CC BY
37
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ УДК 612.133
ЭНДОТЕЛИЙЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ТОНУСА АРТЕРИЙ У НЕФРЭКТОМИРОВАННЫХ КРЫС
Иванова Г. Т., Лобов Г. И.
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН Россия, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6 tazhim@list.ru
Реферат
Цель. Исследовать механизмы эндотелизависимой дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии у нефрэктомированных крыс in vitro.
Материалы и методы. Крыс подвергали двухэтапному удалению 5/6 массы почек. Через 8 недель у них выделяли фрагменты аорты и верхней брыжеечной артерии. Сокращения сосудов in vitro регистрировали миографом с датчиком FORT-IO.
Результаты. Ацетилхолин (1х10-10 — 1х10-4 М) вызывал дозозависимую дилатацию аорты и верхней брыжеечной артерии. Продукцию эндотелием оксида азота ингибировали L-NAME, простациклина — индометацином. BKCa каналы блокировали тетраэтиламмонием, 5КСа каналы — TRAM-34. Установлено, что ацетилхолин-индуцируемая дилатация аорты и верхней брыжеечной артерии контрольных и нефрэктомированных крыс опосредована оксидом азота, простациклином и эндотелиальной гиперполяризацией. Нефрэктомия приводила к выраженному снижению ацетилхолин-индуцируемой вазо-дилатации (аорты — на 25,2+1,8%, верхней брыжеечной артерии — на 27,2+2,1%), что происходило преимущественно за счет уменьшения компонента дилатации, обусловленного оксидом азота. Дила-таторный эффект ацетилхолина, реализуемый через продукцию простациклина, не изменялся. Аце-тилхолин-индуцируемая дилатация аорты и верхней брыжеечной артерии частично была обусловлена активацией кальций-чувствительных калиевых каналов большой и промежуточной проводимости. Не-фрэктомия приводила к снижению дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии, обусловленной эндотелиальной гиперполяризацией.
Заключение. Нарушение агонист-индуцируемой дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии при уремии опосредовано преимущественно снижением вазодилататорных функций оксида азота и не компенсируется системой эндотелиальной гиперполяризацией, которая была предложена ранее в качестве важной резервной системы при снижении производства оксида азота.
Ключевые слова: нефрэктомия, эндотелий, вазодилатация, оксид азота, простациклин, эндотелиаль-ная гиперполяризация.
Введение
Хроническая болезнь почек - одно из распространенных неинфекционных заболеваний, которым по данным Американского фонда почки страдают около 10% населения США [1]. При хронической болезни почек 4-5 стадий наиболее актуальной является проблема развития сердечно-сосудистой патологии, т.н. кардиоренального синдрома [2]. У пациентов с хронической болезнью почек 5 стадии сердечно-сосудистые заболевания возникают в среднем в 20-35 раз чаще, чем в общей популяции [3]. Повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний при хронической болезни почек является многофакторным, но прежде всего он связан с уремией. При хронической болезни почек 5 стадии, несмотря на качественно проводимый диализ, в плазме крови пациентов накапли-
вается большая группа веществ, объединяемых под общим названием «уремические токсины», число которых приближается к сотне [4]. Большая часть уремических токсинов являются биологически активными и способны запускать патологические процессы практически в любом органе, но максимально негативный эффект они проявляют в отношении сердечно-сосудистой системы [5]. Уже на 2 стадии хронической болезни почек начинает развиваться кальцификация интимы и медии артерий и наблюдаются фенотипиче-ские изменения сосудистых гладкомышечных клеток, что приводит к экспрессии коллагена I типа и последующему ремоделированию внеклеточного матрикса в стенке сосудов [6].
Высокая заболеваемость сердечно-сосудистыми болезнями среди пациентов с хронической болезнью почек связана не только с кальцификацией сосудов,
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
но и с эндотелиальной дисфункцией, представляющей собой системный процесс, включающий ослабление эндотелийзависимой вазодилатации и сопровождающийся сужением сосудов и структурной перестройкой микроциркуляторного русла [7]. Целостность эндотелия и выполнение им специфических функций имеют решающее значение для адекватной регуляции кровотока [8]. Из доклинических и клинических исследований известно, что некоторые уремические токсины (асимметричный диметиларгинин, гомоцистеин) способны ингибировать пролиферацию эндотелиаль-ных клеток и приводить к развитию эндотелиальной дисфункции [9]. Ингибирование эндотелиальной N0-синтазы у пациентов с хронической болезнью почек приводит к нарушениям регуляции тонуса сосудов и провоцирует длительные тонические сокращения их гладкомышечных клеток. Уремические токсины также приводят к увеличению выработки активных форм кислорода, которые вызывают окислительный стресс. Показано, что активные формы кислорода в большинстве случаев, и в особенности в сосудах микроциркуляторного русла, оказывают сосудосуживающий эффект.
Несмотря на наличие большого количества клинических и экспериментальных работ, посвященных исследованию негативных эффектов уремии на сердечно-сосудистую систему, многие аспекты регуляции сосудистого тонуса при хронической болезни почек изучены недостаточно [10]. В частности, мало данных о специфических изменениях эндотелийзависимой регуляции тонуса в артериях разного калибра, выполняющих различные функции (коллекторного и рези-стивного типа). Практически нет данных о возможном влиянии уремических токсинов на эндотелийзависи-мую регуляцию тонуса артерий посредством воздействия на процессы образования в сосудистой стенке и инактивации простагландинов и эндотелиального гиперполяризующего фактора [11]. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение механизмов нарушения эндотелийзависимой регуляции тонуса артерий у нефрэктомированных крыс (у которых обычно через 2 месяца после нефрэктомии выявляются признаки хронической почечной недостаточности [12]).
