CC BY
128
Общая биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 149-153
УДК 579.26
ЭНТЕРОБАКТЕРИИ В СОСТАВЕ МИКРОФЛОРЫ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ МЕДОНОСНЫХ ПЧЁЛ В РАЗЛИЧНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА
© 2011 г. У.Е. Чечёткина, Н.И. Евтеева, А.И. Речкин, А.А. Радаев
Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
ulyana. 8 5 @mail. ru
Поступила в редакцию 29.05.2011
Представлены результаты исследования динамики пейзажа энтеробактерий у пчел в различные сезоны года. Установлено постоянное присутствие представителей семейства Enterobacteriaceae в составе микрофлоры пчел независимо от сезонов года. Причем в период активного медосбора в составе энтерофлоры наиболее часто обнаруживались бактерии р. Enterobacter, а в зимний период доминировали микроорганизмы р. Klebsiella.
Ключевые слова: медоносные пчелы, энтеробактерии, пищеварительная система, сезонность, микрофлора, встречаемость.
Введение
Известно, что микрофлора кишечника играет важную роль в поддержании гомеостаза организма хозяина при развитии различных заболеваний, в том числе инфекционных. Бактерии-симбионты способствуют созреванию иммунной системы, помогают утилизировать питательные вещества, поступающие в организм пчёл, подавляют развитие посторонней микрофлоры, продуцируют биологически активные вещества (витамины, ферменты и т.д.).
Представители семейства Е^егоЪа^епаееае известны как постоянные участники микро-боценозов пищеварительной системы животных, прежде всего теплокровных. Вместе с тем, недостаточно изучена микрофлора энтеробактерий пищеварительной системы у беспозвоночных, в частности насекомых.
Можно предположить, что нормальная кишечная микрофлора пчел определяет состояние пчелиной семьи. Однако до сих пор вопрос о нормальной микрофлоре пчел остается открытым, несмотря на широкий спектр микроорганизмов, обнаруживаемых в пчелиных семьях. Энтеробактерии обнаружены в составе микро-боценозов пчёл разными авторами [1, 2].
Одним из источников энтеробактерий могут служить медоносные растения. В течение одного дня пчёлы способны посетить до 3000 цветков растений, при этом они вносят в свои гнезда различные микроорганизмы, в том числе эпи-фитные и фитопатогенные. Показано, что мик-
рофлора таких медоносных растений как липа сердцевидная, малина обыкновенная, одуванчик лекарственный, клевер луговой и кипрей узколистный может содержать разных представителей семейства Enterobacteriaceae [1]. Широкое распространение представителей семейства кишечных в составе микрофлоры медоносных растений, безусловно, определяет состав энтеробактерий в организме пчёл.
Особенности климата и фенологические явления растительного мира обусловливают периодичность жизнедеятельности пчелиных семей, в годовом цикле которых выделяются два этапа: 1) летний медосбор - активная жизнь вне улья у основной массы насекомых и контакты с разной микрофлорой; 2) зимовка - обитание в замкнутом пространстве и контакты только с микрофлорой пищи и семьи.
Основным кормом пчёл в зимний период являются углеводные субстраты - мёд или сахароза. Среди микроорганизмов, активно утилизирующих углеводы, энтеробактерии занимают не последнее место. Так, бактерии родов Klebsiella и Enterobacter способны сбраживать глюкозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу и другие углеводы [3]. При брожениях, вызываемых факультативными анаэробами, в том числе представителями семейства Enterobacteriaceae, образуется большое число различных соединений, среди которых преобладают органические кислоты. Важнейшими продуктами брожения являются уксусная, муравьиная, янтарная и молочная кислоты, этанол, глицерол, ацетоин, 2,3-
100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30%
□ зима ■ лето
Рис. 1. Частота встречаемости энтеробактерий в составе микрофлоры пищеварительной системы медоносных пчёл в различные сезоны года
бутандиол, СО2 и молекулярный водород, которые могут включаться в метаболические процессы, протекающие в организме пчёл.
От качества и полноты утилизации корма зависит жизнеспособность семьи летом и, особенно, в зимний период. В связи с этим состав микроорганизмов, участвующих в утилизации корма, исключительно значим и показателен для результатов зимовки.
