CC BY
35
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^0Ha№H0ro ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0H0riH iMeHi C.3. f^u^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7152
ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
Epidemiological studies towards cattle babesiosis - tick-borne disease
Marta Staniec, Krzysztof Buczek, Andrzej Milczak*, Lukasz Adaszek, Stanislaw Winiarczyk
marta.staniec@up.lublin.pl
Department of Epizootiology and Clinic of Infectious Diseases, Department and Clinic of Domestic Animals Internal Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, University of Life Sciences in Lublin
Cattle babesiosis is a dangerous and economically important tick-borne disease caused by hemoprotozoan parasites of the genus Babesia. The vector of the disease are ticks from Ixodidae family. Symptoms of disease are fever, anorexia, lethargy, anemia, jaundice and hemoglobinuria.
The purpose of this study was to investigate prevalence of Babesia spp. in cattle in Lublin region. The PCR technique revealed the presence of 18S RNA Babesia spp. genetic material in the blood of 20 from 192 examined animals (10.4%). Our study showed that the bovine babesiosis occur in Poland with asymptomatic form and does not reduce milk production significantly. The diagnosis depends only on the basis of detection of the genetic material ofparasite, and the direct microscopic examination of blood smears is not useful in the identification of Babesia spp. in erythrocytes.
The comparison of PCR products showed low homology level between isolates with present study and other Babesia sequences obtained around the world.
Moreover, the study showed the prevalence ofpiroplasms in ticks from Lublin region is low (0,63%).
Key words: cattle, babesiosis, piroplasmosis, tick-borne diseases
Citation:
Marta Staniec, Krzysztof Buczek, Andrzej Milczak, Lukasz Adaszek, Stanislaw Winiarczyk (2016). Epidemiological studies towards cattle babesiosis - tick-borne disease. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 3(71), 228-239.
Wst^p
Babeszjoza bydla, nazywana takze piroplazmoz^, jest grozn^ choroby pasozytnicz^ powodowan^ przez pierwotniaki z rodzaju Babesia, nalez^ce do rodziny Babesidae, rz^du Piroplasmida, typu Apicomplexa. Wektorem choroby s^ kleszcze z rodziny Ixodidae (1). Pierwotniaki wprowadzone do organizmu kr^gowca namnazaj^ si§ wyl^cznie w erytrocytach, powoduj^c ich rozpad i rozwoj anemii. Babeszjoza wyst^puje u wielu gatunkow ssakow, zas najwi^ksze straty ekonomiczne powoduje w poglowiu bydla (2).
Najistotniejszym czynnikiem etiologicznym choroby s^ trzy gatunki pierwotniakow: B.bovis, B.bigemina i B.divergens, ktorych zasi^g wyst^powania jest scisle uzalezniony od obecnosci wektora na danym terenie. Obraz kliniczny choroby jest bardzo zroznicowany -zazwyczaj odnotowuje si§ wzrost cieploty ciala, utrat§ apetytu, oslabienie, zaburzenia ze strony przewodu pokarmowego, zas w ci^zszych przypadkach niewydolnosc wielonarz^dow^ i objawy nerwowe, a nawet smierc. Najbardziej charakterystycznymi objawami jest bladosc, a nast^pnie zazolcenie blon sluzowych oraz
hemoglobinuria. Dosc cz^sto dochodzi takze do rozwoju subklinicznej postaci choroby (2, 3, 4, 5).
Podstawow^, choc malo wiarygodn^ metod§ diagnostyczn^, stanowi^ barwione rozmazy krwi, w ktorych poszukuje si§ erytrocytow zaj^tych przez merozoity Babesia spp (2). Zalecanymi metodami diagnostycznymi s^ reakcja lancuchowej polimerazy (PCR), test immunoflourescencji (IFT) oraz test immunoenzymatyczny ELISA (6, 7, 8).
Najskuteczniejszymi substancjami leczniczymi s^ imidokarb i diminazen, wykazuj^ce jednoczesnie dzialanie profilaktyczne (2, 5). Procz chemioprofilaktyki babeszjozy, istotnym elementem w zapobieganiu chorobie jest zwalczanie jej wektora oraz prowadzenie szczepien (9, 10, 11).
Waznym aspektem choroby jest odpornosc stada oraz opornosc rasowa. Ponadto, ze wzgl^du na odpornosc siarow^ oraz naturaln^ odpornosc wrodzon^, ciel^ta s^ mniej wrazliwe na zachorowanie (12, 13). Po przechorowaniu babeszjozy utrzymuje si§ z reguly zarazenie latentne z parazytemi^ na bardzo niskim poziomie, chroni^ce przed ponownym zachorowaniem
przy zarazeniu tym samym szczepem (tzw. odpornosc towarzysz^ca) (14).
Straty zwi^zane z wystçpowaniem babeszjozy u bydla wynikaj^ przede wszystkim ze spadku mlecznosci, obnizenia przyrostow wagi, ronien, przejsciowego obnizenia plodnosci oraz pogorszenia ogolnego statusu zdrowotnego zwierz^t. Nalezy jednak brac rowniez pod uwagç inny aspekt ekonomiczny, tj. koszty diagnostyki, leczenia i profilaktyki, wydatki zwi^zane ze zwalczaniem kleszczy, regulacje ograniczaj^ce transport zwierz^t, czy obnizenie jakosci skor (3, 15, 16).