Материалы и методы исследования
При моделировании хронической почечной недостаточности у лабораторных животных используются различные модели: резекция 5/6 почек, добавление в пищу аденина, диабетическая нефропатия (моделируется введением стрептозотоцина), первичная клубочковая нефропатия, вызываемая однократной инъекцией адриамицина и пуромицина, и нокаутные животные [13]. В нашей работе мы применяли субтотальную нефрэктомию (5/6 почек), поскольку развивающуюся у крыс после нефрэктомии почечную недостаточность можно считать достаточно адекватной моделью большинства типов хронической почечной недостаточности у человека [13].
Исследование было одобрено этическим комитетом Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. В экс-
перименте использовали самцов крыс линии Wistar из биоколлекции лабораторных млекопитающих Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (22 животных) в возрасте 4 месяца и массой 330-350 г. В течение всего эксперимента животных содержали в условиях вивария на стандартном пищевом рационе и свободном доступе к воде.
Экспериментальные животные были разделены на две группы: первую составили ложнооперированные животные (n=10), вторая группа крыс (n=12) подвергалась нефрэктомии 5/6 массы почечной ткани. Для создания модели хронической болезни почек использовали нефрэктомию, проводимую в два этапа. На первом этапе удаляли 2/3 части почечной ткани левой почки. Для этого после трихотомии и антисептической обработки кожи делали дорсовентраль-ный разрез, через который левую почку выводили в операционное поле, лигировали сосудистый пучок (почечную артерию и вену) и мочеточник шелковой нитью, предварительно освободив почку от капсулы для сохранения надпочечников. После этого удаляли верхний и нижний полюса почки, а также часть почечной ткани с латерального края таким образом, чтобы сохранялась 1/3 часть ткани почки вокруг почечной лоханки. После гемостаза культя почки возвращалась на место, мышцы и кожа послойно ушивались. Через неделю после резекции 2/3 массы левой почки проводили тотальную нефрэктомию контрлатеральной правой почки способом, аналогичным описанному выше первому этапу; почечная артерия и вена, а также мочеточник при этом полностью перевязывались. На каждом этапе нефрэктомии после наложения швов животным вводили по 10 мл физиологического раствора с целью восстановления водно-электролитного баланса и помещали в теплую клетку до полного восстановления после анестезии, а затем возвращали в стандартные клетки. В группе ложнооперированных крыс все животные подвергались аналогичным хирургическим манипуляциям, но без нефрэктомии.
Через 8 недель осуществляли эвтаназию животных посредством обескровливания и иссекали грудную аорту и верхнюю брыжеечную артерию. До исследования препараты хранили в физиологическом солевом растворе при температуре от +2 до +4о С. Перед исследованием аорту и верхнюю брыжеечную артерию аккуратно очищали от жира и окружающей соединительной ткани, затем вырезали сегменты длиной 2 мм. Было подготовлено 23 сегмента аорты и 17 сегментов верхней брыжеечной артерии от нефрэктомирован-ных крыс и 18 сегментов аорты и 15 сегментов верхней брыжеечной артерии от контрольных животных. У части препаратов механически удаляли эндотелий. Подготовленные сосудистые препараты помещали в термостатируемую (+37,0±0,1о С) камеру миографа с проточным физиологическим солевым раствором следующего состава (ммоль/л): NaCl - 120,4; KCl -5,9; CaCl2 - 2,5; MgCl2 - 1,2; NaH2PO4 - 1,2; NaHCO3 -15,5; глюкоза - 11,5. Физиологический раствор сатурировали газовой смесью, состоящей из 95% О2 и 5% СО2. Для измерения силы сокращений препаратов использовали датчик FORT-10 (WPI, USA). Препараты
подвергали исходному натяжению, соответствующему трансмуральному давлению 90 мм рт. ст. и после 30-минутной стабилизации регистрировали параметры их сократительной активности. Подробно методика исследования описана ранее [14].
В исследовании использовали вещества: ацетил-холин (Acetylcholine chloride, Sigma-Aldrich) 1х10-10 -1х10-4 моль/л; L-NAME (Л^-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride, ICN Biomedicals) 1х10-4 моль/л; индоме-тацин (Indomethacin, Sigma-Aldrich), 1х10-5 моль/л; те-траэтиламмоний (Tetraethylammonium chloride, Sigma-Aldrich) 1х10-3 моль/л; TRAM 34 (1-[(2-Chlorophenyl) diphenylmethyl]-1H-pyrazole, Sigma-Aldrich), 1х10-6 моль/л; фенилэфрин (Phenylephrine, Sigma-Aldrich), 1х10-6 моль/л.
Индометацин предварительно растворяли в ди-метилсульфиде (10 мг/мл). Полученный раствор добавляли в физиологический раствор до достижения необходимой концентрации. Диметилсульфид в разведении 1/1000 не вызывал значимых изменений параметров сократительной активности аорты и верхней брыжеечной артерии.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы «StatSoft STATISTICA 6.1.478». Поскольку полученные данные имели нормальное распределение, они представлены в виде средних значений со стандартной ошибкой среднего (M±SE). Для установления достоверности
различий использовали ^критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р <0,05.
