CC BY
60
УДК 612.425:616.152.112
РЕАКЦИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ БРЫЖЕЕЧНЫХ ЛИМФАТИЧЕСКИХ СОСУДОВ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ НОРМОКАПНИЧЕСКИЙ АЦИДОЗ
© Кубышкина Н.А.1, Гайворонская В.В.2
1 Кафедра нормальной физиологии Северо-Западного государственного медицинского университета
им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург;
2 кафедра фармакологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
E-mail: natkub@mail.ru
Реакция изолированных брыжеечных лимфатических сосудов на экспериментальный внеклеточный нормокапни-ческий ацидоз заключается в подавлении спонтанной фазной сократительной активности и снижении уровня тонического напряжения. На повышение концентрации ионов водорода при умеренном ацидозе непосредственно реагируют преимущественно гладкомышечные клетки лимфатических сосудов. Ацидоз оказывает дилататорный эффект на лимфатические сосуды за счет активации АТФ-чувствительных калиевых каналов на мембране миоцитов и стимуляции продукции эндотелиоцитами оксида азота. Меньшая амплитуда расслабления деэндотелизированных сосудов по сравнению с интактными при снижении рН свидетельствует о том, что высокая концентрация ионов водорода приводит к дилатации лимфатических сосудов как прямо, так и опосредованно, оказывая влияние на эндотелиальные клетки.
Ключевые слова: лимфатические сосуды, внеклеточный ацидоз, вазодилатация, АТФ-чувствительные калиевые каналы, оксид азота.
REACTION OF ISOLATED MESENTERIC LYMPH VESSELS ON THE EXPERIMENTAL EXTRACELLULAR ACIDOSIS BY EUCAPNIA Kubishkina N.A.1, Gaivoronskaya V.V.2
1 Department of Normal Physiology of North-Western State Medical University named after LI. Mechnikov, St. Petersburg;
2 Department of Pharmacology of S.M. Kirov Military Medical Academy, St. Petersburg The reaction of isolated mesenteric lymph vessels on the experimental extracellular acidosis includes suppressing the spontaneous phase contractile activity and reducing the level of tonic tension. The smooth muscular cells of the lymph vessels directly respond to the increase in the concentration of hydrogen ions in moderate acidosis. Acidosis has a dilatator effect on the lymph vessels due to the activation of ATP-sensitive potassic channels in the membranes of myocytes and the stimulation of producing nitric oxide by the endothelial cells. Smaller amplitude of deendothelized vessels relaxation as compared with intact ones in decreasing pH indicates that the high concentration of hydrogen ions causes the dilatation of the lymph vessels, both directly and indirectly by influencing endothelial cells.
Keywords: lymph vessels, acidosis, vasodilation, ATP-sensitive potassic channels, nitric oxide.
Известно, что в интенсивно работающих тканях или в случае их недостаточного кровоснабжения развивается ацидоз и наблюдается дилата-ция кровеносных сосудов [2, 3, 10]. Несмотря на то, что состояние ацидоза встречается достаточно часто, далеко не все механизмы его вазодилата-торного действия хорошо изучены. Принято считать, что в условиях ацидоза снижение тонуса гладкомышечных клеток определяется понижением внутриклеточной концентрации ионизированного кальция [2, 3, 7, 8, 9]. В то же время в литературе имеются публикации, в которых представлены данные о том, что при ацидозе значительно снижается чувствительность к Са2+ регуляторных и контрактильных белков сосудистых гладкомышечных клеток [4, 6, 7]. Что касается лимфатических сосудов, то систематических исследований параметров сократительной деятельности их гладкомышечных клеток при ацидозе, несмотря на то, что он считается одним из клас-
сических вазодилататоров, до настоящего времени не проводилось. В то же время общепризнанно, что изменения активной транспортной функции лимфатических сосудов на фоне ацидоза являются важными, а порой и определяющими развитие патологического процесса в ткани
[14, 15, 16].