Cel pracy
Choroby transmisyjne, m.in. borelioza i kleszczowe zapalenia mozgu, stanowi^ coraz istotniejszy problem medyczny i weterynaryjny w Polsce i na swiecie. Sposrod chorob transmisyjnych wystçpuj^cych w naszym kraju najwiçkszy problem stanowi obecnie babeszjoza psow, brak jest jednak aktualnych danych dotycz^cych wystçpowania babeszjozy bydla. Wyniki uzyskane w badaniach wlasnych umozliwily wstçpn^ ocenç sytuacji epidemiologicznej i wplywu zarazen na tle Babesia spp. na oplacalnosc produkcji. Ponadto badania molekularne pozwolily na porownanie zaleznosci filogenetycznych polskich izolatow do izolatow wystçpuj^cych w innych regionach swiata.
Materialy i metody
ZWIERZÇTA OBJÇTE BADANIAMI
Do badan wl^czono 192 krowy. W grupie tej przewazaly osobniki rasy nizinnej czarno-bialej z dolewem krwi holsztynsko-fryzyjskiej H-F (179 zwierz^t). Pozostale 13 zwierz^t nalezalo do rasy czerwono-bialej. Krowy pochodzily z 87 obor zlokalizowanych na terenie wojewodztwa lubelskiego. Najliczniej reprezentowane byly male stada hodowcow indywidualnych, z ktorych pobrano 83 pojedyncze probki. Pozostale zwierzçta chowane byly w 4 stadach (I-IV) licz^cych powyzej 50 krow. Liczba osobnikow zbadanych w poszczegolnych gospodarstwach I, II, III i IV wynosila odpowiednio: 56, 15, 17 i 21. Wiek badanych krow wahal siç od 46,03 do 101,05 miesiçcy i wynosil srednio 66,9 miesi^ca. Wszystkie przebadane osobniki prezentowaly typ uzytkowy mleczny, a w momencie badan byly w fazie laktacji. Zwierzçta przebywaly w prawidlowych warunkach zoohigienicznych i otrzymywaly dobrej jakosci paszç dostosowan^ do cyklu produkcyjnego.
MATERIAL DO BADAN
Podstawowy material do badan stanowily pelna krew pobrana od badanych zwierz^t oraz surowica uzyskana przez odwirowanie.
Ponadto w 9 zroznicowanych typach stanowisk przeprowadzono w okresie wiosenno-letnim odlow kleszczy metody flagowania. Zebrane pajçczaki poddano ocenie taksonomicznej oraz okreslono ich stadium rozwojowe.
BADANIE HEMATOLOGICZNE I
BIOCHEMICZNE KRWI
Peln^ krew poddano badaniu hematologicznemu oraz wykonano z niej rozmaz barwiony metody Giemzy, ktory ogl^dano w mikroskopie Olympus BX 41, pod okularem
o powi^kszeniu 10x i obiektywem imersyjnym o powi^kszeniu 100x. W badaniu biochemicznym surowicy krwi oznaczono aktywnosc aminotransferazy asparaginowej (AST), aminotransferazy alaninowej (ALT), y-glutamylotransferazy (GGT), st^zenie bilirubiny calkowitej (BIL T), aktywnosc fosfatazy zasadowej (AP), st^zenie mocznika (UREA) i kreatyniny (CREA), st^zenie bialka calkowitego (TP) oraz st^zenie cholesterolu calkowitego (CHOL). Zostaly takze okreslone poziomy pierwiastkow: wapnia (CALC), fosforu (PHOS) i magnezu (MG).
BADANIA MOLEKULARNE
W celu przeprowadzenia reakcji PCR wykonano izolaj DNA z pelnej krwi przy uzyciu zestawu Blood Mini (A&A Biotechnology Gdynia) oraz z kleszczy przy pomocy zestawu Genomic Mini (A&A Biotechnology Gdyni) wedlug procedur podanych przez producenta.
W reakcji PCR wykorzystano startery RLB F2 i RLB R2, komplementarne do wysoce konserwatywnych sekwencji genu 18S RNA calego rodzaju Babesia/Theileria, co pozwolilo na amplifikaj odcinka DNA o dlugosci 390-430 par zasad. Warunki reakcji opracowano wedlug Altay i wsp. (17), z uzyciem kontroli dodatniej i ujemnej. Kazda reakcja skladala si§ z 40 cykli, w ktorych etap denaturacji przebiegal w 94°C przez 35 s., przyl^czanie starterow odbywalo si§ w temp. 51 °C przez 35 s., a wydluzanie nici w temp 72°C trwalo 36 s. Sklad mieszaniny reakcyjnej zostal ustalony w toku optymalizacji st^zen poszczegolnych skladnikow. Najlepsze wyniki uzyskiwano przy st^zeniu starterow 50 pm/|l oraz koncowych st^zeniach dNTP - 100 |M, MgCl2 - 1,6 mM, Taq polimerazy - 2,5 jednostki.
