CC BY
16УДК 577.112 : 577.151
канд. биол. наук старший научный сотрудник РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь, г. Минск, Республика Беларусь
В.Н. НИКАНДРОВ, доктор биол. наук, профессор, профессор кафедры биотехнологии Полесский государственный университет, г. Пинск, Республика Беларусь
Статья поступила 3 октября 2022 г.
ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ (NGF) И ЕГО СУБЪЕДИНИЦ
Изучены энзиматические свойства образцов высокой степени чистоты олигомера NGF и его субъединиц. Обнаружено наличие у в-субъединицы плазминоген-активаторной способности, а у в- и у-субъединиц - прямой протеолитической активности в отношении основного белка - про-тамина. Ингибиторный анализ свидетельствует о «сериновой» природе этой активности, в молекуле в-субъединицы вероятно наличие функционально значимых металл-содержащих сайтов. Все три субъединицы наделены супероксид-конвергирующий способностью, но только в- и у-субъединицы, по данным биохемилюминесценции, способны разлагать Н2О2 с генерированием активных форм кислорода. Плазминоген-активаторная способность в- и у-субъединиц резко - на 70-100% - угнеталась АТР, не изменялась при добавлении 3',5'-АМР, умеренно - на 18-40% -снижалась в присутствии ADP и на 40% возрастала в присутствии АМР. Активность в-субъединицы и у-субъединицы угнеталась в присутствии GTP на 100 и 40% соответственно. У всех трех субъединиц обнаружена способность к расщеплению ДНК и РНК. Эффекторный анализ и концентрационная зависимость дают основание считать, что субъединицы самостоятельны в этой активности и нет каких-либо взаимопримесей. Обработка а-субъединицы источниками активных форм кислорода не привела к проявлению протеолитической активности. Вместе с тем ее молекула имеет активный центр, наделенный активностью нуклеазной.
Ключевые слова: фактор роста нервов, субъединицы, плазминоген-активаторная способность, протеолитическая активность, разложение Н2О2, конверсия супероксидного радикала, пуриновые нуклеотиды, нуклеазная активность
PhD in Biol. Sc. and Microbiologe,
Minsk, Republic of Belarus
NIKANDROV Vitaliy N., Doctor of Biol. Sc. Habil., Professor of Biochemistry, Professor of the Department of Biotechnology, Polessky State University, Pinsk, Republic of Belarus
E-mail: nikandrov.vitaly@gmail.com.
ENZYMATIC PROPERTIES OF NERVE GROWTH FACTOR (NGF) AND ITS SUBUNITS
The enzymatic properties of high purity samples of the NGF oligomer and its subunits were studied. The presence of plasminogen-activating ability in the в-subunit, and direct proteolytic activity in relation to
Н.С. ПЫЖОВА,
PYZHOVA Nelly S.,
RSPC of Epidemiology Senior Researcher
the basic protein, protamine, in the fi- and y-subunits was found. The inhibitory analysis indicates the "serine" nature of this activity; the presence of functionally significant metal-containing sites in the fi-subunit molecule is likely. All three subunits are endowed with the superoxide-converging ability, but only fi- and y-subunits, according to biochemiluminescence data, are able to decompose H2O2 with the generation of reactive oxygen species. The plasminogen-activating ability of fi- and y-subunits was sharply -by 70-100% - inhibited by ATP, did not change with the addition of 3',5'-AMP, moderately - by 18-40% -decreased in the presence of ADP and by 40 % increased in the presence of AMP. The activity of the fi-subunit and y-subunit was inhibited in the presence of GTP by 100 and 40%, respectively. All three subunits were found to be able to cleave DNA and RNA. Effector analysis and concentration dependence give reason to believe that the subunits are independent in this activity, and there are no mutual impurities. Treatment of the a-subunit with sources of reactive oxygen species did not lead to the manifestation of proteolytic activity. At the same time, its molecule has an active center endowed with nuclease activity.
Keywords: nerve growth factor, subunits, plasminogen-activating ability, proteolytic activity, H2O2 degradation, superoxide radical conversion, purine nucleotides, nuclease activity
Введение. Фактор роста нервов (КОБ) -один из нейроспецифических белков регуля-торного типа. Его считают ответственным за дифференцировку и пролиферацию адренер-гических симпатических и сенсорных нейронов периферической нервной системы, хо-линергических нейронов базальных ядер переднего мозга, регенерацию нервов, нейронов развивающейся нервной системы, включая ноцицепторы. Установлено участие его в симпатической передаче возбуждения, Са2-зависимой стимуляции выхода ацетилхолина, дифференцировку, пролиферацию и биосинтетические свойства клеток иммунной системы [1-4].
Было установлено, что КОБ - основной белок-олигомер 118 аминокислотных остатков общей молекулярной массы 131 кДа, содержащий 1-2 атома цинка. Олигомер 78 КОБ состоит из двух а-субъединиц, двух Р-субъединиц (они образуют димер в составе олигомера КОБ) и двух у-субъединиц. Плаз-миноген-активаторная активность присуща олигомеру фактора 78 и его у-субъединице, тогда как а- и Р-субъединицы ее лишены [5, 6]. Протеиназой является у-субъединица, принадлежащая к калликреиновому семейству сериновых протеиназ, тогда как а-субъединица - неактивная протеиназа [7] и лишена специфической биологической активности [8].
Активность у-субъединицы ингибируется диизопропилфторфосфатом, она неспособна расщеплять фибрин или казеин, при этом гидролизует синтетические эфиры аргинина
Г-субъединица NGF катализирует расщепление N-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфира, причем добавление к ней очищенных а- или ß-субъединиц существенно не отражалось на этой активности в 0,05 М трис-буфере при рН 7,0, 8,0 и 9,0, тогда как активность смеси (у- + а- + ß)-субъединиц снижалась при рН 7,0 и 8,0 ( но не при рН 9,0) на 80 и 49% соответственно. Расщеплялся также и ТАМЕ, но гораздо слабее. По расщеплению ВАЕЕ и ТАМЕ при рН 7,0 у-субъединица превосходила трипсин в 6,7 и 2,1 раза соответственно [10].
Однако, несмотря на многолетние исследования свойств молекулы NGF и его субъединиц, до сих пор остается не совсем ясной природа его биологической активности на молекулярном уровне. Среди данных литературы о функциональных свойствах NGF и его субъединиц примечательным было обнаружение у у-субъединицы плазминоген-активаторной способности (см. выше по тексту). Вместе с тем, считали, что остальные субъединицы (ß- и а-) лишены подобных свойств.
Таково было положение до начала наших работ.
В настоящей статье полностью раскрыты результаты проведенных нами экспериментальных исследований, основные результаты которых были получены в 1998-2001 годы. Эксперименты были проведены на базе лаборатории регуляторных белков и пептидов Института физиологии НАН Беларуси и лаборатории биохимии НИИ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь. Результаты их изложены в целом ря-
де тезисов и фрагментах статей [11-23], но по ряду причин в то время статья так и не была написана. Методическая сторона этих исследований раскрыта в ранее опубликованных нами статьях [24-27].