Результаты исследования
Через 8 недель после нефрэктомии среднее артериальное давление у крыс составило 133±9,3 мм рт. ст., в контрольной группе - 97±5,1 мм рт. ст., частота сокращений сердца у нефрэктомированных крыс составила 417±28 уд/мин, в контрольной группе - 378±22 уд/мин.
Оценку тонуса сосудистых сегментов начинали с 30-ой минуты эксперимента после стабилизации тонуса исследуемых препаратов. Сегменты аорты и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных животных в стандартных условиях демонстрировали более высокий уровень тонического напряжения по сравнению с препаратами, полученными от интакт-ных крыс. Деэндотелизация приводила к повышению тонуса аорты и верхней брыжеечной артерии как у контрольных, так и у нефрэктомированных животных, при этом прирост тонуса после деэндотелизации в сосудах нефрэктомированных крыс был меньшим по сравнению с сосудами контрольных. Так, увеличение тонуса аорты у контрольных крыс после деэндотели-зации составило 14,2±2,1%, у нефрэктомированных крыс - 11,6±1,6%, увеличение тонуса верхней брыжеечной артерии - 16,7±2,3% и 12,5±1,7% соответственно (рис. 1).
□ Энд- ВН/Э ШН/Э, (Энд-)
Рисунок 1. Величина тонуса деэндотелизированных и интактных аорты и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных и контрольных крыс в стандартных условиях по сравнению с тонусом интактных сосудов
контрольных животных, принятым за 100%.
Обозначения. ВБА - верхняя брыжеечная артерия; (Энд-) - деэндотелизированные сосуды контольных крыс; (Н/Э) - интактные сосуды нефрэктомированных крыс; (НЭ, (Энд-) - деэндотелизированные сосуды нефрэктомированных крыс. Различия достоверны по отношению к величинам тонуса интактных сосудов, * - р <0,05.
Реакции аорты и верхней брыжеечной артерии на ацетилхолин. С целью исследования механизмов эндотелийзависимой вазодилатации оценивали реакции сегментов аорты и верхней брыжеечной артерии на ацетилхолин (АХ). Поскольку при исходном тонусе дилататорные реакции на АХ имеют небольшую амплитуду, обычно подобные исследования проводятся на предварительно сокращенных сосудах. В нашей работе предконтрактирование сосудов осуществляли посредством добавления в физиологический раствор фенилэфрина. В ответ на применение фенилэфрина в аорте и верхней брыжеечной артерии быстро повышался уровень тонического напряжения. После стабилизации тонуса на новом уровне в камеру вводи-
ли АХ в нарастающих концентрациях (1х10-10-1х10-4 моль/л). АХ в концентрации 1х10-10 моль/л не оказывал влияния на тонус сегментов аорты и верхней брыжеечной артерии. Так как максимальная вазоди-латация на АХ в аорте и верхней брыжеечной артерии наблюдалась при концентрации 1х10-4 и 1х10-5 моль/л соответственно (рис. 2), то в последующих экспериментах применяли АХ в концентрации 1х10-5 моль/л. Сегменты аорты и верхней брыжеечной артерии от нефрэктомированных животных при применении АХ в диапазоне концентраций 1х10-8-1х10-4 моль/л демонстрировали более высокий уровень тонуса по сравнению с сосудистыми препаратами контрольных животных.
0 -|
-10 -
-20 ■
-30 ■
Чр -40 ■
и >■ -50 ■
I
£ -60 ■
-70 ■
-80 ■
-90 ■
-100 ■
-10 -9 -8 -7 -6
Логарифм концентрации АХ
■Аорта О Аорта, Н/Э
»ВБА
■ВБА, Н/Э
*
"Ч;
-4
Рисунок 2. Влияние ацетилхолина на тонус аорты и верхней брыжеечной артерии контрольных и нефрэктомированных
крыс, предварительно сокращенных фенилэфрином.
Обозначения. На оси абсцисс - логарифм концентрации ацетилхолина (АХ), на оси ординат - релаксация сосудистых препаратов (в % от амплитуды сократительной реакции на фенилэфрин). ВБА - верхняя брыжеечная артерия; Н/Э - сосуды нефрэктомированных крыс. Различия в реакциях сосудов контрольных и нефрэктомированных крыс на АХ достоверны, * - р <0,001, # - р <0,01.
Роль NO в АХ-индуцируемой дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии. С целью исследования роли N0 в регуляции тонуса аорты и верхней брыжеечной артерии интактных и нефрэктомирован-ных животных в следующей серии экспериментов в раствор добавляли ингибитор синтазы N0 - Ь^АМЕ. Затем в раствор вводили фенилэфрин, и после стабилизации тонуса на фоне действия фенилэфрина в раствор добавляли АХ в концентрации 1х10-5 моль/л. В этих опытах АХ приводил к снижению тонического напряжения аорты и верхней брыжеечной артерии как контрольных, так и нефрэктомированных крыс, при этом у последних амплитуда дилатации была зна-
чительно меньше по сравнению с контрольными животными (рис. 3).