Цель исследования заключалась в изучении реакций гладкомышечных клеток мезентериальных лимфатических сосудов быка на снижение рН омывающего раствора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С целью исключения влияния нейро-гуморальных и местных регуляторных механизмов на сократительную функцию лимфатических сосудов опыты были проведены на изолированных эфферентных мезентериальных лимфатиче-
ских сосудах быка диаметром 1.5-2.5 мм (38 сегментов лимфатических сосудов от 14 здоровых животных). Лимфатические сосуды забирали через 10-15 минут после обескровливания животных. Сосуды доставлялись в лабораторию в растворе Кребса при температуре +2- +4оС. Исследования проводились на протяжении 2-6 часов с момента забора материала. Ранее было установлено, что спонтанная сократительная активность миоцитов лимфатических сосудов быка сохраняется без существенных изменений на протяжении 10-12 часов [1, 5]. Под микроскопом МССО-12 лимфатические сосуды очищались от жира и соединительной ткани. Из средней части мышечной манжетки лимфангиона вырезали кольца шириной 3-4 мм (n = 46), что позволяло регистрировать изменения напряжения в циркулярном направлении [5]. В части препаратов (n=17) с целью исключения гиперполяризующего эффекта эндотелиального NO механически удалялся эндотелий. Во всех опытах исходное растяжение препаратов устанавливалось исходя из расчетов по закону Лапласа и соответствовало трансмуральному давлению 8 см водн. ст. Препараты помещались в камеру для экспериментальных исследований, в которой обеспечивался постоянный проток (1 мл/мин) раствора Кребса ( NaCl - 120.4 , KCl -5.9, NaH2 PO4 - 1.2, NaHCO3- 15.5, CaCl2 — 2.5, MgCl2 - 1.2, глюкоза — 5.5 мМ/л), предварительно сатурированного газовой смесью 95% О2 и 5% СО2 при стабильной температуре (+37оС). Сократительная деятельность препаратов регистрировалась механоэлектрическими преобразователями 6МХ1С, работающими в изометрическом режиме, результаты записывались на самопишущем приборе Н-3031/3. После установления стабильных параметров спонтанной активности в физиологическом растворе при рН =7.4 препараты подвергались воздействию физиологического раствора с рН 7.3, 7.2, 7.1 и 7.0. Нормокапнический ацидоз создавался путем добавления к раствору Кребса HCl. рН растворов определяли с помощью ионо-мера И-120. Длительность воздействия раствора с низким рН с целью исключения возможных изменений внутриклеточного рН не превышала 5 минут. Для изучения механизма действия ацидоза на миоциты лимфатических сосудов использовали неспецифический блокатор калиевых каналов - BaCl2 (OOO «АО Реахим», Россия, 110-4 М/л) и селективный блокатор АТФ-чувст-вительных калиевых каналов - глибенкламид (Sigma, Болгария, 510-6 М/л). Участие оксида азота в ацидоз-индуцируемом расслаблении гладкомышечных клеток оценивалось путем деэндоте-лизации препаратов и применения №-мономе-тил^-аргинина - L-NMMA (Calbiochem,USA, 110-5 М/л). Препараты на протяжении 20 минут выдерживались в растворе с одним из вышеука-
занных веществ при рН 7.4 и затем подвергались действию ацидоза. Статистическая обработка данных проводилась с использованием ^критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Во всех опытах в растворе Кребса с рН 7.4 через 10-15 минут от начала эксперимента регистрировалась спонтанная сократительная активность препаратов с амплитудой фазных сокращений в среднем 7.6 мН и частотой 6.2 мин-1. Понижение рН омывающего раствора до 7.3 приводило к незначительному уменьшению частоты и амплитуды фазных сокращений лимфатических сосудов на фоне стабильного тонуса. Раствор с рН 7.2 на первой минуте действия приводил к выраженному уменьшению частоты и амплитуды фазных сокращений. В некоторых опытах спонтанная активность прекращалась на 30-40 с, а затем вновь восстанавливалась. На пятой минуте действия раствора с рН 7.2 амплитуда сокращений сегментов лимфатических сосудов составляла в среднем 3.9 мН, а частота 2.7 мин-1. Уровень тонического напряжения гладкомышечных препаратов понижался незначительно (на 5.3% от исходного).