Образцы фактора роста нервов - 7S и его субъединиц выделены из подчелюстных слюнных желез белых мышей-самцов сотрудниками лаборатории регуляторных белков и пептидов Института физиологии НАН Беларуси и предоставлены старшим научным сотрудником В.С. Лукащевичем. Процесс выделения и очистки включал гомогенизирование, осаждение сульфатом аммония, хроматографию на сефакриле S-200, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ультрафильтрацию и рехроматографию на сефакриле S-200 [28]. Полученные образцы имели активность 20 нг/биол. ед.
Субъединицы фактора выделяли как описано ранее методом диссоциации в кислой среде [1]. Их гомогенность подтверждена методами гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и изо-электрофокусирования в системе амфолинов. Биологическая активность ß-субъединицы оценена в тесте с трансформацией клеток феохромоцитомы РС12.
Результаты и их обсуждение. На первом этапе исследований было установлено, что а-либо у-субъединицы в отсутствие
плазминогена не расщепляют фибрин (таблица 1). Правда, под действием у-субъединицы частичный фибринолиз все же проявляялся, что совпадает с изложенным в литературе мнением о принадлежности ее к сериновым протеиназам. Нужно отметить, что урокиназа (ЕС 3.4.21.31) также обладает собственной фибринолитической
активностью, которая уступает ее плазминоген-активаторной функции [29]. После добавления к образцам очищенного плазминогена под действием у-субъединицы отмечен четкий фибринолиз, тогда как у а-субъединицы такая способность
отсутствовала.
При использовании же плазминоген-содержащих фибриновых пластин был выявлен фибринолиз не только под действием у-субъединицы, но и в присутствии ß-субъединицы фактора (таблица 2). Этот процесс характеризовался продолжительной лаг-фазой в сравнении со стрептокиназой и уро-киназой и уступал им по интенсивности. Однако так была впервые обнаружена в 20002002 годы плазминоген-активаторная способность ß-субъединицы NGF [11-13,15 и др.]. Причем, в отличие от обычных активаторов плазминогена, эта способность NGF и субъединиц имела lag-период > 4 час [12, 15 и др.].
Образец Размер зон лизиса, мм2
а-субъединица, 0,1 мг/мл 0
у-субъединица, 0,1 мг/мл частичный лизис
а-субъединица + плазминоген, 0
0,2 мг/мл
у-субъединица + плазминоген, 116 ± 9
0,2 мг/мл
Примечание - Плазминоген выделен методом аффинной хроматограции из отходов получения у-глобулинов, на пластины наносили 15 мкл субъединиц или 15 мкл субъединиц + 15 млк плазминогена, концентрация белков субъединиц - 0,1 г/мл, плазминогена - 0,2 мг/мл
Таблица 1. - Расщепление фибриновых пластин с инактивированным плазминогеном (мм2 зон лизиса) субъединицами
(0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4, 37 оС, 20 час; и=5)
Таблица 2. - Кинетика лизиса плазминоген-содержащих фибриновых пластин (мм зон лизиса) различными активаторами плазминогена (0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4, 37 оС; и=5)
Время инкубации, час Стрептокиназа, 5 МЕ Урокиназа, 63 мкг/мл у-субъединица NGF, 63 мкг/мл Р-субъединица NGF, 63 мкг/мл
0 0 0 0 0
1 33 ± 2 33 ± 2 0 0
2 52 ± 4 68 ± 5 0 0
4 68 ± 4 95 ± 5 0 0
18 400 ± 21 637 ± 32 39 ± 3 32 ± 2
Примечание - Использованы международный стандарт ВОЗ «Стрептокиназа» и урокиназа фирмы 1.Я.Т., Япония.
Таблица 3. - Влияние олигомера КОБ и его субъединиц на расщепление плазминоген-содержащих фибриновых пластин активаторами плазминогена (мм2 зон лизиса, 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, 37 °С, 20 часов; п=4)
Варианты эксперимента Стрептокиназа Урокиназа Тканевый активатор плазминогена
Контроль 340 ± 15 230 ± 12 233 ± 11
+ а-субъединица (0 мм2 ^ 289 ± 12 204 ± 10 227 ± 9
+ Р-субъединица (158 ± 8 мм2) 339 ± 17 297 ± 14 335 ± 16
+ у-субъединица (707 ± 31 мм2) 670 ± 25 599 ± 22 723 ± 27
+ 7S NGF (468 ± 20 мм2) 442 ± 19 581 ± 24 395 ± 16
Примечание - В скобках указана собственная плазминоген-активаторная способность КвБ и его субъединиц; частично очищенный тканевый активатор плазминогена получен из сердца свинки.
Следует заметить, что в работе [5] наличие плазминоген-активаторной функции у Р-субъединицы отрицалось. Однако авторы не привели концентрацию образца, с которым проводилось исследование. Полученные же нами данные позволяют считать, что таковая у Р-субъединицы лишь на 20% уступала плазминоген-активаторной способности у-субъединицы.
Исследование совместного действия оли-гомера и его субъединиц с хорошо известными активаторами плазминогена не выявили аддитивности плазминоген-активаторной способности, а в случае а-субъединицы - при
смешивании ее со стрептокиназой или уро-киназой некоторый тормозящий эффект (1115%) (таблица 3).
Это дало основание для предположения, что молекулы Р- и у-субъединиц, а также олигомера фактора роста нервов не взаимодействуют с использованными активаторами плазминогена.
Примечательно действие а-субъединицы на плазминоген-активаторную способность Р-субъединицы. При температуре 25 °С полное подавление указанной способности наблюдали уже при концентрации а-субъединицы 40 мкг/мл, тогда как при более
высокой температуре даже увеличение концентрации а-субъединицы почти на порядок угнетение плазминоген-активаторной способности Р-субъединицы не превышало 40% [12,15] (рисунок 1). На наш взгляд, здесь возможны два варианта развития событий. Либо при более высокой температуре происходит быстрая ассоциация обеих субъединиц, только частично затрагивающая активный сайт Р-субъединицы. Либо Р-субъединица сама обладает все же протеолитической активностью, что ведет к деструкции молекулы а-субъединицы. Выяснение этих возможных путей требовало проведения дальнейших исследований.
На такую же способность у-субъединицы а-субъединица практически не влияла:
444±17 мм2 в контроле против 454±13 мм2 в опыте (не показано).
Использование группоспецифических ингибиторов протеиназ показало, что фенилме-тилсульфонилфторид умеренно (на 30%) угнетал плазминоген-активаторную способность олигомера КОБ, полностью подавляя таковую способность Р-субъединицы и на 84% у у-субъединицы ([12, 17], рисунок 2). Ингибиторное действие р-
хлормеркурибензоата на действие Р-субъединицы не превышало 34%, а в случае у-субъединицы вообще не проявлялось. Примечательно также небольшое (на 20-26%) снижение плазминоген-активаторной способности только Р-субъединицы в присутствии реагентов, связывающих металлы [12].
