CC BY
41
© Коллектив авторов, 2008 УДК 612.13.017.2:616-008.9]:796
ЭНДОТЕЛИО- И КАРДИОПРОТЕКТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ ПРЕПАРАТА ФОСФОГЛИВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ДЕФИЦИТА ОКСИДА АЗОТА
Е.Б. Артюшкова, М. В. Покровский, Т.Г. Покровская,
Е.В. Артюшкова, О.Н. Белоконева, Е.И. Хардикова
Курский государственный медицинский университет, г. Курск
Проведены экспериментальные исследования эндотелио- и кардиопро-тективных эффектов препарата фосфоглив (лиофилизат) при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота.
С помощью комплекса физиологических методов, получены результаты, указывающие на отчетливое эндотелиопротективное и кардиопротектив-ное действие препарата фосфоглив (лиофилизат), полученного на основе нанотехнологий.
Проведенное исследование позволяет рекомендовать данные препараты для дальнейшего клинического изучения.
В настоящее время несмотря на многочисленные исследования, посвященные фармакологическим свойствам фосфолипидов и глицирризиновой кислоты, мало что известно об эндотелио- и кардиопротективных эффектах лекарственных композиций на их основе. Помимо структурной функции фосфолипиды участвуют в процессах молекулярного транспорта, делении и дифференцировке клеток, стимулируют активность различных ферментных систем [1,2].
Известна высокая эффективность в лечении ряда заболеваний глицирризи-новой кислоты, которая является основным активным компонентом корня солодки. Глицирризин представляет собой кальциевую или калиевую соль трехосновной глицирризиновой кислоты. К настоящему времени описаны противовоспалительное, антиаллергическое, антивирусное и иммуномодулирующее свойства этого соединения [4, 6, 7].
Целью настоящего исследования явилось изучение эндотелио- и кардиопротективных свойств препарата фосфоглив (лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения, далее лиофилизат) на модели L-NAME индуцированного дефицита оксида азота в эксперименте.
Материалы и методы Опыты проводились на белых крысах самцах линии Wistar массой 200-250 г. ^нитро^-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг/сут (n=10) в течение 7 дней. На 8 день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей, болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели кардиогемодинамики - систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли посредством датчика P23ID «Gould» США и компьютерной программы “Bioshell” в исходе, а также на фоне функциональных проб.
1. Проба на эндотелийзависимое расслабление сосудов (внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг).
2. Проба на эндотелийнезависимое расслабление сосудов (внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг).
Для оценки степени развития эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных и ее коррекции исследуемыми препаратами нами производился расчет коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющийся отношением площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ [3].
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы на нагрузку сопротивлением и 3-минутной гипоксией.
Исследуемый препарат вводился внутрижелудочно на фоне введения (Ь-КЛМБ) в следующих дозах:
• фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг (содержание фосфатидилхолина 231,4 мг/кг), далее фосфоглив (лиофилизат) 5,0 мл/кг;
• фосфоглив (лиофилизат) 0,5 мл/кг (содержание фосфатидилхолина 23,14 мг/кг), далее фосфоглив (лиофилизат) 0,5 мл/кг.
Результаты и их обсуждение
Моделирование Ь-КЛМБ зависимой эндотелиальной дисфункции вызвало стойкое повышение артериального давления в контрольной группе животных, связанное с блокадой синтеза оксида азота (N0). Так в группе животных не получавших лечения гемодинамические показатели составляли: систолическое артериальное давление (САД) 190,3±6,7 мм рт.ст., диастолическое артериальное давление (ДАД) 145,0±3,9 мм рт.ст. при частоте сердечных сокращений (ЧСС) 428±11 уд./мин. В группе интактных животных данные показатели распределились следующим образом: САД 137,7±3,7 мм рт.ст., ДАД 101,9±4,3 мм рт.ст. и ЧСС 420±9 уд./мин. Как мы и предполагали, применение препарата фосфоглив (лиофилизат), не оказывало существенного влияния на базальный уровень артериального давления (АД). Так в группах животных, получавших препарат в дозе 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг данные показатели составляли соответственно следующие значения: САД (181,0±10,5 и 203,2±11,3 мм рт.ст.), ДАД (138,3±7,8 и 157,4±8,4 мм рт.ст.), ЧСС (365±10 и 391 ± 5 уд./мин.).
При изучении влияния на эндотелий исследуемых препаратов, на основании времени и выраженности реакций на эндотелийзависимое расслабление сосудов (внутривенное введение ацетилхолина) и эндотелийнезависимое расслабление - внутривенное введение нитропруссида натрия, мы рассчитывали коэффициент эндотелиальной дисфункции - КЭД, отражающий соотношения этих реакций сосудистого русла. Данный показатель был рассчитан для каждого животного интакт-ной группы и животных после моделирования блокады N0-синтазы, при этом получили достоверную разницу КЭД в 5 раз, соответственно 1,1 у интактных и 5,4 у животных, получавших Ь-КЛМБ (табл.1). У животных получавших на фоне введения Ь-КЛМБ фосфоглив (лиофилизат) в дозах 5,0 мл/кг и 0,5 мл/кг коэффициент эндотелиальной дисфункции был равен соответственно — 3,1±0,4 и 2,9±0,5. Обращает на себя внимание, что время сосудистой реакции и площадь сосудистой реакции над трендом реакции восстановления в ответ на введение НП в группе получавшей Ь-КАМБ, были достоверно больше по сравнению с интактной группой животных. В то время как на фоне введения исследуемого препарата данные показатели демонстрировали более высокие значения в ответ на введение АХ по сравне-
нию с группой нелеченных животных. При этом время сосудистой реакции у животных получавших фосфоглив (лиофилизат) было не только более продолжительным, но и достоверно не отличалось от группы интактных животных (табл.1).