Действие растворв с рН 7.1 сопровождалось быстрыми изменениями параметров сократительной деятельности гладких мышц лимфатических сосудов. Уже через 10-15 секунд от начала действия такого раствора наблюдалось выраженное уменьшение частоты и амплитуды фазных сокращений препаратов. К концу второй минуты действия фазная активность гладкомышечных клеток прекращалась и наблюдалось снижение уровня тонического напряжения препаратов. Расслабление гладкомышечных клеток достигало максимума к четвертой минуте действия раствора с низким рН и составляло 11.7% от исходного уровня тонического напряжения. Дальнейшее повышение концентрации ионов водорода (рН 7.0) приводило к быстрому подавлению спонтанных фазных сокращений и выраженному понижению тонуса (на 21.4% по отношению к исходному) (рис. 1).
Замена раствора с низким рН на обычный раствор Кребса приводила на протяжении нескольких минут к восстановлению параметров сократительной деятельности гладких мышц лимфатических сосудов. Полученные данные свидетельствуют о том, что реакции миоцитов лимфатических сосудов на ацидоз, так же как и реакции кровеносных сосудов [11, 13], определяются концентрацией ионов водорода, т.е. являются дозо-зависимыми и обратимыми в пределах рН 7.4-7.0.
рН
Рис. 1. Действие внеклеточного ацидоза на тонус интактного брыжеечного лимфатического сосуда, де-эндотелизированного лимфатического сосуда и на фоне действия блокатора синтазы N0 - №-монометил-L-аргинина. За 100% принят уровень тонического напряжения сосуда при рН 7.4. При рН 7.0 расслабление интактного сосуда составляло 21.4%, расслабление интактного сосуда на фоне действия L-NMMA - 20.1%, деэндотелизированного - 15.7%.
С целью изучения механизма действия ионов водорода на лимфатические сосуды у части препаратов был механически удален эндотелий. Реакции гладкомышечных клеток деэндотелизиро-ванных лимфатических сосудов на слабый ацидоз (рН 7.3) не отличались от таковых по сравнению с препаратами с сохраненным эндотелием. При действии раствора с рН 7.2 снижение амплитуды и уменьшение частоты фазных сокращений деэн-дотелизированных лимфангионов развивались медленнее по сравнению с интактными, амплитуда расслабления достигала максимума на пятой минуте действия кислого раствора и составила в среднем 4.2% от исходного уровня тонического напряжения. Действие растворов с рН 7.1 и 7.0 увеличивало скорость и амплитуду расслабления лимфатических сосудов (рис. 1). Эти экспериментальные данные позволяют сделать заключение о том, что на повышение концентрации ионов водорода при умеренном ацидозе непосредственно реагируют преимущественно гладкомышечные клетки лимфатических сосудов. Меньшая амплитуда расслабления деэндотелизированных сосудов по сравнению с интактными при действии раствора с рН 7.0 свидетельствует о том, что высокая концентрация ионов водорода приводит к дилатации лимфатических сосудов как прямо, так и опосредованно, оказывая влияние на эндотелиальные клетки.