[ а N0 Е ], мкг / мл
Рисунок 1. - Влияние добавок а-субъединицы NGF на плазминоген-активаторную способность
Р-субъединицы при 25 °С (1) и при 37 °С (2)
О
о
15
Р
И.*
Еи
□ 5
3
-80
-120
Рисунок 2. - Влияние группоспецифических ингибиторов(7 - фенилметилсульфонилфторид, 2 -_р-хлормеркурибензоат, 3 - о-фенантролин, 4 - 8-гидроксихинолин, 5 - ЭДТА) протеиназ (10-3 М) на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) олигомера фактора роста нервов (а), его
Р-(б) и у-(«)субъединиц, п = 4
Примечание -*- Здесь и далее статистически достоверные изменения при Р < 0,05.
Следовательно, плазминоген-
активаторная способность исследуемых образцов, по-видимому, является обусловленной серин-содержащим активным центром. В случае Р-субъединицы, возможно, имеет место участие или регуляторное действие ме-талл-содержащих сайтов молекулы.
Поскольку активация плазминогена способна реализовываться при участии активных форм кислорода [30, 31], вполне естественно возникал вопрос о возможной взаимосвязи КОБ и его субъединиц с реакциями генерирования и трансформации активных форм кислорода.
Прежде всего было изучено действие перехватчиков активных форм кислорода на плазминоген-активаторную функцию олиго-мера фактора роста нервов и его субъединиц.
Оказалось, что плазминоген-активаторная способность 78КОБ, Р- и у-субъединиц подавлялась нитротетразолиевым синим (0,001 М) на 47, 40 и 100% соответственно, но не перехватчиками О2Д1 или НО-радикала ([12, 15, 17], рисунок 3).
То обстоятельство, что олигомер КОБ в ряде случаев менее чувствителен к эффекторам, чем субъединицы - один из моментов, позволивших предположить модель субъеди-
ничной организации КОБ, согласно которой Р-субъединица заметно экранирована от растворителя [32].
Дальнейшие исследования опосредованных О21 процессов в действии субъединиц фактора роста нервов на биохемилюмино-метре БХЛ-01 (МП «Универсал», Минск) показали, что в системе «люминол-Н2О2» внесение Р- и, особенно, у-субъединицы вызывало вспышку хемилюминесценции с последующим затуханием. Такой способности была лишена а-субъединица ([15, 17, 20, 21], рисунок 4).
Однако в системах генерирования супероксидного радикала редукция восстановления нитротетразолиевого синего наблюдалась в присутствии всех трех субъединиц: а-, Р- и у- на 55-62, 23-27 и 41-52% соотвест-венно. Причем подавление реакции образования формазана а-субъединицей не отличалось от такового в присутствии у-субъединицы и заметно превышало величину, наблюдавшуюся при внесении в системы Р-субъединицы ([12, 17, 18, 20, 21], таблица
4).
40
0
3 -40
-80
-120
О
В
е.?
П4 Я 5
а б
□ 7
Рисунок 3. - Влияние перехватчиков активных форм кислорода (10- М, 1 - нитротетразолиевый
синий; 2 - адреналин; 3 - манит; 4 - формиат; 5 - азид натрия; 6 - гистидин; 7- триптофан) на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) олигомера фактора роста нервов (а), его
Р-(б) и у-(в)субъединиц
Примечание - п=4; метод лизиса фибриновых пластин; 0,006 М фосфатный буфер рН 7,4; 37 оС.
Рисунок 4. - Кинетика затухания хемилюминесценции в системе «люминол-Н2О2», вызванной
субъединицами фактора роста нервов
Примечание - п = 4; 0,06 М фосфатный буфер, рН 7,4; содержание в смеси люминола с концентрацией 1,2^ 10-4 М -1,0 м , содержание в смеси Н2О2 с концентрацией - 3^10-3 М - 0,1 мл, содержание субъединиц в реакционной смеси - 0,065 мг; 1 - фон; 2 - а-субъединица; 3 - в- субъединица; 4 - у-субъединица; 25 °С.
Таблица 4. - Влияние олигомера 78 КОБ и его субъединиц на восстановление нитротетразолиево-го синего супероксидными радикалами в буферном растворе (п=4)
Исследуемый белок Скорость реакции восстановления нитротетразолиевого синего, А560 • мин-1 в системах генерирования О:2
NADH-феназинмето-сульфатя) Аскорбат-феназинмето-сульфат"-1
Контроль 0,37 ± 0,03 0,54 ± 0,03
+ NGF 0,19 ± 0,02* 0,32 ± 0,02*
+ субъединицы: а- 0,17 ± 0,03* 0,21 ± 0,01*
ß- 0,28 ± 0,02* 0,42 ± 0*
Y- 0,18 ± 0,03* 0,32 ± 0,03*
Примечание - а) 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, конечная концентрация КАБИ - 5,2^10-5 М, феназин-метосульфата - 6^10-6 М, нитротетразолиевого синего - 5,5^10-5 М; б) 0,052 М пирофосфатный буфер рН 8,3, конечная концентрация аскорбата - 7,6^10-5 М, феназинметосульфата - 1,Ь10"5 М, нитротетразолиевого синего - 6,7^10-5 М.
Изложенные материалы в достаточной степени свидетельствуют о том, что плазми-ноген-активаторная функция ß-субъединицы NGF самостоятельна и не вызвана примесью у-субъединицы. Дополнительным аргументом является действие на плазминоген-активаторную способность пуриновых нук-леотидов ([15, 22], рисунок 5).
Адениловые и гуаниловые нуклеотиды играют важную роль в регуляции протеолиза
[33, 34]. Действие пуриновых нуклеотидов на эти субъединицы отличалось от такового на стрептокиназу [33]. Активность обеих субъединиц как и стрептокиназы резко - на 70100% - угнеталась АТР. Но в отличие от стрептокиназы, активаторная функция которой подавлялась 3',5'-АМР, но не АМР, АБР и ОТР [34], активность обеих субъединиц не изменялась при добавлении 3',5'-АМР (не показано), умеренно - на 18-40% - снижа-
лась в присутствии АБР и на 40% возрастала в присутствии АМР. Наконец, активность Р-субъединицы и у-субъединицы угнеталась при добавлении GTP на 100 и 40% соответственно. Это дает основание считать, что плазминоген-активаторная функция Р-субъединицы самостоятельна и не вызвана примесью у-субъединицы.
В дальнейшем уже в 2010-2011 годы было установлено, что фактор роста нервов способен связывать 1-2 молекулы АТР в гепарин-связывающем домене молекулы NGF и именно 8^АТР- NGF комплекс наделен нейропротекторной активностью [35, 36].