В настоящее время практически нет информации о том, каким образом формируется и изменяется состав энтерофлоры пчёл в зависимости от сезонов года. Таким образом, цель нашей работы - проследить динамику пейзажа энтеробактерий в составе микробоценоза пищеварительной системы медоносных пчёл в различные сезоны года.
Экспериментальная часть
Пробы пчел отбирали на пасеке в п. Доскино (Автозаводский район, г. Нижний Новгород) от «здоровой», по мнению пчеловода, семьи каждый месяц в течение года.
Непосредственно перед бактериологическим анализом насекомых усыпляли хлороформом, обрабатывали в 70%-ном этаноле для освобождения от микроорганизмов, обитающих на внешних покровах, и промывали в стерильном физиологическом растворе. Затем отделяли брюшко, извлекали кишечник. Кишечники пяти пчел, отобранных случайным образом, растира-
ли в ступке с 2 мл стерильного физиологического раствора. Передние отделы пяти пчел также суспендировали в 2 мл физиологического раствора.
Из исходных суспензий готовили десятикратные разведения до 10-6 включительно. Полученные разведения засевали на дифференциально-диагностические среды Эндо, Олькениц-кого и Chromocult («Merс&», Германия). Посевы инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Идентификацию микроорганизмов проводили с использованием пластин биохимических дифференцирующих энтеробактерии (ПБДЭ, «Диагностические системы», г. Нижний Новгород), систем индикаторных бумажных (СИБ, «Микроген», г. Нижний Новгород). Видовую принадлежность устанавливали в соответствии со схемами и таблицами, представленными в определителе бактерий Берджи [3].
Результаты и их обсуждение
Проведенные исследования позволили установить, что микробоценоз пчёл содержит представителей не менее 10 родов бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae -Klebsiella, Enterobacter, Providencia, Proteus, Citrobacter, Hafnia, Escherichia, Pantoea, Morga-nella, Serratia (рис. 1).
На основании изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических
Рис. 2. Частота встречаемости энтеробактерий в составе микрофлоры заднего и переднего отделов пищеварительной системы зимующих пчёл
признаков чистых культур, выделенных из пищеварительной системы медоносных пчел, идентифицированы 70 штаммов бактерий семейства Enterobacteriaceae, представителей 10 родов. Выявлены различия в составе энтерофлоры пищеварительной системы пчёл зимующей семьи и семьи в период активного медосбора. Так во время зимовки спектр энтеробактерий представлен шестью родами - Klebsiella, Providencia, Proteus, Citrobacter, Hafnia, Escherichia, а в летний период пятью родами семейства Enterobacteriaceae - Klebsiella, Entero-bacter, Pantoea, Morganella, Serratia. Наиболее часто в составе микрофлоры пчёл обнаруживались представители родов Klebsiella, Providen-cia, Proteus и Enterobacter.
В ходе исследования проведено сравнение энтерофлоры заднего (кишечник) и переднего (глотка, пищевод, железы) отделов пищеварительной системы медоносных пчёл.
В течение зимы пчёлы используют для питания общий субстрат, как правило, это мёд, но при его недостатке пчелиные семьи подкармливают сахарным сиропом. В период зимовки в 90% отобранных проб кишечника обнаруживались бактерии Klebsiella oxytoca (рис. 2). Возможно, такое превалирование клебсиелл связано с широким спектром утилизируемых углеводов этими бактериями и высокой ферментативной активностью данных микроорганизмов, благодаря которой ускоряется переваривание сахаров пчелами. Постоянное обнаружение Klebsiella oxytoca у зимующих пчел позволяет предположить их физиологическую роль в переваривании корма насекомыми в этот период.
Значительно реже, наряду с Klebsiella oxyto-ca, у обследованных пчёл обнаруживались мик-
роорганизмы родов Providencia, Proteus, Citro-bacter (рис. 2).
Зимой в кишечнике пчёл накапливаются продукты метаболизма, в том числе мочевая кислота и мочевина [4]. Частое обнаружение Klebsiella, Proteus и Providencia в зимний период, на наш взгляд, объясняется их способностью утилизировать мочевину, что, возможно, защищает пчёл от интоксикации и способствует поддержанию оптимального pH кишечника. Кроме этого, Proteus может участвовать в утилизации сахарного сиропа.