Поскольку амплитуда расслабления деэндоте-лизированных сосудов была меньше по сравнению с интактными при действии раствора с рН 7.1 и 7.0, следующая серия опытов была направлена на раскрытие механизма действия ацидоза на эндотелиальные клетки. В литературе имеются
сведения о том, что некоторые факторы способны стимулировать продукцию эндотелиоцитами лимфатических сосудов N0, который приводит к расслаблению гладкомышечных клеток посредством активации растворимой цитоплазматической гуанилатциклазы [9, 10, 16]. В наших опытах предварительное воздействие на лимфатические сосуды с сохраненным эндотелием блокатора синтеза оксида азота - L-NMMA не изменяло реакции гладкомышечных клеток на слабый и умеренный ацидоз. Действие раствора с рН 7.1 и 7.0 на фоне L-NMMA сопровождалось подавлением спонтанной активности и снижением уровня тонического напряжения препаратов (при рН 7.0 на 15.7% по отношению к исходному уровню тонуса) (рис. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что умеренный ацидоз не приводит к изменению продукции эндотелиоцитами N0. Высокая концентрация ионов водорода стимулирует синтез и выделение эндотелиоцитами лимфатических сосудов N0, который оказывает дополнительный дилататорный эффект на гладкомышечные клетки.
В препаратах с сохраненным эндотелием и предварительно обработанных ВаС12 (п=5) или глибенкламидом (п = 10) при действии растворов с рН 7.3 и 7.2 практически не наблюдалось изменений параметров сократительной деятельности миоцитов лимфангионов. Небольшое уменьшение частоты фазных сокращений было статистически недостоверным. Раствор с рН 7.1 на фоне действия ВаС12 или глибенкламида первоначально уменьшал частоту и амплитуду фазных сокращений (на первой минуте действия на 21.3% и 35.3% соответственно). На третьей-
110
ге 105 о >
§ 100
2
о
X
Ч
О
X
о
2
90
85
80
75
Интактный
Интактный + Глибенкламид -А— И нтактный + BaCl2
—I—Деэндотелизированный + Глибенкламид
7,4
7,3
7,2
РН
7,1
Рис. 2. Действие блокаторов калиевых каналов: ВаС12 и глибенкламида на ацидоз-индуцируемое расслабление брыжеечного лимфатического сосуда. За 100% принят уровень тонического напряжения интакт-ного сосуда при рН 7.4. При рН 7.0 расслабление интактного сосуда составляло 21.4%, расслабление ин-тактного сосуда на фоне действия ВаС12 - 7.9%, расслабление интактного сосуда на фоне действия глибенкламида - 6.3%, деэндотелизированного на фоне действия глибенкламида - 4.6%.
четвертой минутах действия фазная активность прекращалась и наблюдалось снижение уровня тонического напряжения (рис. 2).
Раствор с рН 7.0 приводил к более быстрому эффекту подавления спонтанной активности и большему снижению тонуса (в среднем на 6.3%). Действие ацидоза на деэндотелизированные сосуды на фоне глибенкламида несколько отличалось от действия на интактные препараты на фоне глибенкламида. Наиболее наглядно это проявлялось при действии раствора с рН 7.0 (рис. 2).
Результаты опытов с применением блокато-ров калиевых каналов мембраны миоцитов показывают, что расслабление лимфатических сосудов при ацидозе реализуется преимущественно за счет открытия калиевых каналов на мембране миоцитов. С учетом того, что глибенкламид является специфическим блокатором АТФ-чувствительных калиевых каналов, отсутствие вазодилататорной реакции лимфатических сосудов на умеренный ацидоз на фоне действия гли-бенкламида и ее существенное уменьшение при действии раствора с рН 7.0 свидетельствуют о том, что ионы водорода оказывают прямой активирующий эффект на АТФ-чувствительные калиевые каналы в гладкомышечных клетках. Открытие АТФ-чувствительных калиевых каналов приводит к гиперполяризации мембраны, закрытию потенциалочувствительных Са2-каналов, снижению концентрации ионизированного кальция в цитоплазме и расслаблению гладкомышечных клеток. Значение АТФ-чувствительных калиевых каналов в ацидоз-индуцируемом расслаблении
ранее было показано при исследовании коронарных артериол и сосудов мозга [8, 12].