Как мы уже указывали во введении, принято считать, что истинной протеолитиче-сокй активности Р-субъединица лишена. В наших экспериментах методом фибриновых пластин с инактивированным плазминоге-ном, а также методом лизиса казеина и гемоглобина в тонком слое агарового геля было
- lg [ATP], M
также установлено, что ни фибрин, ни казеин, ни гемоглобин олигомер КОБ и его субъединицы не расщепляли (не показано). Тем не менее, удалось подобрать белок-субстрат, который вполне демонстративно расщепляли у- и Р-субъединицы. Им оказался протамин-сульфат [24 и др.]. При этом протеолитиче-ская активность Р-субъединицы в четыре-пять раз уступала таковой у-субъединицы (таблица 5).
Это дало косвенное подтверждение материалам рисунка 4 и допущению, что Р-субъединица фактора роста нервов при определенных условиях способна расщеплять а-субъединицу.
Ингибиторный анализ показал, что про-теолитическая активность Р-субъединицы заметно угнеталась фенилметилсульфонил-фторидом и умеренно подавлялась о-фенантролином (рисунок 6).
- lg [ADP], M
30
20
10-
AMP
2 3 4
- lg [AMP], M
-40
-80
GTP
о_____o-
1 - l2g [GTP]3, M
0
Рисунок 5. - Влияние пуриновых нуклеотидов на плазминоген-активаторную способность (% к контролю) Р-(1) и у-(2)субъединиц фактора роста нервов (и=4; метод лизиса плазминогенсодержащих фибриновых пластин)
Таблица 5. - Расщепление протамин-сульфата субъединицами КОБ в тонком слое агарового геля
(и=4)
Исследуемый образец, концентрация мг/мл Размер зон лизиса, мм2
у-субъединица,
1,25 855 ± 30
0,63 743 ± 23
0,31 600 ± 22
в-субъединица,
0,50 182 ± 10
0,25 110 ± 8
0,12 0
Примечание - Метод лизиса белка-субстрата в тонком слое агарового геля; концентрация агара - 1%, протамин-сульфата - 2%, 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4, объем образцов субъединиц - 15 мкл, инкубация при 37 °С 24 часа пластину 1 %-ого агара "Б11ео", приготовленную на 0,06 М фосфатном буфер рН 7,6.
Рисунок 6. - Влияние группоспецифических ингибиторов протеиназ и комплексонов (10-3 М, 1 - фенилметилсульфонилфторид; 2 -^-хлормеркурибензоат; 3 - о-фенантролин, 4 - ЭДТА) на расщепление протамин-сульфата (% к контролю) в тонком слое агарового геля и р-субъединицей фактора роста нервов
Примечание - п=3; метод лизиса белок-агаровых пластин; 0,06 М фосфатный буфер рН 7,4; 37 оС.
Учитывая имеющееся в литературе мнение о зимогенном характере а-субъедицы [7], логична была попытка вызвать активацию этого «зимогена» при воздействиях, активирующих другие зимогены: плазминоген, трипсиноген, химотрипсиноген, пепсиноген - источниками активных форм кислорода прежде всего - супероксидного радикала [31,37,38].
Аликвоты а-субъединицы КОБ обрабатывали ионами Бе2+ или Ре3+ в конечной концентрации 10-7-10-2 М, системами генериро-
вания активных форм кислорода -Си804+КЛБН+рибофлавин, СиС12+рибофлавин+аскорбат, Бе804+рибофлавин+аскорбат, ТЕ-
МЕД+рибофлавин, феназинметосуль-
фат+КЛБН, Н2О2 в конечной концентрации 0,1-3,0 М, а также стрептокиназой. Методами лизиса фибриновых или протамин-агаровых пластин не было зафиксировано расщепление белков [12,22].
Следовательно, если а-субъединица и представляет собой зимоген, он активируется
путем, отличным от зимогенов других проте-иназ.
Еще одной неожиданностью было установление у субъединиц КОБ нуклеазной активности.
Методом лизиса ДНК селезенки или тРНК дрожжей в тонком агаровом слое с последующей визуализацией зон лизиса обработкой 2 н НС104 (как подробно описано ранее [13]) установлена эндонуклеазная активность при рН 7.4 по обоим субстратам у всех трех субъединиц (таблица 6 и [14, 17, 20 и др.], таблица 6).
Концентрационная зависимость активности показала, что обе эндонуклеазные активности проявлялись у Р-субъединицы при более низких ее концентрациях, чем у других субъединиц (рисунок 7). Однако эта зависимость у Р-субъединицы в обоих случаях имела вид кривой с насыщением, тогда как активность а- и у-субъединиц в широком диапазоне концентраций изменялась практически линейно (рисунок 7 и [17, 21]).
Таблица 6. - Расщепление ДНК и РНК в тонком слое агарового геля субъединицами КОБ (п=3, инкубация при 37°С, 24 часа)
Исследуемый образец Размер зон лизиса, мм2
ДНК РНК
а-субъединица, 2,5 мг/мл 224,9 ± 12,0 306,2 ± 9,3
Р-субъединица, 0,63 мг/мл 199,9 ± 8,9 132,3 ± 10,5
у-субъединица, 1,9 мг/мл 217,4 ± 16,2 214,0 ± 13,7
Примечание - 0,05 М трис-НС1 буфер рН 7,6, содержащий 5 мМ MgS04, 5 мМ СаС12 и 1 мМ ЭДТА; концентрация агар-агара - 1,5%, концентрация ДНК - 20 мг/10 мл, концентрация тРНК - 30 мг/10 мл; фиксация - 1 н НС104.
Рисунок 7. - Зависимость расщепления ДНК (а) и РНК (б) в тонком слое агарового геля а-(1), ß-(2) и
у-(3)субъединицами NGF
Примечание - n=4; 0,05 трис- HCl буфер pH, концентрация агара - 1.5%, содержащая ДНК селезенки в пластине - 20 мг или тРНК дрожжей - 30 мг; инкубация при 37°С, 24 часа [24].
Можно было думать, что нуклеазная активность а-субъединицы была вызвана возможной примесью у-субъединицы. Однако, как показали исследования действия традиционных эффекторов эндонуклеаз, например, ДНК-азная активность а-субъединицы в 0,06М фосфатном буфере подавлялась Ca2+, Co2+, Mn2+, Cu2+ и аргинином в концентрации 10-3 М на 50-65%, тогда как данные эффекторы (за исключением Cu2) на таковую активность у-субъединицы практически влияния не оказали, а под действием катионов Cu2+ ее активность возрастала [14,15,17,20].
Определение АТФ-азной активности у-или а-субъединиц в реакционной смеси, включающей 0,05 М трис-HCl буфер рН 7,4, 0,02 М KCl, 0,003 MgCl2 + 0,003 M CaCl2 + 0,003 M NaHCO3 и ATP- 0,006 M, показало отсутствие освобождения неорганического ортофосфата в реакции с молибдатом аммония.
Заключение. Итак, изложенные результаты показывают, что в период 2000-2005 годы у олигомера NGF и его субъединиц нами был обнаружен ряд ранее неизвестных функциональных свойств. Это обстоятельство позволяет по-новому взглянуть на структурно-функциональную специфику данного регуля-торного белка и на пути реализации его биологического действия.