Бактерии р. Hafnia были изолированы от 30% зимующих пчёл. Известно, что Hafnia alvei — возбудитель диареи пчёл. Болезнь протекает обычно в конце зимы или весной, сопровождается массовой гибелью насекомых. Обследованная нами пчелиная семья, по мнению пчеловода, относилась к группе «здоровых», что подтверждает возможность выделения Haf-nia и от «здоровых» пчёл [5].
Проведенные нами исследования подтвердили постоянное присутствие энтеробактерий у пчел в течение всего периода зимовки, что отмечалось и другими авторами [2].
После зимовки в кишечнике пчел присутствует гнилостная микрофлора, которую необходимо нейтрализовать и восстановить нормальную ассоциацию микроорганизмов [6]. Причем именно в весенний период ослабленный организм пчел нуждается в стимуляции восстановительных процессов в клетках и тканях, которую невозможно осуществить без пополнения аминокислотами, витаминами, макро - и микроэлементами, источником которых могут быть микроорганизмы.
Рис. 3. Частота встречаемости энтеробактерий в составе микрофлоры заднего и переднего отделов пищеварительной системы пчёл в период активного медосбора
С наступлением теплого периода происходит изменение жизнедеятельности пчелиной семьи, которое влияет на состав микрофлоры пищеварительной системы насекомых. Когда температура воздуха в тени достигает 6-8°C и выше, пчелы совершают очистительный облёт для освобождения кишечника от каловых масс. После облета в улье начинается активная жизнь: матки резко увеличивают темпы кладки яиц, а пчелы начинают усиленно выращивать расплод [7]. С ранней весны семья включается в сбор нектара и пыльцы, наращивает количество рабочих пчел на смену зимовавшим и для усиленной работы в предстоящем медосборе.
После весеннего облёта состав энтерофлоры полностью меняется. Это может быть связано с обновлением пчелиной семьи. К концу мая старых перезимовавших пчел остается не более 3% [8].
Доминирующая зимой Klebsiella oxytoca после очистительного облёта не обнаруживается, зато появляется Enterobacter spp., причём частота встречаемости его в составе энтерофлоры пчёл в летний период составляет 90% (рис. 3).
Наиболее часто обнаруживались микроорганизмы рода Enterobacter, а из небольшого числа проб были изолированы Morganella spp., Serratia spp. и Pantoea spp. (рис. 3), что косвенно может свидетельствовать о контаминации пчел в период посещения медоносных растений. Известно, что микрофлора медоносных растений может содержать представителей семейства Enterobacteriaceae [9, 10].
Возможно, такое массивное обнаружение энтеробактеров связано с их функциями в кишечнике пчёл, а именно с их высокой ферментативной активностью [2]. Микроорганизмы р.
Enterobacter способны утилизировать глюкозу и сахарозу - углеводы, составляющие основной рацион пчёл.
В летний период пчёлы активно собирают пыльцу и нектар медоносных растений. По своему составу нектары представляют водные растворы сахарозы, глюкозы, фруктозы с небольшим содержанием органических кислот, спиртов, минеральных солей, ферментов и различных сложных ароматических веществ. Чаще всего в нектаре преобладают сахароза и фруктоза [11]. Для их сбраживания могут быть использованы ферменты, продуцируемые микроорганизмами. В том числе, Morganella и Serratia могут утилизировать аминокислоты, содержащиеся в пыльце.
Весной и в начале лета бактерии р. Klebsiella обнаружены не были, однако уже к середине лета (июль) они снова присутствовали в каждой пробе (их встречаемость вновь достигла 100%), что может свидетельствовать об их физиологической роли в организме пчелы.
Сравнение энтерофлоры кишечника и переднего отдела пищеварительной системы медоносных пчёл показало, что передний отдел пищеварительной системы в течение летнего сезона был свободен от энтеробактерий, и только в небольшом числе проб были обнаружены представители рода Klebsiella (рис. 3).