Роль простаноидов в АХ-индуцируемой дила-тации аорты и верхней брыжеечной артерии. В литературе имеется достаточное количество данных, свидетельствующих о том, что простациклин (PGI2) синтезируется эндотелиальными клетками различных сосудов и, как правило, приводит к вазодилатации [15, 16]. Участие PGI2 в вазодилатации артерий крыс было показано и нами [14]. В данном исследовании мы провели эксперименты по исследованию возможной роли PGI2 в дилататорных реакциях на АХ артерий нефрэктомированных крыс. С целью ингибирования
Рисунок 3. Дилатация предварительно сокращенных фенилэфрином аорты и верхней брыжеечной артерии контрольных и нефрэктомированных крыс при действии ацетилхолина; ацетилхолина на фоне L-NAME; ацетилхолина на фоне L-NAME и индометацина, выраженная в % от сократительной реакции сосудов на фенилэфрин.
Обозначения. ВБА - верхняя брыжеечная артерия; Н/Э - сосуды нефрэктомированных крыс. АХ - ацетилхолин, Indo - индометацин. Различия между реакциями сосудов на АХ и реакциями на AX+L-NAME достоверны при * - р<0,001. Различия между реакциями сосудов на AX+L-NAME и реакциями на AX+L-NAME+Indo достоверны при # - р <0,05.
Аорта Аорта, Н/Э ВБА ВБА, Н/Э
-100
ШАХ ■ AX+L-NAME ■ AX+L-NAME+Indo
синтеза простаноидов в раствор вводили индометацин, являющийся сильным ингибитором циклоокси-геназы (СОХ), относительно селективном для СОХ-1. Учитывая сложные и не до конца понятные взаимовлияния эндотелиальных вазодилататоров, в особенности при патологии [8], для исключения влияния N0 вместе с индометацином в раствор вводили Ь^АМЕ. Спустя 20 мин в раствор добавляли АХ и оценивали дилататорные реации аорты и верхней брыжеечной артерии. Результаты этой серии опытов представлены на рисунке 3. Ингибирование СОХ сопровождалось уменьшением амплитуды АХ-индуцируемой дилата-ции аорты и верхней брыжеечной артерии.
Роль эндотелиальной гиперполяризации (EDH) в АХ-индуцируемой дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии. В заключительной серии экспериментов были проведены опыты с целью оценки роли эндотелиальной гиперполяризации в дилататор-ных реакциях на АХ предконтрактированных аорты и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных и контрольных крыс. Эксперименты проводили на фоне ингибирования продукции N0 и PGI2. На первом этапе применяли блокатор Са2+-активируемых К+-каналов большой проводимости - тетраэтиламмоний (ТЭА), на втором этапе дополнительно вводили блокатор Са2+-активируемых К+-каналов промежуточной проводимости - TRAM-34. Блокаторы добавляли в раствор за 15 минут до начала действия АХ. Результа-
ты этих опытов представлены на рисунке 4. Вклад N0, PGI2 и EDH рассчитывали как разницу в величинах тонуса сосудов до и после применения соответствующего ингибитора (блокатора).
Обсуждение результатов
Наиболее распространенными осложнениями почечной недостаточности являются патологические изменения сердечно-сосудистой системы, пациенты с хронической почечной недостаточностью чаще умирают от сердечно-сосудистых заболеваний, чем от почечной недостаточности [17]. И хотя некоторые механизмы, предрасполагающие к высокому риску сердечно-сосудистых заболеваний у пациентов с хронической почечной недостаточностью, более или менее понятны, роль других изучена недостаточно [10]. Дисфункцию эндотелия, развивающуюся под действием уремических токсинов и проявляющуюся выраженными функциональными изменениями эндотелиаль-ных клеток, принято считать важнейшим фактором, приводящим к тяжелой патологии сердечно-сосудистой системы у этой категории больных [18]. И хотя общепризнанно, что эндотелиальная дисфункция является важнейшей общей характеристикой пациентов с хронической почечной недостаточностью, лежащие в ее основе патофизиологические механизмы изучены мало [1, 10, 19]. По-прежнему остается открытым во-
Аорта
Аорта, Н/Э
ВБА
ВБА, Н/Э
-100
О АХ
Ii AX+L-NAME+lndo+ ТЭА
ШАХ+L-NAME
■ AX+L-NAME+lndo+T3A+TRAM 34
Рисунок 4. Дилатация предварительно сокращенных фенилэфрином аорты и верхней брыжеечной артерии контрольных и нефрэктомированных крыс при действии ацетилхолина; ацетилхолина на фоне L-NAME; на фоне L-NAME, индометацина и тетраэтиламмония; на фоне L-NAME, индометацина, тетраэтиламмония и TRAM-34, выраженная в % от сократительной реакции сосудов на фенилэфрин.
Обозначения. ВБА - верхняя брыжеечная артерия; Н/Э - сосуды нефрэктомированных крыс. АХ - ацетилхолин, Indo - индометацин, ТЭА - тетраэтиламмоний. Различия в амплитудах релаксации аорты и ВБА нефрэктомированных животных достоверны по отношению к реакциям на АХ+L-NAME при * - р <0,01; различия в амплитудах релаксации аорты и ВБА нефрэктомированных животных достоверны по отношению к реакциям на AX+L-NAME+Indo+ТЭА при # - р <0,05.
прос: эндотелиальная дисфункция является прямым следствием накопления уремических токсинов или это осложнение вторичной гипертензии, характерной для этих пациентов [20].