Прежде всего, важным моментом является наличие у ß-субъединицы плазминоген-активаторной способности, а у ß- и у-
субъединиц - прямой протеолитической активности в отношении основного белка -протамина. Ингибиторный анализ свидетельствует о «сериновой» природе этой активности. Причем, судя по всему, в молекуле Р-субъединицы присутствуют функционально значимые металл-содержащие сайты. Это вызывает также логичный вопрос о способности данных субъединиц расщеплять и ги-стоны.
Все три субъединицы наделены суперок-сид-конвергирующий способностью, но только Р- и у-субъединицы способны расщеплять Н2О2 с генерированием активных форм кислорода. Наличие О2: -конвергирующей способности как и генерирование активных форм кислорода при расщеплении гидропероксида дают основание полагать наличие в молекулах субъединиц металлов с переменной валентностью - не 2п.
Плазминоген-активаторная способность Р-и у-субъединиц заметно изменялась в присутствии пуриновых нуклеотидов. Неожиданным явилось обнаружение у всех трех субъединиц нуклеазной активности - и по ДНК и по РНК. Причем эффекторный анализ и концентрационная зависимость дают полное основание считать, что субъединицы самостоятельны в этой активности, и нет каких-либо взаимопримесей.
Что касается а-субъединицы, обработка ее источниками активных форм кислорода не
привела к проявлению протеолитической активности. Вместе с тем ее молекула имеет активный центр, наделенный активностью нуклеазной. Этот момент является предметом дальнейшего отдельного изучения.
Ранее в литературе уже высказывались суждения относительно более сложного механизма действия КОБ на клетку-мишень: не только путем взаимодействия со специфическим рецептором плазматической мембраны (хотя и характер этого взаимодействия остается недостаточно ясным), но и путем расщепления белка, связывающего инсулин-подобный фактор роста (ЮБВР) [39], а также воздействия на цитоплазматический, включая р75КТК и ядерный КОБ-рецепторы [4043]. Последний аспект в свете обнаружения у субъединиц КОБ эндонуклеазной активности приобретает, на наш взгляд, особый смысл. Кроме того, изложенные факты создают предпосылки к проведению поисковых работ по созданию КОБ-миметиков и, наконец, раскрытию структурных основ проявления обнаруженных функциональных особенностей.
Авторы выражают искреннюю благодар-
ность светлой памяти В.С. Лукашевичу за предоставление образцов олигомера NGF и его субъединиц высокой степени чистоты.
Список литературы
1. Калюнов, В. Н. Фактор роста нервной ткани. Наука и техника / В. Н. Калюнов. -Минск, 1984. - 216 с.
2. Сукманский, О. И. Биологически активные вещества слюнных желез / О. И. Сукманский // Здоровья. - Киев, 1991. - 112 с.
3. Eibi, J.K. Structural, biological, and pharmacological strategies for the inhibition of nerve growth factor / J.K. Eibi, B.C. Strasser, G.M. Ross // Neurochemistry international. - 2012. - Vol. 61. - P. 1266-1275.
4. Исаев, Н. К. Роль фактора роста нервов в пластических перестройках холинергиче-ских нейронов базальных ядер переднего мозга / Н. К. Исаев, Е. В. Стельмашук, Е. Е. Генрихс // Биохимия. - 2017. -Т. 82, вып. 3. - С. 429-440.
5. Hiramatsu, M. Plasminogen activator activity in the subunits of mouse submandibular gland nerve-growth factor and epidermal growth factor / M. Hiramatsu, K. Hatakeya-
ma, M. Kumegawa, N. Minami // Arch. Oral Biol. - 1982.- Vol. 27, No 6. - P. 517-518.
6. Ebendal, T. Function and evolution in the NGF family and its receptors / J. Neurosci. -Res. - 1992. - Vol. 32. - P. 461-470.
7. Bax, B. Structure of mouse 7S NGF: a complex of nerve growth factor with four binding proteins / B. Bax, T.L. Blundell, J. Murrey-Rust, N.Q. McDonald // Structure. - 1997. -Vol. 5, No 10. - P. 1275-1285.
8. Stach, R.W. The characterization of the a-subunits of 7S nerve growth factor / R.W. Stach, P.F. Pignatti, M.E. Baker, M.E. Shooter // J. Neurochem. -1980. - Vol. 34, No 4. - P. 850-855.
9. Orenstein, N. S. Nerve growth factor: a protease that can activate plasminogen / N.S. Orenstein, H.F. Dvorak, M.H. Blanchard, M. Young // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1978. - Vol. 75, No 11. - P. 5497-5500.
10. Greene, L. A. Subunit interaction and enzymatic activity of mouse 7S nerve growth factor / L.A. Greene, E.M. Shooter, S. Varon // Biochemistry. - 1969. - Vol. 8, No 9. - P. 3735-3741. doi: 10.1021/bi00837a037.
11. Nikandrov, V.N. Functional properties of nerve growth factor molecule / V.N. Ni-kandrov [et al ] // 18 Intern. Congress of Bi-ochem. Mol. Biol. Abstract Book. Birmingham, 2000. - P. 317 (No 1152).
12. Никандров, В.Н Новые функциональные свойства молекулы фактора роста нервов и ее субъединиц / В. Н. Никандров [и др. ] // Достижения медицинской науки Беларуси, вып. V. Рецензир. научно-практ. ежегодник. Минск, БелЦНмИ, 2000. - С. 104-105.
13. Никандров, В. Н. Регуляторные белки: молекулярные аспекты биологического действия и неожиданные функциональные свойства их молекул / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // X съезд Белорусского общества физиологов. Тез. докл. Минск, Бизнес-офсет, 2001. - С. 113-114.
14. Никандров В. Н. Эндонуклеазная активность субъединиц фактора роста нервов / В.Н. Никандров, Н. С. Пыжова, В. С. Лукашевич // Достижения медицинской науки Беларуси», вып. VI. Рецензир. научно-практ. ежегодник, Минск, БелЦНМИ, 2001. - С. 87.
15. Никандров, В. Н. Энзиматические свойства фактора роста нервов и его субъеди-
ниц / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // Труды Всероссийской конфер. «Проблемы медицинск. энзимологии» «Соврем. технологии лаборат. диагностики нового столетия» «Международ. симпоз. «Пири-доксальфосфат-зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина»» М., 2002. - С. 163-164.
16. Никандров, В. Н. О полифункциональности белков регуляторного типа / В. Н. Ни-кандров, Н. С. Пыжова // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: Международная конференция: Пятый съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. Материалы докл. Минск, 2002. - Т-85.
17. Никандров, В. Н. Регуляторные белки: функциональные свойства молекул и механизмы их биологического действия / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // Известия НАН Беларуси. Серия мед.-биол наук. -2003. - № 3. - С. 75-89.
18. Никандров, В. Н. Биотехнология клеток нервной ткани: проблема белковых трофических факторов / В. Н. Никандров [и др. ] // Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества. Матер. Междунар. научно-практ. конф., Минск, 2005. - С. 153-154.