Показано, что у зимующих пчёл в переднем отделе пищеварительной системы обнаруживаются представители тех же родов энтеробактерий, что и в кишечнике и практически с такой же частотой (рис. 2). Возможно, это связано с тем, что в течение зимы пчёлы не опорожняют кишечник, а размножающиеся бактерии заселяют передний отдел пищеварительного тракта.
Заключение
Установлено постоянное присутствие представителей семейства Enterobacteriaceae в составе микрофлоры пищеварительной системы пчел независимо от сезонов года. В ходе исследования от пчел выделено 14 видов, представителей 10 родов семейства Enterobacteriaceae. Проведенные исследования показали, что содержание энтеробактерий в составе микрофлоры пищеварительной системы пчел подвержено значительным изменениям в зависимости от времени года.
Наиболее часто в зимний период энтерофлора пищеварительной системы была представлена бактериями р. Klebsiella, а в период активного медосбора доминировали микроорганизмы р. Enterobacter.
Виды энтеробактерий, обнаруженные у пчел, обладали широким спектром ферментативных возможностей, что могло обеспечивать переваривание и доступность усвоения углеводов в пищеварительной системе насекомых.
В период зимовки энтеробактерии обнаруживались в переднем отделе практически с такой же частотой, как и в заднем. Возможно, это связано с тем, что в течение зимы пчёлы не опорожняют кишечник, что способствует миграции размножающихся там бактерий в верхние отделы пищеварительного тракта. В течение летнего сезона передний отдел пищеварительной системы был свободен от энтеробактерий, и только в небольшом числе проб были обнаружены представители рода Klebsiella.
Частое обнаружение штаммов Klebsiella oxytoca в течение года позволяет предположить их особую физиологическую роль. В частности,
участие клебсиелл в утилизации субстратов корма (сахарозы) и формирование депо связанного азота в организме насекомого.
Список литературы
1. Евтеева Н.И., Речкин А.И. Поиск новых резервуаров для персистенции и участников циркуляции энтеробактерий в естественных экосистемах // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2007. № 6. С. 99-103.
2. Ляпунов Я.Э., Кузяев Р.З., Хисматуллин Р.Г., Безгодова О.А. Энтеробактерии кишечника зимующих пчел Apis mellifera mellifera L. // Микробиология. 2008. Т. 77. № 3. С. 421-428.
3. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. В 2-х т. М.: Мир, 1997.
4. Тыщенко В.П. Физиология насекомых: Учеб. пособие для студентов ун-тов, обучающихся по спец. «Биология». М.: Высшая школа, 1986. 303 с.
5. Микрофлора насекомых / Под. ред. В.И. Пол-тева, И.Н. Гриценко, А.И. Егоровой и др. Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1969. 271 с.
6. Зинченко Е.В., Панин А.Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2000. 164 с.
7. Лебедев В.И., Билаш Н.Г. Биология медоносной пчелы. М.: Агропромиздат, 1991. 239 с.
8. http://www.pchely.com/Zhizn-pchel.html (дата обращения 24.10.2010 г.)
9. Маркова Ю.А., Романенко А.С., Духанина А.В. Выделение бактерий семейства Enterobacteriaceae из растительных тканей // Микробиология. 2005. Т. 74. № 5. С. 663-666.
10. Евтеева Н.И., Речкин А.И., Крылов В.Н. Энтерофлора медоносных пчёл // Пчеловодство. 2009. № 8. С. 6-7.
11. Глухов М.М. Медоносные растения. М.: Колос, 1974. 295 с.
ENTEROBACTERIA IN HONEYBEE DIGESTIVE TRACT MICROFLORA IN DIFFERENT SEASONS U.E. Chechetkina, N.I. Evteeva, A.I. Rechkin, A.A. Radaev
This paper presents the results of the studies into enterobacterial diversity dynamics in honeybees in different seasons. The permanent presence of representatives of the family Enterobacteriaceae in honeybees has been established regardless of the season. During the active honey flow periods, the most commonly found bacteria in enter-oflora were the bacteria of the genus Enterobacter, while microorganisms of the genus Klebsiella dominated in the winter season.
Keywords: honeybees, enterobacteria, digestive system, seasonality, microflora, frequency of occurrence.