Produkty uzyskane w wyniku reakcji PCR przeanalizowano metody elektroforezy w 1% zelu agarozowym, zanurzonym w buforze TBE przy napi^ciu 100 mV przez 50 min. Po wybarwieniu produktow amplifikacji bromkiem etydyny okreslano ich wielkosc w odniesieniu do wzorca masowego GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder. Uzyskane produkty amplifikacji DNA przed sekwencjonowaniem oczyszczono na kolumienkach za pomoc^ zestawu QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) wedlug zalecen producenta, a nast^pnie poddano sekwencjonowaniu
w Pracowni Sekwencjonowania DNA i Syntezy Oligonukleotydow Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie. Wyniki sekwencjonowania opracowano za pomoc^ programu komputerowego LaserGene DNA Star - przeanalizowano sekwencje izolatow wlasnych i porownano je z odpowiadaj^cymi im sekwencjami izolatow uzyskanymi z banku genow.
OCENA WYDAJNOSCI MLECZNEJ
Wydajnosc mleczn^ oceniano w gospodarstwie I. Porownano wyniki osi^gni^te w grupie 8 zarazonych zwierz^t z wynikami 26 zwierz^t niezarazonych b^d^cych w 1, 2 i 3 laktacji, b^d^cych w zblizonym wieku i stanie fizjologicznym. Ocenie poddano nast^puj^ce parametry: wydajnosc mleka w przeliczeniu na 305 dni laktacji, zawartosc tluszczu, bialka i suchej masy w mleku za 305 dni laktacji, dzienn^ wydajnosc mleka a takze zawartosc tluszczu, bialka i suchej masy w mleku dobowym.
SPEKTROMETRIA MAS
Do badan metod^ spektrometrii mas wybrano losowo 5 próbek pochodz^cych od zwierz^t zarazonych i 5 od niezarazonych. Kazd^ z przygotowanych prób analizowano w trzykrotnym powtórzeniu. Kolekcjç widma wykonano w spektrometrze mas ultrafleXreme (Bruker Daltonics GmbH Brema, Niemcy) z laserem na ciele stalym Nd:YAG (granat itrowo-glinowy domieszkowany jonami neodymu (Nd3+), pracuj^cym impulsowo, z czçstotliwosci^ 1000 Hz w zakresie nadfioletu (X = 355 nm) i pozwalaj^cym na ustawienie skupienia wi^zki w zakresie ok. 10-100 ^m. Do celów pomiarowych srednica plamki lasera wynosila 12 ^m. W kazdy spot oddano 5000 strzalów z ustawieniem trybu pracy „random walk" przy 50 strzalach w jedno miejsce. Uzyskane wyniki zostaly poddane obróbce w programie flexAnalysis, gdzie po zastosowaniu skryptów do wygladzenia widma i ujednolicenia linii bazowej otrzymano spektrum gotowe do okreslenia liczby pików spelniaj^cych kryterium sygnalu do szumu > 6 i geometriç pików okreslanych metod^ „Centroid".
METODY ANALIZY STATYSTYCZNEJ
Dla badanych parametrów wyliczono sredni^ statystyczn^ i odchylenie standardowe oraz istotnosci róznic pomiçdzy grupami i podgrupami badanych zwierz^t. Normalnosc rozkladu danych oceniano metod^ Shapiro-Wilka. Istotnosci róznic dla badanych zmiennych oceniano wykorzystuj^c test rang Whitneya-Manna. Zaleznosci pomiçdzy zmiennymi w obrçbie
poszczegolnych grup badano wyznaczaj^c wspolczynniki korelacji wg Spearmana. Analiza statystyczna i graficzna prezentacja danych zostala przeprowadzona przy wykorzystaniu programu Statistica 10.0 i arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel 2010.
Wyniki
BADANIA KLINICZNE I LABORATORYJNE
Zwierzçta, od ktorych pobierano material do badan, zostaly poddane badaniu klinicznemu. Zaden z osobnikow nie wykazywal klinicznych objawow choroby.
Oceny parametrow hematologicznych dokonano na probkach pobranych od 192 osobnikow, w tym od 20 zarazonych, ktore byly pozytywne w tescie PCR w kierunku Babesia spp. i 172 niezarazonych, u ktorych wynik testu byl negatywny.
Parametry ukladu czerwonokrwinkowego oraz srednia liczba plytek krwi miçdzy grup^ zwierz^t niezarazonych oraz zarazonych nie wykazywaly roznic istotnych statystycznie. Roznice istotne statystycznie (p=0,03) dotyczyly jedynie liczby leukocytow (ryc. 1) - w probkach pochodz^cych od zwierz^t niezarazonych wynosila ona 8,16 x 109/l (SD 2,05), zas w grupie zwierz^t zarazonych byla wyzsza i wynosila 8,73 x 109/l (SD 2,86). Zestawienie wartosci uzyskanych w badaniu hematologicznym przedstawiono w tabeli 1 oraz na rycinie 2.
16
14
12
10
o m
Wykr. ramka-wasy wzgledem grup Zmierma: WBC
NZ
Grupa
□ Niediana
□ 25%-75% Ivtin-Maks
Rycina 1. Graficzne przedstawienie istotnosci róznic liczby leukocytow miçdzy grupami zwierz^t niezarazonych i
zarazonych Babesia spp.