Результаты наших исследований показали, что в стандартных условиях тонус аорты и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных крыс был достоверно выше по сравнению с контрольными крысами. Деэндотелизация сосудов от контрольных и нефрэк-томированных крыс сопровождалась повышением тонуса аорты и верхней брыжеечной артерии, что подтверждает участие эндотелия в формировании тонуса этих сосудов как в физиологических условиях, так и при нефрэктомии. В то же время необходимо отметить, что удаление эндотелия в аорте и верхней брыжеечной артерии нефэктомированных крыс приводило к меньшему возрастанию базального тонуса сосудов по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о снижении вазодилататорной функции эндотелия у нефрэктомированных крыс. Поскольку базальный тонус сосудов в значительной степени зависит от NO [21], наши данные косвенно указывают на снижение базальной продукции NO у нефрэктоми-рованных крыс.
При оценке вазодилататорной функции эндотелия как в клинике, так и в экспериментах широко используется проба с АХ [22]. В нашей работе были
выявлены значительные различия в реакциях аорты и верхней брыжеечной артерии у нефрэктоми-рованных крыс на АХ по сравнению с контролем. Величина АХ-индуцируемой вазодилатации в аорте нефрэктомированных крыс составила 62,4±4,11% от амплитуды сокращения, вызванного фенилэфрином, в то время как в аорте контрольных животных она составляла 87,8±5,32%. В верхней брыжеечной артерии АХ-индуцируемая дилатация составила 66,5±5,46% и 93,7±6,72% соответственно. Полученные данные свидетельствуют о снижении вазодилататорной функции эндотелия у нефрэктомированных животных не только в состоянии покоя, но и при стимуляции эндотелия АХ.
В последние годы постулируется, что эндотели-альная дисфункция и, следовательно, дисрегуляция сосудистого тонуса у пациентов с хронической почечной недостаточностью может быть вызвана либо нарушением продукции NO из-за снижения экспрессии эндотелиальной изоформы NOS [23], либо уменьшением его биодоступности [24]. Результаты наших экспериментов с применением ингибитора синтеза NO -L-NAME подтверждают, что дилататорный эффект NO существенно снижается в аорте и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных крыс как в абсолютном, так и в относительном выражении.
Полученные нами данные не позволяют определить причину снижения вазодилататорного эффекта
N0-сигнального пути в сосудах нефрэктомированных крыс (возможное ингибирование €N08 или снижение биодоступности N0), однако демонстрируют выраженное уменьшение дилататарного эффекта N0. Так, в верхней брыжеечной артерии у нефрэктомированных крыс дилататорный эффект N0 снижался в среднем на 76,4±4,88% по сравнению с контролем. У уремических животных возможны несколько механизмов, приводящих к снижению эффективности N0-сигнального дилататорного механизма. Так, к ослаблению зависящей от €N08 релаксации может приводить характерный для уремии повышенный уровень гомоцистеина, способствующий увеличению оксидативного стресса и ингибирующий образование N0 [25]. Снижение дилататорной реакции на эндотелий-зависимые N0-опосредуемые стимулы при хронической почечной недостаточности может быть также обусловлено высокой концентрацией асимметричного диметиларги-нина, который оказывает непосредственное ингиби-рующее влияние на еN08 [20].
Роль простаноидов в регуляции сосудистого тонуса при почечной недостаточности изучена значительно слабее. В разных источниках мнения о роли этих вазо-дилататоров при хронической почечной недостаточности противоположны [16, 17, 26]. Учитывая влияние N0 на продукцию других эндотелиальных вазодилататоров [27, 28], исследования роли простаноидов в регуляции тонуса артерий мы проводили на фоне ингибирования N0-синтазы. Добавление индометацина в раствор, содержащий Ь^АМЕ, сопровождалось снижением АХ-индуцируемой вазодилатации аорты и верхней брыжеечной артерии нефрэктомированных и контрольных животных. Хорошо известно, что в стенке артерий образуются два простаноида, способные привести к расслаблению гладкомышечных клеток: простагландины PGI2 и PGE2 [26]. Известно также, что в физиологических условиях производство простациклина в 10-100 раз больше по сравнению с другими простагландина-ми [27]. Таким образом, есть основания полагать, что в наших опытах при АХ-стимуляции аорты и верхней брыжеечной артерии именно PGI2 приводил к вазоди-латации. Имеются данные, что производство эндотелием PGI2 значительно снижается у старых животных, в наибольшей степени подобное снижение выявляется в хронических моделях артериальной гипертензии [29]. В нашем исследовании установлено, что значение PGI2 в эндотелийзависимой вазодилатации артерий у не-фрэктомированных животных не снижается, величина PGI2-опосредованной релаксации остается практически такой же, как и у крыс контрольной группы. По-видимому, в уремической среде комплекс ферментов, обеспечивающих синтез PGI2 (фосфолипаза А2, цикло-оксигеназа и простациклинсинтаза), оказывается более устойчивым по сравнению с N0-синтазой, и продукция эндотелием PGI2 на фоне уремии практически не изменяется.