19. Никандров, В. Н. Перицеллюлярный про-теолиз в жизнедеятельности нервных клеток: влияние плазминогена и стрептокина-зы на культуры нервной ткани / В. Н. Ни-кандров // Научные труды I съезда физиологов СНГ. Т. 2. - Медицина-Здоровье, М., 2005 - С. 48.
20. Никандров, В. Н. Проблемы биотехнологии клеток нервной ткани: исследования белковых факторов трофического характера / В.Н. Никандров [и др. ] // Materials, methods and technology. Scientific articles 2007. Sci. Invest. LTD-branch Bourgas. Bulgaria, 2007. - Р. 48-66.
21. Никандров, В. Н. Значение плазминогена как фактора трофического характера для культур клеток нервной ткани / В. Н. Ни-кандров [и др. ] // Известия НАН Беларуси. Серия мед. наук. - 2008. - № 1. - С. 85-97.
22. Никандров, В. Н. Протеиназная активность субъединиц белка-нейротрофина -
фактора роста нервов / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Тезисы докл. Казань, 2009. - С. 254.
23. Способ определения протеолитической активности у- или Р-субъединицы фактора роста нервов: пат. № 11953 Респ. Беларусь / В .Н. Никандров, Н. С. Пыжова; заявитель ГНУ «Институт физиологии НАН Беларуси» - № а 20061234; заявл. 07.12.2006; опубл. 30.06.2009 // Афщыйны бюл. / Нац. цэнтр. штэлектуал.уласнасщ. -
24. Никандров, В. Н. Методы исследования протеолиза. Глава 5 / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // Современные проблемы биохимии. Методы исследований. Минск: Выш. шк., 2013. - С. 132-157.
25. Пыжова, Н. С. О возможности участия активных форм кислорода в расщеплении нуклеиновых кислот нуклеазами / Н. С. Пыжова, В. Н. Никандров // Новости ме-дико-биол. наук. 2009. - № 4. - С. 57-62.
26. Никандров, В. Н. Обнаружение суперок-сидисмутазной активности у стрептокина-зы / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова, В.И.Вотяков, Ю.Е. Клингер // Доклады АН БССР. - 1986. -Т. 30, № 11. - С. 1033-1036.
27. Никандров, В. Н. Генерирование активных форм кислорода протеиназами и трипсиногеном в водно-солевых растворах / В.Н. Никандров, Ю.М. Судник, Н.С. Пыжова // Доклады АН Беларуси. - 1992.
- Т. 36, № 11-12. - С. 1039-1044.
28. Буравский, В. А. Усовершенствованный метод выделения высокомолекулярной формы фактора роста нервов / В. А. Бу-равский [и др. ] // Известия АН БССР. Сер. биол. наук. - 1984. - № 4. - С. 79-84.
29. Пыжова, Н. С. Участие активных форм кислорода в процессах протеолиза: ... дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Н. С. Пыжова.
- Минск, 1990.
30. Nikandrov, V.N. The oxygen-dependent pathway of human plasminogen activation / V.N. Nikandrov, N.S. Pyzhova // 18th FEBS Meeting. Abstracts. - Ljubljana, 1987. - Р. 84.
31. Никандров, В. Н. Кислородзависимый путь активации плазминогена и новые физико-химические механизмы протеолиза/ В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова // Изве-
стия НАН Беларуси, сер. мед.-биол. наук.
- 2001. - № 1. С. 54-60.
32. Lukashevich, V. S. Subunit organization of the complex form of nerve growth factor / V. S. Lukashevich, V. N. Nikandrov // Protein Sci. The Proc. Soc. Thirteenth Sympos..-1999. - Vol. 8, suppl. 1, 301-S. - P. 121.
33. Никандров, В. Н. Влияние адениловых нуклеотидов на активаторную функцию стрептокиназы / В. Н. Никандров, Н. С. Пыжова, В. И. Вотяков // Бюл. экспер. биол. мед.. - 1987. - Т. 103, № 7. - С. 4951.
34. Пыжова, Н. С. Влияние биогенных фосфатов на расщепление белков протеина-зами и функцию активаторов плазминоге-на/ Н. С. Пыжова, В. Н. Никандров // Био-орг. химия. - 2008. - Т. 34, № 3. - С. 382391.
35. Hasche, A. Binding of ATP to nerve growth factor: characterization and relevance for bi-oactivity / A. Hasche [et al.] // Neurochem. Internat. - 2010.- Vol. 56. - P. 276-284.
36. Ferenz, K. B. ATP-NGF-complex, but not NGF, is the neuroprotective ligand / K. B. Ferenz, K. Rose, S. Konig, J. Krieglstein // Neurochem. Internat. - 2011.- Vol. 59. - P. 989-995.
37. Пыжова, Н. С. Активация трипсиногена быка в присутствии активных форм кислорода / Н. С. Пыжова, В. Н. Никандров // Доклады АН БССР. - 1991. - Т. 35, № 12.
- С. 1130-1133.
38. Пыжова, Н. С. Активация химотрипсино-гена и пепсиногена под действием активных форм кислорода / Н. С. Пыжова, В. Н. Никандров // Доклады НАН Беларуси. -2001. - Т. 45, № 3. - С. 67-70.
39. Rajah , R. 7S nerve growth factor is an insulin-like growth factor-binding protein protease / R. Rajah [et al] // Endocrinology. -1996. - Vol. 137. - P. 2676-2682.
40. Rakowicz-Szulczynska , E. M. Nerve growth factor receptors in chromatin of melanoma cells, proliferating melanocytes, and colorec-tal carcinoma cells in vitro /E. M. Rakowicz-Szulczynska , M. Herlyn, H. Koprowski // Cancer Res. - 1988. - Vol. 48, No24 Pt 1. -P.7200-7206.
41. Andres, R. Y. Nerve growth factor receptors: identification of distinct classes in plasma membranes and nuclei of embryonic dorsal root neurons / R. Y. Andres, I. Jeng, R.A.
Bradshaw // Proc. Nati. Acad. Sci. USA . -1977. - Vol. 74, No. 7. - P. 2785-2789.
42. Yankner, B. A. The biology and mechanism of action of nerve growth factor / B.A. Yankner, E. M. Shooter // Ann. Rev. Biochem. -1982. - Vol. 51. - P. 845-868.
43. Underwood, C. K. The p75 neurotrophin receptor / C. K. Underwood, E. J. Coulson // Int. J. Biochem.& Cell Biol. - 2008. - Vol. 40. - P.1664-1668.
References
1. Kalyunov V.N. Faktor rosta nervnoy tkani [Nerve growth factor]. Nauka i tekhnika. Minsk, 1984, 216 p. (In Russian)
2. Sukmanskiy O.I. Biologicheski aktivnyye veshchestva slyunnykh zhelez [Biologically active substances of the salivary glands]. Zdorov'ya. Kiyev, 1991, 112 p. (In Russian)
3. Eibi J.K., Strasser B.C., Ross G.M. Structural, biological, and pharmacological strategies for the inhibition of nerve growth factor. Neuro-chemistry international. 2012. Vol. 61, pp. 1266-1275.