Objasnienia: WBC - liczba leukocytów; NZ - grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych.
Parametry hematologiczne u zwierz^t niezarazonych i zarazonych Babesia spp
RBC HCT HGB MCV MCH MCHC WBC PLT
norma 5,00-10,00 24,0-46,0 8,0-15,0 40,0-60,0 11,0-17,0 31,0-38,5 4,0-12,0 100-800
jednostka 1012/l % g/dl fl pg g/dl 109/l 109/l
NZ x 6,35 27,06 10,14 42,90 16,10 37,87 8,16 240,89
SD 1,04 4,24 1,35 5,70 1,74 1,54 2,05 146,93
Z x 5,96 26,46 9,93 44,57 16,72 37,75 8,73 211,20
SD 0,38 3,79 1,10 6,99 2,04 1,54 2,86 64,73
Objasnienia: x - srednia statystyczna; SD - odchylenie standardowe; NZ - grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt
zarazonych.
Rycina 2. Parametry hematologiczne u zwierz^t niezarazonych i zarazonych Babesia spp.
Objasnienia: NZ- grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych.
Badanie biochemiczne surowicy krwi wykonano u osobników z gospodarstw I-IV, l^cznie u 109 zwierz^t, w tym u 10 zarazonych, które byly pozytywne w tescie PCR kierunku Babesia spp. i 99 niezarazonych, u których
wynik tego testu byl negatywny. Róznice istotne statystycznie stwierdzono jedynie w przypadku pomiaru aktywnosci ALP (p=0,002) oraz st^zenia MG (p=0,08) (ryc. 3 i 4).
2B0 260 2« 220 200 ieo 1W 5 uc 123 100 60 eo w 20 0 Wyii. iBmstB-WB.sy nvz-g I ^d Em fjfup ZmiEnna: ALF
—■ -
I _ I
□ Me diana □ 25%-7E% X Min-Mate
NZ Z Grupa
Rycina 3. Graficzne przedstawienie istotnosci róznic aktywnosci fosfatazy zasadowej mi^dzy grupami zwierz^t
niezarazonych i zarazonych Babesia spp.
Objasnienia: ALP - aktywnosc fosfatazy zasadowej; NZ - grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych.
Wyfa. 'anrua-wasy -YzgIndern -gfup Zmitnna: MG
12
10
i »
N Z
Grupa
□ MEdiana
□ 25%-75W
I Min-Mate
Rycina 4. Graficzne przedstawienie istotnosci róznic st^zenia magnezu mi^dzy grupami zwierz^t niezarazonych i
zarazonych Babesia spp.
Objasnienia: MG - st^zenie magnezu; NZ - grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych. Zestawienie parametrów biochemicznych surowicy uzyskanych w badaniach przedstawiono w tabeli 2 oraz na rycinie 5.
Tabela 2.
AST ALT BIL T GGT CHOL ALP UREA CREA TP MG PHOS CALC
norma 58-100 25-74 0,10-0,4( 22-64 70-201 41-116 10,0-45,( 1,00-2,10 5,10-7,10 1,90-3,00 5,60-6,50 9,00-12,10
jednostka U/l U/l mg/dl U/l mg/dl U/l mg/dl mg/dl g/dl mg/dl mg/dl mg/dl
NZ x 83,44 36,55 0,34 36,69 154,43 67,92 28,26 1,35 8,07 3,14 6,21 10,22
SD 40,52 16,91 0,14 17,51 52,54 40,35 12,44 0,52 1,94 1,59 1,48 1,28
Z x 86,40 36,20 0,36 35,80 156,40 36,90 23,22 1,23 8,90 4,41 5,77 9,81
SD 39,10 16,96 0,11 19,69 53,69 12,53 8,32 0,47 0,96 1,37 0,93 0,64
Objasnienia: x - srednia statystyczna; SD - odchylenie standardowe; NZ - grupa zwierz^t niezarazonych; Z - grupa zwierz^t zarazonych.
160
140
120
100
80
60
40
20
AST ALT BIL T GGT CHOL ALP UREA CREA TP
MG PHOS CALC
□ NZ □ Z
Rycina 5. Parametry biochemiczne surowicy u zwierz^t niezarazonych i zarazonych Babesia spp..
Objasnienia: NZ- grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych.
ROZMAZ KRWI
0
Z kazdej probki krwi wykonano barwiony rozmaz krwi, ktory nast^pnie poddano ocenie mikroskopowej. W zadnym z ocenianych preparatow nie stwierdzono obecnosci merozoitow w erytrocytach, ani tez cech mog^cych posrednio wskazywac na aktywn^ inwazj§ piroplazm, tj. maloplytkowosci i anizocytozy plytkowej.
Na 9 stanowiskach odlowiono l^cznie 975 osobnikow kleszczy - 657 osobnikow nalezalo do gatunku Dermacentor reticulatus, a 318 do gatunku Ixodes ricinus. Do dalszych badan przeznaczono przedstawicieli I.ricinus - w grupie tej znalazlo si§ 28 osobnikow doroslych i 290 nimf (tab. 3). Wsrod postaci doroslych przewazaly samice (21/28).
