунитета проявляется путем непосредственного действия на иммунокомпетентные клетки, а также на выделяемые ими цитокины. Гораздо сложнее механизм действия исследуемых РП на систему гемостаза. В экспериментах на животных, а также в наблюдениях на пациентах с сердечнососудистыми, инфекционными, эндокринными и другими заболеваниями установлено, что Lys-G1u и A1a-G1u-Asp-G1y ликвидируют явление гиперкоагуляции и вторичной гипокоагуляции, а также стимулируют фибринолиз. Подобный эффект может быть объяснен усилением экспрессии генов — АT-III, РС, Р1, 1-РА и ^РА и супрессией генов TF и РАН.
Известно, что провоспалительные и иммунные цитокины, а также НМОВ и, возможно, ССЬ11, усиливают экспрессию TF, но приводят к супрессии протеогликанов и тромбомодулина эндотелиальными клетками, тогда как противовоспалительные цитокины — ГЬ-4 и ГЬ-10 обладают прямо противоположным эффектом. Восстановление нормального баланса между концентрацией про-
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том IX, № 4, 2013
и противовоспалительных, а также иммунных ци-токинов, наблюдаемое под воздействием Lys-Glu и Ala-Glu-Asp-Gly, является существенным фактором, приводящим к норме состояние системы гемостаза при самых различных заболеваниях.
Полученные нами данные подтверждают предположение, что полипептиды Lys-Glu и Ala-Glu-Asp-Gly являются эпигенетическими регуляторами системы гемостаза и цитокинового статуса.
Макаров М. С., Ларин А. Г., Боровкова Н. В., Хватов В. Б.
ГБУЗ «НИИ скорой помощи имени Н. В. Склифосовского», Москва
А ДГЕЗИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ В РАЗНЫХ ОТДЕЛАХ СОСУДИСТОГО РУСЛА ПАЦИЕНТОВ С ТРОМБОЗАМИ БЕДРЕННЫХ АРТЕРИЙ
Цель исследования. Провести морфофункциональный анализ адгезивной активности тромбоцитов из разных отделов сосудистого русла пациентов с тромбозами бедренных артерий.
Методы. Исследовали образцы артериальной, капиллярной и венозной крови, консервированной на CPD (1:7), у 10 доноров (контроль) и 10 пациентов с тромбозами бедренных артерий на фоне острой ишемии нижней конечности. Забор крови у пациентов проводили непосредственно перед процедурой ангиографии. Для анализа тромбоцитов использовали метод оценки морфофункционального статуса тромбоцитов (Патент № 2485502 от 20.06.2013), который основан на окрашивании тромбоцитов витальным флуо-рохромным красителем с последующей оценкой их морфофункциональных параметров с помощью флуоресцентного микроскопа. Анализируемые параметры включали: относительное содержание тромбоцитов с гранулами ^тр.гр.) (%); морфофункциональную активность тромбоцитов (МФАТ) (в баллах); адгезивную активность тромбоцитов на стекле (ААТ) (в баллах). Для запуска адгезии пробу с витально окрашенными тромбоцитами на предметном стекле экспонировали при 37 °С в течение 30 мин. В ходе адгезии тромбоцитов на стекле происходит распластывание этих клеток, постепенное смещение гранул к периферии тромбоцитов, связывание гранул с клеточной оболочкой и выброс гранул за пределы тромбоцитов (дегрануляция), сопровождающиеся формированием тромбоцитами многочисленных отростков. ААТ оценивали по доле тромбоцитов, достигших конечной стадии адгезии, через 30 минут экспозиции на стекле. Динамику адгезии и дегрануляции тромбоцитов крови пациентов оценивали с интервалом в 2-3 минуты.
Результаты. У обследованных доноров не выявлено значимых различий по относитель-
ному содержанию тромбоцитов с гранулами и МФАТ в разных отделах сосудистого русла. Такой же эффект отмечен и у пациентов с тромбозами бедренных артерий. Вместе с тем, у пациентов с тромбозами бедренных артерий значения Dтр.гр. и МФАТ были значительно повышены ф<0,01), составляя в среднем 81,2±2,0 % и 68,3±2,1 баллов, в то время как у доноров значения этих параметров составляли соответственно 57,1±7,8 % и 48,6±5,8 баллов.
У доноров динамика адгезии и дегрануляции тромбоцитов на стекле была одинаковой во всех отделах сосудистого русла. Дегрануляция всех тромбоцитов с гранулами в крови доноров наступала в среднем через 29,9±0,5 мин, при этом значение ААТ составило 55,7±6,5 баллов. В то же время у пациентов с тромбозами бедренных артерий в артериальной крови отмечена более высокая скорость адгезии тромбоцитов с гранулами — полная дегрануляция всех тромбоцитов с гранулами в артериальной крови указанных пациентов наступала через 20,5±0,5 мин. В капиллярной крови этих же пациентов полная дегрануляция всех тромбоцитов наступала через 30,0±0,8 мин, что сопоставимо с аналогичным показателем у доноров. Напротив, в венозной крови пациентов с тромбозами бедренных артерий скорость адгезии была сниженной, вследствие чего полная дегрануляция всех тромбоцитов с гранулами наступала через 36,5±2,5 мин ф<0,01). При этом значения ААТ в артериальной и капиллярной крови составили в среднем 80,5 баллов, в венозной крови — 74,5 баллов. Необходимо подчеркнуть, что в артериальной крови пациентов с тромбозами бедренных артерий отмечено повышенное содержание больших округлых клеток диаметром 4,5-5 мкм, содержавших 10-20 крупных гранул (“тромбоциты ранней стадии активации”). Доля таких клеток во всей популяции тромбоцитов с гра-