Что касается роли при хронической почечной недостаточности «третьего эндотелиального вазодилата-тора» - эндотелиальной гиперполяризации, то следует, прежде всего, отметить, что системе EDH уделялось мало внимания. В то же время данные исследований
указывают на то, что EDH-вазодилатационная система может играть определенную роль в эндотелиальной дисфункции при хронической почечной недостаточности у человека или при ее моделировании у животных [11]. Эндотелийзависимая гиперполяризационная релаксация сосудов связана с гиперполяризацией их эндотелиальных и гладкомышечных клеток [30]. В последние годы термин «EDHF" редко используется в литературе, поскольку единый гиперполяризующий фактор не выявлен. Установлено, что у разных видов в разных сосудистых регионах роль EDHF выполняют различные соединения (эпоксиэйкосатриеновые кислоты, 11,12,15-тригидроксиэйкосатриеновые кислоты, пе-роксид водорода, монооксид углерода, сероводород, К+ и др.). Более того, имеются доказательства, что гиперполяризация может распространяться с эндотелиальных клеток на гладкомышечные клетки через миоэндотели-альные контакты в отсутствие каких-либо химических посредников. В связи с этим было предложено использовать термин EDH [30]. При этом следует отметить, что независимо от химической природы посредника общим механизмом при эндотелиальной гиперполяризации является активация эндотелиальных Са2+-активируемых К+-каналов малой (SKCa), промежуточной (1КСа), и реже, большой проводимости (ВКСа) [11, 27, 30].
Поскольку в эндотелиоцитах аорты и брыжеечных артерий крысы представлены Са2+-активируемые К+-каналы большой и промежуточной проводимости [31], в нашей работе использовали два блокатора Са2+-активируемых К+-каналов - ТЭА и TRAM 34. Ввиду эффекта торможения NO на EDH-опосредованные ответы, способность кровеносных сосудов генерировать EDH может быть обнаружена только при условии ингибиро-вания NO-сигнального пути [32]. В связи с этим, ТЭА и TRAM 34 применяли на фоне ингибирования продукции NO и PGI2. Применение ТЭА сопровождалось снижением амплитуды АХ-индуцируемой вазодилатации в аорте и верхней брыжеечной артерии как контрольных, так и нефрэктомированных животных. Анализ абсолютных значений величин АХ-индуцируемой релаксации аорты и верхней брыжеечной артерии, опосредованной активацией ВКСа каналов, выявил ее снижение у нефрэктомированных животных по сравнению с контролем. Применение TRAM 34 также выявило у нефрэктомированных животных снижение величины EDH-опосредованной релаксации аорты и верхней брыжеечной артерии, реализуемой через активацию S^a каналов, при этом изменения амплитуды дилатации были более выраженными по сравнению с эффектом блокирования ВКСа каналов.
В нашем исследовании величины АХ-индуцируемой EDH-опосредованной дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии у нефрэктомированных крыс с небольшим увеличением артериального давления за время эксперимента (< 10 мм рт. ст.) практически не отличались от таковых у нефрэктомированных крыс с существенным увеличением артериального давления (> 20 мм рт. ст.). Эти данные позволяют предположить, что уремические токсины, но не артериальная гипер-тензия, являются основными факторами, приводя-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
щими к нарушению функции BKCa и SKCa каналов в крупных артериях крыс. Следует отметить, что ранее, при исследовании эффектов гипергомоцистеинемии (гомоцистеин является одним из важнейших уремических токсинов) на коронарные артерии крыс, было показано прямое ингибирующее влияние гомоцисте-ина на IKCa и SKCa каналы эндотелиальных клеток коронарных артерий [33].
Заключение
Результаты, полученные при исследовании эндоте-лизависимой дилатации аорты и верхней брыжеечной артерии у нефрэктомированных крыс, позволяют сделать следующие выводы.
1. Тонус артерий эластического и мышечного типа у уремических животных достоверно повышен по сравнению с контрольными.
2. Вазодилататорная функция эндотелия в крупных артериях у животных с хронической почеч-
ной недостаточностью снижена как в условиях покоя, так и при стимуляции эндотелия ацетил-холином.
3. Нарушение вазодилатации при уремии опосредовано преимущественно снижением вазоди-лататорных функций NO и не компенсируется системой EDH, которая была предложена ранее в качестве важной резервной системы при снижении производства NO.
4. Уремия приводит к уменьшению релаксационного эффекта ацетилхолина, реализуемого посредством эндотелиальной гиперполяризации, обусловленной активацией Са2+-активируемых К+-каналов большой и промежуточной проводимости.
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных научных исследований государственных академий на 2013-2020 годы (ГП-14, раздел 65).
ЛИТЕРАТУРА
1. Collins AJ, Foley RN, Chavers B, Gilbertson D, Herzog C, Johansen K, et al. United States Renal Data System 2011 Annual Data Report: Atlas of chronic kidney disease & endstage renal disease in the United States. Am J Kidney Dis. 2012; 59 (1, Suppl 1): A7 e1-420. DOI: 10.1053/j.ajkd.2011.11.015.
2. Gargiulo R, Suhail F, Lerma EV. Hypertension and chronic kidney disease. Dis Mon. 2015; 61 (9): 387-395. DOI: 10.1016/j. disamonth.2015.07.003.
3. Ohno Y, Kanno Y, Takenaka T. Central blood pressure and chronic kidney disease. World J Nephrol. 2016; 5 (1): 90-100. DOI: 10.5527/wjn.v5.i1.90.
4. Ito S, Yoshida M. Protein-bound uremic toxins: new culprits of cardiovascular events in chronic kidney disease patients. Toxins (Basel). 2014; 20 (6, 2): 665-678. DOI: 10.3390/toxins6020665.