KLESZCZE
Liczba kleszczy I.ricinus odtowionych w roznych typach siedlisk.
Tabela 3.
Rodzaj stanowiska Lokalizacja Osobniki dorosle Nimfy
samce samice
Lqki/pastwiska Gospodarstwo I 2 5 72
Gospodarstwo II - 1 20
Gospodarstwo III 1 1 35
Gospodarstwo IV - 2 27
Okolice Lublina - 1 11
Bor sosnowy swiezy Pojezierze L^czynsko-Wlodawskie 1 5 44
Las mieszany Roztocze 1 3 51
Okolice Lublina 1 1 25
Srodowisko synurbijne Ogrod Botaniczny UMCS 1 2 5
Razem 7 21 290
BADANIA MOLEKULARNE Wsrod przebadanych 192 osobnikow, badaniem PCR obecnosc materialu genetycznego Babesia/Theileria wykazano w organizmach 20 zwicrzqt. co stanowi 10.4%
przebadanej puli. Produkty uzyskane w wyniku reakcji PCR zostaly przeanalizowane metod^ elektroforezy w 1% zelu agarozowym, zanurzonym w buforze TBE (ryc. 6).
M K* K+ 40 56 57 69 83 145 155
Rycina 6. Wyniki badania probek krwi metod^ PCR na obecnosc materialu genetycznego Babesia/Theileria. Produkty amplifikacji genu 18S RNA ze starterami RLB F2 i RLB R2. Sciezki: M-marker masowy GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder 100bp.; 1-kontrola ujemna; 2-kontrola dodatnia; probki numer 40, 56, 57, 69, 83, 145 i 155.
Najwi^kszy odsetek zarazen odnotowano w gospodarstwie I, gdzie obecnosc DNA Babesia/Theileria wykryto we krwi 8 osobnikow, co stanowi 14,3% zwierz^t przebadanych w tym gospodarstwie. W gospodarstwach II i III zarazeniu uleglo po jednym zwierz^ciu (odpowiednio 6,7% i 5,9% osobnikow). W gospodarstwie IV nie wykazano prob pozytywnych. Pozostale 10 dodatnich probek pochodzilo od osobnikow od hodowcow indywidualnych, co stanowilo 12% tej puli zwierz^t.
20 produktow reakcji PCR poddano sekwencjonowaniu, a uzyskane sekwencje przeanalizowano w programie komputerowym LaserGene DNA STAR. Porownanie uzyskanych sekwencji nukleotydow izolatow uzyskanych w badaniach wlasnych przy pomocy programu DNA Star MegAligne pozwolilo ustalic stopien ich wzajemnej homologii w przedziale 98,5-100,0% (ryc. 7).
Percent Identity
1 2 3 4 5 & 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1« 17 18 19 20
1 100 0 100 0 99 8 ... 19,5 19 8 1 III 00.0 99.0 100 0 ' ..... 100 0 100 0 100.0 I 11..... iooaiooo 100 0 1 sek 29
2 0.0 100 0 99.5 J-J J 99 J 100,0 99.0 99.0 ■ JJU 1 JÜÜ 1000 100.0 100.0 100 J 1UUJ 108.0 100 0 100 j 2 sek 31
3 0.0 0.0 ... )9 T 99,5 19.3 1 0.0 00.0 Min ...... 100 0 100 0 100 0 1 00 0 108.0-108.0.108.0-100 0 1 08 8 3 sek 33
4 0.2 0.2 0.2 -4:1 MM 8 1 ..... -M:: Mil:: HI!:: 44:1 99 8 99.8 99 8 99 8 99 8 99 0 99 0 99S 99 a 4 sek 37
5 0.5 0.5 0.5 0 2 100 0 -1-1:1 -1-1 5 98.5 98.5 99.5 99.5 99.5 99 5 99 5 99 5 99 r 99 r 99 5 995 5 sek 40
6 0.5 0.5 0.5 0.2 0 0 H )9 8 99.5 •ill-. •ill-. 99.5 99 5 99 5 99 5 99 5 99 5 99.Í 99.í 99 5 995 6 sek 50
7 0.2 0.2 0.2 0.0 0 2 MM:! Mil:: Mil:: 99 8 99.8 99.8 99 8 99 8 99 8 991 99: 99S 99 8 7 sek 51
:": 0.0 0.0 0.2 0.5 flflil ílílil 100 0 100 0 1000 100 0 100 0 100.0 100 oh 00.0(100 01 CO 0 8 sek 52
0> 0 1.0 1.0 1,0 1,2 1.5 1 5 1 2 1 U " Illl 99 0 99 0 99 0 99 0 99 0 990 99 O 00.0 99.0 09 0 9 sek 56
i= a) 10 1.0 1.0 1.0 1.2 1.5 1.5 1 2 1 0 00 99 0 99 0 99 0 99 0 99 0 990 99 O W 0 V: 0 V: 0 ■in sek 57
f a 11 0.0 0.0 0.0 0.2 0.5 0 5 0 2 00 ■ 0 10 100 0 1000 100 0 100 0 100.0 100 1 101C.0 100.0 10:: 11 sek 69
12 0.0 0.0 0.0 o.: 0.5 :: D 2 30 ■ 0 1.0 0.0 1000 100.0 100.0 1Ü0.0 loo: 10c: 10c: 100.0 12 sek 90
13 0.0 0.0 0.0 0.2 0 5 0 5 0 2 00 ■ 0 10 00 100 0 100 0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 13 sek 93