4. Isayev N.K., Stel'mashuk E.V., Genrikhs YE.YE. Rol' faktora rosta nervov v plastich-eskikh perestroykakh kholinergicheskikh neyronov bazal'nykh yader perednego mozga [The role of nerve growth factor in plastic rearrangements of cholinergic neurons in the basal forebrain nuclei] Biokhimiya [Biochemistry]. 2017. T. 82, vyp. 3, pp. 429-440. (In Russian)
5. Hiramatsu M., Hatakeyama K., Kumegawa M., Minami N. Plasminogen activator activity in the subunits of mouse submandibular gland nerve-growth factor and epidermal growth factor. Arch. Oral Biol. 1982. Vol. 27, no 6, pp. 517-518.
6. Ebendal T. Function and evolution in the NGF family and its receptors. Res. 1992. Vol. 32. pp. 461-470.
7. Bax B., Blundell T.L., Murrey-Rust J., McDonald N.Q. Structure of mouse 7S NGF: a complex of nerve growth factor with four binding proteins. Structure. 1997. Vol. 5, no 10,pp.1275-1285.
8. Stach R.W., Pignatti P.F., Baker M.E., Shooter M.E. The characterization of the a-subunits of 7S nerve growth factor. J. Neuro-chem.1980. Vol. 34, no 4, pp. 850-855.
9. Orenstein N.S., Dvorak H.F., Blanchard M.H., Young M. Nerve growth factor: a pro-
tease that can activate plasminogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75, no 11,pp. 5497-5500.
10. Greene L.A., Shooter E.M., Varon S. Subunit interaction and enzymatic activity of mouse 7S nerve growth factor Biochemistry. 1969. Vol. 8, no 9,pp. 3735-3741. doi: 10.1021/bi00837a037.
11. Nikandrov V.N. et al. Functional properties of nerve growth factor molecule. 18 Intern. Congress of Biochem. Mol. Biol. Abstract Book. Birmingham, 2000, no 1152, pp. 317.
12. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S., Lukashevich V.S., Lukashevich I.B., Agurkov A.V., Da-vydovskii A.G., Shpak G.A. Novye funktsional'nye svoistva molekuly faktora rosta nervov i ee sub"edinits [New functional properties of the nerve growth factor molecule and its subunits]. Dostizheniia med-itsinskoi nauki Belarusi [Accomplishments of Medical Science in Belarus]. Ed. Gurman-chuk I. E. et.al. Minsk, 2000, iss. V, pp. 104105. (In Russian)
13. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Regulia-tornye belki: molekuliarnye aspekty biolog-icheskogo deistviia i neozhidannye funktsional'nye svoistva ikh molekul [Regulatory proteins: molecular aspects of biological action and unexpected functional properties of their molecules], X s"ezd Beloruss-kogo obshchestva fiziologov [X Congress of the Belarusian Society of Physiologists]. Ed. Kaliunov V.N. et.al. Minsk, 2001, pp. 113114. (In Russian)
14. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S., Lukashevich V.S. Endonukleaznaia ak-tivnost' sub"edinits faktora rosta nervov [En-donuclease activity of nerve growth factor subunits]. Dostizheniia meditsinskoi nauki Belarusi [Accomplishments of Medical Science in Belarus]. Ed. Gurmanchuk I.E. et. al. Minsk, 2001,vol. VI, 87p. (In Russian)
15. Nikandrov V.N., Pyzhova, N.S Enzimat-icheskie svoistva faktora rosta nervov i ego sub"edinits [Enzymatic properties of nerve growth factor and its subunits]. Problemy meditsinskoi enzimologii: trudy Vseros. konf. «Sovremennye tekhnologii laboratornoi di-agnostiki novogo stoletiia» i Mezhdunarod. simpoziuma «Piridoksal'zavisimye fermenty: struktura, molekuliarnaia patologiia i med-itsina». Moscow, 2002, pp. 163-164. (In Russian)
16. Pyzhova N.S., Nikandrov, V.N. O poli-funktsional'nosti belkov reguliatornogo tipa [On the polyfunctionality of regulatory proteins]. Molekuliarnye, membrannye i kletochnye osnovy funktsionirovaniia bio-sistem: Mezhdunar. nauch. konf [Molecular, membrane and cellular basis for the functioning of biosystems: Intern. scientific conf.]. Ed. Volotovskii I.D. et. al. Minsk, 2002. 85 p. (In Russian)
17. Nikandrov V.N., Pyzhova, N.S., Regulia-tornye belki: funktsional'nye svoistva mole-kul i mekhanizmy ikh biologicheskogo de-istviia [Regulatory proteins: functional properties of molecules and mechanisms of their biological action]. Vestsi Natsyianal'nai akademii navuk Belarusi. Seryia medyka-biialagichnykh navuk [Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus. Medical-biological series, 2003, no. 3, pp. 75-89 (In Russian)
18. Nikandrov V.N., Gronskaia R.I., Zhuk O.N., Lukashevich I.B., Polukoshko E.F., Petrusenko G.P., Pyzhova N.S. Bio-tekhnologiia kletok nervnoi tkani: problema belkovykh troficheskikh faktorov [Biotechnology of nervous tissue cells: the problem of protein trophic factors]. Perspektivy i problemy razvitiia biotekhnologii v ramkakh edi-nogo ekonomicheskogo prostranstva stran sodruzhestva : mat. Mezhdunarodnoi nauch.-prakt. konf., 25-28 maia 2005 g., Minsk-Naroch' Ed. A.N. Evtushenkova. Minsk, National Institute For Higher Education Publ, 2005, pp. 160-161
19. Nikandrov V.N. Peritselliuliarnyi proteoliz v zhiznedeiatel'nosti nervnykh kletok: vliianie plazminogena i streptokinazy na kul'tury nervnoi tkani. [Pericellular proteolysis in the vital activity of nerve cells: the effect of plasminogen and streptokinase on nerve tissue cultures]. Nauchnye trudy I s"ezda fiziol-ogov SNG, Sochi, Dagomys, 19-23 sentiabria 2005 g.Moskow, Medicine Publi., 2005, V. 1. 48 p.
20. Nikandrov V.N., Zhuk O.N., Gronskaia R.I., Polukoshko E.F., Pyzhova N.S., Petrusenko G.P., Romanovskaia A.A. Problemy biotekhnologii kletok nervnoi tkani: issledovani-ia belkovykh faktorov troficheskogo kharak-tera [Problems of Biotechnology of Nervous Tissue Cells: Studies of Protein Factors of a
Trophic Character]. Materials, Methods and Technologies. Bulgaria, 2007, pp. 48-66.