5. Vanholder R, Baurmeister U, Brunet P, Cohen G, Glorieux G, Jankowski J. A bench to bedside view of uremic toxins. J Am Soc Nephrol. 2008; 19 (5): 863-870. DOI: 10.1681/ ASN.2007121377.
6. Gross P, Six I, Kamel S, Massy ZA. Vascular toxicity of phosphate in chronic kidney disease: beyond vascular calcification. J Circ. 2014; 78 (10): 2339-2346. DOI: 10.1253/circj.CJ-14-0735.
7. Abularrage CJ, Sidawy AN, Aidinian G, Singh N, Weiswasser JM, Arora S. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. J Vasc Surg. 2005; 42 (3): 574-581. DOI: 10.1016/j.jvs.2005.05.019.
8. Schiffrin EL. A critical review of the role of endothelial factors in the pathogenesis of hypertension. J Cardiovasc Pharmacol. 2001; 38 (Suppl.2): S3-S6.
9. Jourde-Chiche N, Dou L, Cerini C, Dignat-George F, Brunet P. Vascular incompetence in dialysis patients-protein-bound uremic toxins and endothelial dysfunction. Semin Dial. 2011; 24 (3): 327-337. DOI: 10.1111/j.1525-139X.2011.00925.x
10. Schiffrin EL, Lipman ML, Mann JF. Chronic Kidney Disease: Effects on the Cardiovascular System. Circulation. 2007; 116 (1): 85-97. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.106.678342
11. Martinez-Leon JB, Segarra G, Medina P, Vila JM, Lluch P, Peiro M., et al. Ca2+-activated K+ channels mediate relaxation of forearm veins in chronic renal failure. J Hypertens. 2003; 21 (10): 1927-1934. DOI: 10.1097/01.hjh.0000084761.37215.3c
12. Hasdan G, Benchetrit S, Rashid G, Green J, Bernheim J, Rathaus M. Endothelial dysfunction and hypertension in 5/6 nephrectomized rats are mediated by vascular superoxide. Kidney Int. 2002; 61 (2): 586-590. DOI: 10.1046/j.1523-1755.2002.00166.x
13. Bao YW, Yuan Y, Chen JH, Lin WQ. Kidney disease models: tools to identify mechanisms and potential therapeutic targets. Zool Res. 2018; 39 (2):72-86. DOI: 10.24272/j.issn.2095-8137.2017.055
14. Лобов Г.И., Васина Е.Ю., Малахова З.Л., Власов Т.Д. Роль различных эндотелиальных вазодилататоров в регуляции тонуса артерий у крыс. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2018; 104 (3): 327-337.
15. [Lobov G.I., Vasina Ye.Yu., Malakhova Z.L., Vlasov T.D. The role of various endothelial vasodilators in the regulation of arterial tone in rats. Ross. fiziol. zhurn. im. I.M. Sechenova. 2018; 104 (3): 327-337. (In Russ.)].
16. Feletou M, Verbeuren TJ, Vanhoutte PM. Endothelium-dependent contractions in SHR: a tale of prostanoid TP and IP receptors. Br J Pharmacol. 2009; 156 (4): 563-574. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2008.00060.x
17. Parkington HC, Coleman HA, Tare M. Prostacyclin and endothelium-dependent hyperpolarization. Pharmacol Res. 2004; 49 (6): 509-514. DOI: 10.1016/j.phrs.2003.11.012
18. Stenvinkel P, Pecoits-Filho R, Lindholm B. Coronary Artery Disease in End-Stage Renal Disease: No Longer a Simple Plumbing Problem. J Am Soc Nephrol. 2003; 14 (7): 1927-1939. DOI: 10.1097/01.ASN.0000069165.79509.42
19. Chhabra N. Endothelial dysfunction - A predictor of atherosclerosis. Internet J Med Update. 2009; 4: 33-41.
20. Лобов Г.И., Исачкина А.Н., Гурков А.С. Особенности регуляции сосудов микроциркуляторного русла у пациентов с хронической болезнью почек, получающих лечение пе-ритонеальным диализом. Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2016; 15 (1): 65-72.
21. [Lobov G.I., Isachkina A.N., Gurkov A.S. Features of the regulation of the vessels of the microcirculatory bed in patients with chronic kidney disease receiving peritoneal dialysis treatment. Regionarnoye krovoobrashcheniye i mikrotsirkulyatsiya. 2016; 15 (1): 65-72. (In Russ.)].
22. Zoccali C, Mallamaci F, Tripepi G. Traditional and emerging cardiovascular risk factors in end-stage renal disease. Kidney Int. 2003; 85: S105-S110. DOI: 10.1046/j.1523-1755.63.s85.25.x
23. Puzserova A, Bernatova I. Blood pressure regulation in stress: focus on nitric oxide-dependent mechanisms. Physiol Res. 2016; 65 (Suppl. 3): S309-S342.
24. Lind L. A combined test of acetylcholine-mediated vasodilation of both the forearm resistance vessels and the radial artery. Clin
Physiol Funct Imaging. 2013; 33 (3): 206-210. DOI: 10.1111/ cpf.12014.