14 0.0 0 0 :: 0.2 0 5 0 5 0 2 00 10 10 00 00 100 0 100.0 100.0 100.4 100.0 100.0 14 sek 97
15 0.0 0.0 :: 0,2 05 05 0.2 0.0 1.0 1.0 00 0.0 00 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 15 sek 90
1IS 0.0 0.0 0.0 0.2 0 5 0 5 0 2 0.0 10 1.0 00 00 00 00 00 100 0 100.0 100.0 100.0 16 sek 93
17 0.0 0.0 0.0 0.2 0 5 0 5 0 2 0.0 10 10 00 00 00 00 00 0.0 100.0 100.0 100.0 17 sek 97
18 0.0 0.0 :: 0.2 05 05 02 00 10 10 40 40 00 00 00 0.0 04 ^■100.0 100.0 18 sek 145
1" 0.0 0.0 0.0 :: 0 5 0 5 0 2 00 ■ 0 10 00 00 00 00 00 0.0 04 0 J 100.0 19 sek155
20 0.0 0.0 0.0 0.2 :; 0 5 0.2 00 ■ 0 10 00 00 00 00 00 0.0 04 0 J :: 20 sek 95
1 2 3 4 0 6 7 8 9 10 11 12 1J 14 IS 16 17 1« 1» 20
Rycina 7. Porównanie sekwencji nukleotydowych izolatów uzyskanych w badaniach wlasnych
Analiza filogenetyczna sekwencji Babesia/Theileria uzyskanych w badaniach wlasnych pozwolila wyróznic dwie grupy pierwotniaków, które okreslono mianem A i
Dalsza analiza polimorfizmu poszczególnych sekwencji pozwolila wyróznic w obr^bie grupy A dwie grupy monofiletyczne: IA (cztery izolaty Babesia/Theileria o numerach 37, 40, 50, 51 wykazuj^ce podobienstwo wspólnej sekwencji nukleotydowej analizowanego fragmentu genu 18S RNA rz^du 99,8100%) i IIA (pozostale izolaty zakwalifikowane do grupy
33, 37, 40, 50, 51, 52, 69, 80, 83, 85, 87, 90, 93, 97, 145, 155, o wzajemnej homologii sekwencji nukleotydowych w granicach 99,5-100%, zas gdy grup§ B tworzyly dwa
A o identycznej sekwencji nukleotydowej analizowanego genu).
Róznice w sekwencjach nukleotydowych analizowanego fragmentu genu 18S RNA Babesia/Theileria izolatów grupy A oraz pomi^dzy grupami A i B ilustruje tabela 4.
B (ryc. 8). Do grupy A zakwalifikowano izolaty 29, 31, izolaty 56 i 57 o identycznej sekwencji.
0.6.
Nucleotide Subeirtutions (xlOO)
sek 40 sek 50 seh 37 sek 51 sek 29 sek 31 sek 33 sek 5? sek SO sek 83 sek 87 sek 90 sek 97 $ek 145 sek 155 sek 85 sek 95 sek 69 sek 56 sek 57
Rycina 8. Dendrogram z analizy sekwencji izolatów wlasnych
Polimorfizm amplifikowanego fragmentu 18S RNA izolatów Babesia/Theileria
Odmiany Izolaty Mutacja Pozycja
polimorficzne
Odmiana 37, 40, 50, 51 A^T 25
polimorficzna 40,50 C^G 396
IA (Grupa A)
Odmiana 29, 31, 33, 52, 69, 80, brak brak
polimorficzna 83, 85, 87, 90, 93, 97,
IIA (Grupa A) 145, 155
Grupa B 56,57 T^C 69
T^C 70
A^C 74
C^G 88
Przepisanie informacji zawartej w sekwencji nukleotydowej analizowanego fragmentu genu 18S RNA Babesia/Theileria na sekwencji aminokwasowe pozwolilo wykazac, iz mutacje w sekwencji nukleotydowej izolatów grup IA i II A byly mutacjami cichymi, natomiast w grupie B zmiany A^C i C^G w pozycjach 74 i 88 sekwencji nukleotydowej przekladaly si§ na zmiany aminokwasowe w sekwencji bialka 18S RNA w pozycjach 25 i 30, gdzie w grupie B w odniesieniu o sekwencji aminokwasowych izolatów grupy A, odpowiednio treonina zast^pila asparagin^, zas alanina proline
z\Za pomoc^ programu DNA Star MegAligne Sekwencje, sekwencje izolatów wlasnych grup filogenetycznych A i B porównano z
im sekwencjami izolatow Babesia/Theileria, dost^pnymi w bazie danych PubMed NCBI. Analiza tego porownania wykazala, ze sekwencje izolatow wlasnych grup A i B wykazuj^ wysok^ wzajemn^ homology (99%), lecz stosunkowo niskie podobienstwo (rz^du 84,2-93,1%) z sekwencjami nukleotydowymi genu 18S RNA pierwotniakow izolowanych na swiecie. Najwi^ksze podobienstwo wykazano pomi^dzy sekwencjami izolatow wlasnych (92,8% w przypadku izolatow grupy A oraz 93,1% w przypadku izolatow grupy B), a sekwencje EU 376017.