Таким образом, сравнивая полученные данные с результатами исследований кровеносных сосудов, следует отметить большую устойчивость гладкомышечных клеток к ацидозу. Умеренный внеклеточный нормокапнический ацидоз вызывает лишь небольшое снижение тонуса и уменьшение частоты и амплитуды спонтанных фазных сокращений лимфатических сосудов, т.е. активная транспортная функция лимфатических сосудов в этом случае сохраняется. Умеренный ацидоз оказывает действие на миоциты за счет прямой активации АТФ-чувствительных калиевых каналов на их мембране. Дальнейшее повышение внеклеточной концентрации ионов водорода подавляет спонтанные сокращения и вызывает значительную вазодилатацию за счет открытия АТФ-чувствительных калиевых каналов мембраны миоцитов и стимуляции продукции эндотелиоци-тами оксида азота.
ЛИТЕРАТУРА
1. Борисов А.В. Функциональная морфология лим-фангиона. Лимфатический сосуд. - Л. : ЛСГМИ, 1984. - С. 5-13.
2. Бородин Ю.И. Общая анатомия лимфатической системы. - Новосибирск : Наука, 1990. - 144 с.
3. Жданов Д.А. Общая анатомия и физиология лимфатической системы - Л. : Медгиз, 1952.
4. Лобов Г.И. Электрофизиологические свойства мембраны гладкомышечных клеток лимфатических сосудов // Доклады АН СССР. - 1984. -№ 277 (1). - С. 244-247.
7
5. Орлов Р.С., Борисова Р.П., Борисов А.В. Лимфатические сосуды. Структура и механизмы сократительной активности. - Л. : Наука, 1983.
6. Atchison D.J., Jonston M.G. Role of extra-and intracellular Ca2+ in the lymphatic myogenic response // Am. J. Physiol. - 1997. - № 272. - Р. R326-R333.
7. Gao J. Evidence that the ATP-induced increase in vasomotion of guinea-pig mesenteric lymphatics involves an endothelium-dependent release of thromboxane A2 // Br. J. Pharmakol. - 1999. - № 127 (7). -P. 1597-1602.
8. Sinzinger H., Kaliman J., Mannhaimer K. Arachnoidic acid metabolites of human lymphatics // Lymphology. - 1984. - № 17. - P. 39-42.
9. Tsunemoto H., Ikomi F., Ochashi T. Flow-mediated release of nitric oxide from lymphatic endothelial cells of pressurized canine thoracic duct // Jpn. J. Physiol. -2003. - № 53 (3). - P. 157-163.
10. Reddy N.P. Lymph circulation: physiology, pharmacology, and biomechanics // Crit. Rev. Biomed. Eng. -1986. - № 14 (1). - Р. 45-91.
11. Von der Weid P.Y. Endothelium-dependent modulation of pacemaking in lymphatic vessels of the guinea-pig mesentery // J. Physiol. - 1996. - № 493 (Pt. 2). -P. 563-575.
12. Von der Weid P.Y. Lymphatic smooth muscle: the motor unit of lymph drainage // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2004. - № 36. - P. 1147-1153.
13. Von der Weid P-Y., Zhao J., van Helden D.F. Nitric oxide decreases pacemaker activity in lymphatic vessels of guinea pig mesentery // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2001. - № 280 (6). - P. H2707-H2716.
14. Williamson I.M. Some responses of bovine mesenteric arteries, veins and lymphatics // J. Physiol. - 1969. -№ 202. - P. 112.
15. Zawieja D.C. Lymphatic microcirculation // Microcirculation. - 1996. - № 3 (2). - P. 241-243.
16. Zhao J., van Helden D.F. ATP-induced endothelium-independent enhancement of lymphatic vasomotion in guinea-pig mesentery involves P2X and P2Y receptors // Br. J. Pharmakol. - 2002. - № 137 (4). -P. 477-487.