25. Billecke SS, D'Alecy LG, Platel R, Whitesall SE, Jamerson KA, Perlman RL, et al. Blood content of asymmetric dimethylarginine: new insights into its dysregulation in renal disease. Nephrol Dial Transplant. 2009; 24 (2): 489-496. DOI: 10.1093/ndt/gfn500
26. Utu D, Pantea S, Duicu OM, Muntean DM, Stürza A. Contribution of monoamine oxidases to vascular oxidative stress in patients with end-stage renal disease requiring hemodialysis. Can J Physiol Pharmacol. 2017; 95 (11): 1383-1388. DOI: 10.1139/cjpp-2017-0067.
27. Looft-Wilson RC, Ashley BS, Billig JE, Wolfert MR, Ambrecht LA, Bearden SE. Chronic diet-induced hyperhomocysteinemia impairs eNOS regulation in mouse mesenteric arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008; 295 (1): R59-R66. DOI: 10.1152/ajpregu.00833.2007
28. Giles TD, Sander GE, Nossaman BD, Kadowitz PJ. Impaired vasodilation in the pathogenesis of hypertension: focus on nitric oxide, endothelial-derived hyperpolarizing factors, and prostaglandins. J Clin Hypertens (Greenwich). 2012; 14 (4): 198205. DOI: 10.1111/j.1751-7176.2012.00606.x
29. Feletou M, Vanhoutte PM. EDHF: an update. Clin Sci (Lond). 2009; 117 (4): 139-55. DOI: 10.1042/CS20090096.
30. Vanhoutte PM, Shimokawa H, Feletou M, Tang EH. Endothelial dysfunction and vascular disease - a 30th anniversary update.
Acta Physiol (Oxf). 2017; 219 (1): 22-96. DOI: 10.1111/ apha.12646.
31. Martinez-Quinones P, McCarthy CG, Watts SW, Klee NS, Komic A, Calmasini FB, et al. Hypertension Induced Morphological and Physiological Changes in Cells of the Arterial Wall. Am J Hypertens. 2018; 31 (10): 1067-1078. DOI: 10.1093/ajh/hpy083.
32. Feletou M, Vanhoutte PM. Endothelium-dependent hyperpolarizations: past beliefs and present facts. Ann Med. 2010; 39 (7): 495-516. DOI: 10.1080/07853890701491000
33. Fujiwara H, Wake Y, Hashikawa-Hobara N, Makino K, Takatori S, Zamami Y, et al. Endothelium-derived relaxing factor-mediated vasodilation in mouse mesenteric vascular beds. J Pharmacol Sci. 2012; 118 (3): 373-81. DOI: 10.1254/jphs.11197FP.
34. Zhang R, Thor D, Han X, Anderson L, Rahimian R. Sex differences in mesenteric endothelial function of streptozotocin-induced diabetic rats: a shift in the relative importance of EDRF. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012; 303 (10): H1183-1198. DOI: 10.1152/ajpheart.00327.
35. Wang XC, Sun WT, Yu CM, Pun SH, Underwood MJ, He GW. ER stress mediates homocysteine-induced endothelial dysfunction: Modulation of IKCa and SKCa channels. Atherosclerosis. 2015; 242 (1): 191-198. DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2015.07.021
ENDOTHELIUM-DEPENDENT REGULATION OF ARTERY TONUS
IN NEFRECTOMIZED RATS
Ivanova G. T., Lobov G. I.
Pavlov Institute of Physiology of Russian Academy of Sciences 199034, emb. Makarova, 6, St. Petersburg, Russia tazhim@list.ru
Abstract
Objective. To investigate the mechanisms of endothelial-dependent dilatation of the aorta and superior mesenteric artery in nephrectomized rats in vitro.
Materials and Methods. Rats were subjected to a two-stage removal of 5/6 of the kidney mass. After 8 weeks, they had fragments of the aorta and the superior mesenteric artery. The vascular contraction in vitro was recorded with a myograph with a FORT-10 sensor.
Results. Acetylcholine (1H10-10—1H10-4 M) caused a dose-dependent dilatation of the aorta and superior mesenteric artery. The production of endothelium nitric oxide was inhibited by L-NAME, prostacyclin-indomethacin. VCs channels were blocked with tetraethylammonium, SKS channels — TRAM 34. It has been established that acetylcholine-induced dilatation of the aorta and the superior mesenteric artery of control and nephrectomized rats is mediated by nitric oxide, prostacyclin and endothelial hyperpolarization. Nephrectomy led to a marked decrease in acetylcholine-induced vasodilation (aorta — by 25,2+1,8%, upper mesenteric artery — by 27,2+2,1%), which occurred mainly due to a decrease in the dilatation component due to nitrogen oxide. The dilatation effect of acetylcholine, realized through production of prostacyclin, did not change. Acetylcholine-induced dilatation of the aorta and the superior mesenteric artery was partially due to activation of calcium-sensitive potassium channels of large and intermediate conductivity. Nephrectomy led to a decrease in the dilatation of the aorta and the superior mesenteric artery due to endothelial hyperpolarization.
Conclusion. Violation of the agonist-induced dilatation of the aorta and the superior mesenteric artery with uremia is primarily mediated by a decrease in vasodilator functions of nitric oxide and is not compensated by the endothelial hyperpolarization system, which was previously proposed as an important reserve system when nitric oxide production is reduced.
Keywords: nephrectomy, endothelium, vasodilation, nitric oxide, prostacyclin, endothelial hyperpo-larization.