Graficznym przedstawieniem tego stanu jest drzewo filogenetyczne (ryc. 9).
■Í
6.2.
AV7Í6556 AY726557 EU376Ü1 7
— grupa A
— grupa B i- DG785311
EF458198
_i EU6229Ü7
~~' FJ426361 -AJ439713
-AY789076
— -
4 2
Nucleotide Substitutions (kIOO)
Rycina 9. Dendrogram z analizy sekwencji izolatów swiatowych dost^pnych w bazie danych i sekwencji izolatów
grupy A i B.
Na uwag§ zasluguje fakt stosunkowo niskiego wzajemnego podobienstwa analizowanych wzorcowych sekwencji swiatowych genu 18S RNA Babesia/Theileria pozyskanych z banku genow. Na przedstawionym drzewie filogenetycznym mozna wyroznic 4 odr^bne grupy monofiletyczne zlokalizowane s^ na odr^bnych gal^ziach drzewa, co jest wskaznikiem niskiej homologii ich sekwencji i posrednio moze swiadczyc o stosunkowo duzym zroznicowaniu genetycznym analizowanych pierwotniakow.
OCENA PREWALENCJI BABESIA SPP. W KLESZCZACH
Badan^ pul§ stanowilo 318 kleszczy - 28 osobnikow doroslych oraz 290 nimf podzielonych na 29 probek zbiorczych (po 10 nimf w kazdej probce). L^cznie przebadano 57 probek DNA wyizolowanego z
organizmow zebranych kleszczy. Badaniem PCR stwierdzono obecnosc materialu genetycznego Babesia sp. w 2 probkach (osobniki dorosle - samice) pochodz^cych z okolicy gospodarstwa I, co stanowi 0,63% przebadanych kleszczy .
OCENA WYDAJNOSCI MLECZNEJ
Dlugosc okresu laktacji wynosila srednio 500,68 dnia (przedzial 268 do 810 dni). Roznice w wydajnosci mlecznej za 305 dni doju oraz sredniej dobowej wydajnosci mlecznej w grupie zwierz^t zarazonych i niezarazonych byly minimalne i nieistotne statystycznie. Podobnie srednie wartosci poszczegolnych ocenianych wskaznikow charakteryzuj^cych sklad chemiczny mleka w grupie zwierz^t zarazonych i niezarazonych roznily si§ bardzo nieznacznie i nie odbiegaly od sredniej obliczonej dla calej badanej populacji (tab. 5).
Sklad chemiczny mleka zwierz^t niezarazonych i zarazonych Babesia spp.
Badany wkaznik Krowy ogóJem NZ Z
x SD min. max. x SD x SD
Za 305 dni laktacji % tluszczu 3,89 0,34 3,13 4,46 3,68 0,32 4,01 0,39
% bialka 3,07 0,18 2,71 3,53 3,08 0,19 3,05 0,18
% suchej masy 12,39 0,46 11,61 13,28 12,35 0,47 12,53 0,42
Mleko dobowe % tluszczu 3,98 0,81 2,92 5,93 3,95 0,83 4,07 0,72
% bialka 3,20 0,43 2,40 3,39 3,20 0,44 3,18 0,42
% suchej masy 12,59 1,01 10,84 14,39 12,55 1,05 12,71 0,86
Objasnienia: x - srednia statystyczna; SD - odchylenie standardowe; NZ - grupa zwierzqt niezarazonych; Z - grupa zwierzqt zarazonych
SPEKTROMETRIA MAS
Rezultaty pomiarów wykonanych za pomoc^ techniki spektrometrii mas przedstawiono na ryc. 10-13, stanowi^cych graficzn^ interpretaj widma surowicy krwi w zakresach mas 2-20 kDa i 20-100 kDa i
zawieraj^cych od 200 do 2000 istotnie statystycznych pików. Analiza rzeczonych widm nie wykazala istotnie statystycznych elementów, mog^cych swiadczyc o istnieniu czynnika rózniojcego zwierz^ta zarazone od zwierz^t niezarazonych.
miz
Rycina 10. Widmo mas w zakresie 2-20 kDa dla prób pochodz^cych od zwierz^t niezarazonych.
Rycina 11. Widmo mas w zakresie 2-20 kDa dla prob pochodz^cych od zwierz^t zarazonych.
Rycina 12. Widmo mas w zakresie 20-100 kDa dla prob pochodz^cych od zwierz^t niezarazonych.
Rycina 13. Widmo mas w zakresie 20-100 kDa dla prob pochodz^cych od grupy zwierz^t zarazonych.