21. Nikandrov V.N., Zhuk O.N., Pyzhova N.S., Gronskaia, R.I., Polukoshko E.F., Roma-novskaia A.A. Znachenie plazminogena kak faktora troficheskogo kharaktera dlia kul'tur kletok nervnoi tkani [The Significance of Plasminogen as a Trophic Factor for Nervous Tissue Cell Cultures]. Vestsi Natsyianal'nai akademii navuk Belarusi. Seryia medytsynskikh navuk [Proceedings of the National Academy of Sciences of Belarus, medical series], 2008, no. 1, pp. 85-97. (In Russian)
22. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Proteinaznaia aktivnost' sub"edinits belka-neirotrofina -faktora rosta nervov [Proteinase activity of subunits of neurotrophin protein - nerve growth factor]. Belki i peptidy: IV Rossiiskii simpozium. Kazan', 2009, 254 p. (In Russian)
23. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Sposob opredeleniia proteoliticheskoi aktivnosti y-ili ¡3- sub"edinitsy faktora rosta nervov [Method for determining the proteolytic activity of the y- or p-subunit of nerve growth factor]. Pat. BY no. 11953 S1, a 20061234, 2009, 3 p. (In Russian)
24. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Metodyi is-sledovaniya proteoliza. Glava 5. [Methods for the study of proteolysis. Chapter 5]. Sov-remennyie problemyi biohimii. Metodyi is-sledovaniy [Modern problems of biochemistry. Research methods]. Minsk: Visheyshaya shkola, 2013, pp. 132-157. (In Russian)
25. Pyzhova N.S., Nikandrov, V. N O vozmozhnosti uchastiia aktivnykh form kis-loroda v rasshcheplenii nukleinovykh kislot nukleazami [On the possibility of participation of reactive oxygen species in the cleavage of nucleic acids by nucleases]. Novosti mediko-biologicheskikh nauk [News of biomedical sciences], 2009, no. 4, pp. 57-62 (In Russian)
26. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S., Votyakov V.I., Klinger Yu.E. Rol superoksidnogo radikala v realizatsii aktivatornoy funktsii streptokinazyi. Doklad Akademiya Nauk BSSR, 1987, vol. 31, no. 4, pp. 375-378. (In Russian)
27. Nikandrov V.N., Sudnik Iu.M., Pyzhova, N.S. Generirovanie aktivnykh form kisloroda proteinazami i tripsinogenom v vodno-solevykh rastvorakh [Generation of reactive
oxygen species by proteinases and trypsino-gen in aqueous salt solutions]. Doklady Akademii nauk Belarusi, 1992, vol. 36, no. 11-12, pp. 1039-1044 (In Russian)
28. Buravskii V.A. et.al. Usovershenstvovannyi metod vydeleniia vysokomolekuliarnoi formy faktora rosta nervov [An improved method for isolating the high molecular weight form of nerve growth factor]. Vestsi Akademii navuk BSSR. Seryia biialagichnykh navuk, 1984, no 4, pp. 79-88 (In Russian)
29. Pyzhova N.S. Uchastie aktivnyih form kislo-roda v protsessah proteoliza [Participation of reactive oxygen species inthe process of pro-teolysis]. Cand. sci. diss. Minsk, 1990, p. 193. (In Russian)
30. Nikandrov V.N. The oxygen-dependent pathway of human plasminogen activation / V.N. Nikandrov, N.S. Pyzhova // 18th FEBS Meeting. Abstracts. - Ljubljana, 1987. - P. 84.
31. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Kisloro-dzavisimyiy put aktivatsii plazminogena i novyie fiziko-himicheskie mehanizmyi proteoliza [Oxygen-dependent plasminogen activation pathway and new physicochemical mechanisms of proteolysis]. Izvestiya natsionalnoy akademii nauk Belarusi. Seriya mediko-biologicheskih nauk. [News of the National Academy of Sciences of Belarus. Series: Biomedical Sciences], 2001, no. 1, pp. 54-60. (In Russian)
32. Lukashevich V.S., Nikandrov V.N. Subunit organization of the complex form of nerve growth factor. Protein Sci. The Proc. Soc. Thirteenth Sympos. 1999. Vol. 8, suppl. 1, 301-S, pp. 121.
33. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S., Votyakov V.I. Vliyanie adenilovyih nukleotidov na ak-tivatornuyu funktsiyu streptokinazyi [Effect of adenylic nucleotides on the activator function of streptokinase]. Byulleten eksperimen-talnoy biologicheskoy meditsinyi [Experimental Biological Medicine Newsletter], 1987, vol. 103, no. 7, pp. 49-51. (In Russian)
34. Pyzhova N.S., Nikandrov V.N. Vliianie bi-ogennykh fosfatov na rasshcheplenie belkov proteinazami i funktsiiu aktivatorov plazminogena [The effect of biogenic phosphates on protein cleavage by proteinases and the function of plasminogen activators]. Bioorganicheskaia khimiia [Russian Journal
of Bioorganic Chemistry],2008, vol. 34, no 3, pp. 382-391 (In Russian)
35. Hasche A. Binding of ATP to nerve growth factor: characterization and relevance for bi-oactivity / A. Hasche [et al.] ////Neurochem. Internat. - 2010.- Vol. 56. - P. 276-284.
36. Ferenz K.B., Ferenz K.B., Rose K., König S., Krieglstein J. ATP-NGF-complex, but not NGF, is the neuroprotective ligand. Neurochem. Internat. 2011.Vol. 59, pp. 989-995.
37. Pyzhova N.S., Nikandrov V.N. Aktivatsiya tripsinogena byika v prisutstvii aktivnyih form kisloroda [Activation of bovine trypsin-ogen in the presence of reactive oxygen species]. Doklady Akademiya Nauk BSSR [Doklady of the National Academy of Sciences of BSSR]. 1991, vol. 35, no. 12, pp. 1130-1133. (In Russian)
38. Nikandrov V.N., Pyzhova N.S. Aktivatsiia khimotripsinogena i pepsinogena pod de-istviem aktivnykh form kislorodarov [Activation of chymotrypsinogen and pepsinogen by reactive oxygen species]. Doklady Natsion-al'noi akademii nauk Belarusi [Doklady of the National Academy of Sciences of Bela-
rus], 2001, vol. 45, no. 3, pp. 67-70 (In Russian)
39. Rajah R. et al. 7S nerve growth factor is an insulin-like growth factor-binding protein protease. Endocrinology. 1996. Vol. 137, pp. 2676-2682.
40. Rakowicz-Szulczynska E.M., Herlyn M., Koprowski H. Nerve growth factor receptors in chromatin of melanoma cells, proliferating melanocytes, and colorectal carcinoma cells in vitro. Cancer Res. 1988. Vol. 48, no24, pt 1, pp.7200-7206.
41. Andres R.Y., Jeng I., Bradshaw R.A. Nerve growth factor receptors: identification of distinct classes in plasma membranes and nuclei of embryonic dorsal root neurons. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74, no. 7. pp. 2785-2789.
42. Yankner B.A., Shooter E.M. The biology and mechanism of action of nerve growth factor. Ann. Rev. Biochem. 1982. Vol. 51, pp. 845-868.
43. Underwood C.K., Coulson E.J. The p75 neu-rotrophin receptor.Int. J. Biochem.& Cell Biol. 2008. Vol. 40, pp. 1664-1668.
Received 3 October 2022