Wnioski
Badania wlasne wykazaly, iz babeszjoza bydla wyst^puje w Polsce w formie bezobjawowej i nie wplywa znacz^co na mlecznosc. Cz^stotliwosc wyst^powania pierwotniakow z rodzaju Babesia spp. u bydla ksztaltuje si§ na poziomie 10,4%. Rozpoznanie choroby jest mozliwe wyl^cznie w oparciu o wykrywanie materialu genetycznego pasozyta, zas bezposrednie badania mikroskopowe rozmazow krwi s^ nieprzydatne w identyfikacji Babesia spp. w erytrocytach.
Analiza I-rz^dowej struktury genetycznej konserwatywnego fragmentu genu 18S RNA pozwalila wyodr^bnic 2 grupy filogenetyczne rozni^ce si§ mi^dzy sob^ czterema podstawieniami nukleotydow. Wykazano rowniez, iz izolaty polskie s^ odlegle filogenetycznie od pozostalych izolatow europejskich i swiatowych.
Badania wektorow wykazaly, iz prewalencja piroplazm bydl^cych w kleszczach na terenie Lubelszczyzny jest niska i wynosi 0,63%.
Pismiennictwo
1. Gohil S., Herrmann S., Günther S., Cooke B.M. 2013: Bovine babesiosis in 21st century: Advances in biology and functional genomics. Int. J. Parasitol. 43, 125-132.
2. Bock R., Jackson L., de Vos A., Jorgensen W. 2004: Babesiosis of cattle. Parasitology 129, S247-S269.
3. Bock R.E., de Vos A.J. 2006: Tick-borne diseases of cattle. Australian and New Zealand Standard Diagnostic Procedures.
http://www.scahls.org.au/Procedures/Pages/ANZSDPs.as px
4. Sevinc F., Sevinc M., Birdane F.M., Altinoz F. 2001: Prevalence of Babesia bigemina in cattle. Revue Med. Vet. 152, 395-398.
5. Vial H.J., Gorenflot A. 2006: Chemotherapy against babesiosis. Vet. Parasitol. 138, 147-160.
6. Nayel M., El-Dakhly K.M., Aboulaila M., Elsify A., Hassan H., Ibrahim E., Salama A., Yanai T. 2012: The use of different diagnostic tools for Babesia and Theileria parasites in cattle in Menofia, Egypt. Parasitol. Res. 111, 1019-1024.
7. Terkawi M.A., Alhasan H., Huyen N.X., Sabagh A., Awier K., Cao S., Goo Y.K., Aboge G., Yokoyama N., Nishikawa Y., Kalb-Allouz A.K., Tabbaa D., Igarashi I., Xuan X. 2012: Molecular and serological prevalence of Babesia bovis and Babesia bigemina in cattle from central region of Syria. Vet. Parasitol. 187, 307-311.
8. Yamada S., Konnai S., Imamura S., Simuunza M., Chembensofu M., Chota A., Nambota A., Onuma M., Ohashi K. 2009: PCR-based detection of blood parasites in cattle and adult Rhipicephalus appendiculatus ticks. Vet. J. 182, 352-355.
9. Bock R.E., Blight G.W., Kingston T.G., de Vos A.J. 1995: A survey of cattle producers in the Boophilus microplus endemic area of Queensland to determine attitudes to the control of and vaccination against tick fever. Aust. Vet. J. 72, 88-92.
10. Jongejan F. 1998: Integrated Control of Ticks and Tick-borne Diseases (ICTTD). Parasitol. Today 14, 173-176.
11. de Vos A.J. 1991: Distribution, economic importance and control measures for Babesia and Anaplasma. W: Recent development in the control of anaplasmosis, babesiosis and cowdriosis. Proceedings of a Workshop Held at ILRAD Nairobi, Kenya, 13-15 May
1991. The International Laboratory for Research on Animal Diseases.
12. Bock R.E., de Vos A.J., Kingston T.G., McLellan D.J. 1997: Effect of breed of cattle on innate resistance to infection with Babesia bovis, B.bigemina and Anaplasma marginale. Aust. Vet. J. 75, 337-340.
13. Bock R.E., Kingston T.G., de Vos A.J. 1999: Effect of breed of cattle on transmission rate and innate resistant to infection with Babesia bovis and B.bigemina transmitted by Boophilus microplus. Aust. Vet. J. 77, 461-464.
14. Brown W.C., Norimine J., Knowles D.P., Goff W.L. 2006: Immune control of Babesia bovis infection. Vet. Parasitol. 138, 75-87.
15. Brown C.G.D. 1997: Dynamics and impact of tick-borne diseases of cattle. Trop. Anim. Health Prod. 29, 1S-3S.
16. Jonsson N.N., Bock R.E., Jorgensen W.K. 2008: Productivity and health effects of anaplasmosis and babesiosis on Bos indicus cattle and their crosses, and the effects of differing intensity of tick control in Australia. Vet. Parasitol. 155, 1-9.
17. Altay K., Aydin M.F., Dumanli N., Aktas M. 2008: Molecular detection of Theileria and Babesia infections in cattle. Vet. Parasitol. 158, 295-301.a
Стаття надiйшла до редакцп 10.10.2016