Полученные данные могут свидетельствовать о выраженном эндотелиопро-тективном эффекте препарата фосфоглив как в дозе 5,0 мл/кг, так и в дозе в 10 раз меньшей, что выражалось в снижении коэффициентов эндотелиальной дисфункции при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота.
Таблица
1.
Показатели, отражающие коррекцию эндотелиальной дисфункции на фоне введе-
ния Ь-ИЛМЕ, препаратом фосфоглив (лиофилизат).
Группы животных Функ- цио- наль- ные пробы Прирост падения сосудистой реакции по СрАД (мм рт.ст.) Время сосудистой реакции (сек.) Площадь сосудистой реакции (усл. ед) Отношение площадей сосудистой реакции НП к АХ
Интактные АХ 59,9±2,9 42,2±0,8 1268,0±74,8 1,1±0,1
НП 61,0±3,0 45,1±1,0 1375,3±93,7
Ь-Щ.МБ АХ 68,0±4,1 20,0±1,4* 695,3±87,6* 5,4±0,6*
НП 98,0±2,0* 67,4±1,4* 3322,7±116,7 *
Ь-Щ.МБ + фосфоглив (лиофилизат) (5,0 мл/кг) АХ 81,6±6,1* 42,0±4,1 у 1710,8±231,7у 3,1±0,4* у
НП 97,0±7,0* 101,8±6,8*у 4975,5±578,8 * у
Ь-Щ.МБ + фосфоглив (лиофилизат) (0,5 мл/кг) АХ 93,3±7,2* у 49,0±5.7 у 2347,0±352,7 *у 2,9±0,5* у
НП 86,0±6,0* 136,6±12,3*у 5783,7±560,0 *у
Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных, у - р<0,05 в сравнении с группой Ь^ЛМБ
Для исследования кардиопротективных свойств препаратов нами была использована нагрузка сопротивлением (пережатие дуги восходящей аорты в течение 30-ти секунд). Экспериментальное моделирование дефицита оксида азота привело к достоверному снижению приростов ЛЖД как на 5-й, так и на 25-й секунде пережатия аорты (рис. 1).
Рисунок 1. Прирост ЛЖД у крыс при пережатии аорты на фоне фармакологической коррекции дефицита оксида азота препаратом фосфоглив в дозах 0,5 мл/кг и 5,0 мл/кг
* - при р<0,05 в сравнении с Ь-КАМБ, #при р<0,05 в сравнении с интакт-
ными.
На фоне введения исследуемых препаратов имело место выраженное кар-диопротективное действие, которое проявилось в значительном увеличении приростов ЛЖД по сравнению с группой животных, получавшей Ь-КАМБ. При этом надо отметить, что значения приростов ЛЖД на 5-й и 25-й секунде на фоне введения препарата фосфоглив (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/кг не уступали таковым при введении препарата в дозе в 10 раз большей. Данный факт может свидетельствовать о большей биологической доступности препарата фосфоглив (лиофилизат) за счет входящих в его состав фосфолипидных наночастиц, обеспечивающих высокую эффективность транспортной системы и способность восстанавливать структуру и нарушенные свойства мембран кардиомиоцитов, возникшие при моделировании Ь-КАМБ патологии.
При проведении пробы на нагрузку сопротивлением в качестве критерия эффективности использовалась способность миокарда поддерживать максимально высокое ЛЖД на всем протяжении пробы.
На 5-й секунде пережатия аорты измерялся прирост ЛЖД и принимался за 100% (миокардиальный резерв сократимости), затем прирост ЛЖД относительно исходного давления измерялся на 25-й секунде и выражался в виде % от величины миокардиального резерва (рис. 2). Очевидно, что введение Ь-КАМБ вызывало серьезные нарушения в способности миокарда переносить максимальные нагрузки в течение длительного периода времени.
Рисунок 2. Исчерпание миокардиального резерва у крыс при пережатии аорты на фоне фармакологической коррекции дефицита оксида азота препаратом фосфоглив в дозах 0,5 мл/кг и 5,0 мл/кг
* - при р<0,05 в сравнении с Ь-КЛЫБ, #при р<0,05 в сравнении с интакт-
ными.
Применение препарата фосфоглив (лиофилизат) приводило к тому, что исчерпание миокардиального резерва было достоверно меньше по сравнению с группой нелеченных животных. Причем значения исчерпания миокардиального резерва препарата фосфоглив (лиофилизат) приближались к группе интактных животных, как в дозе 5,0 мл/кг, так и в дозе в 10 раз меньше.
На основании этих данных можно предположить, что кардиопротективный эффект препаратов обусловлен суммированием эффектов глициррата и фосфолипидов, связанное с предупреждением нарушения свойств мембран кардиомиоцитов возникшее при моделировании Ь-КЛЫБ патологии, а отсутствие дозозависимого эффекта вызвано повышением биодоступности препарата на основе лиофилизата для приготовления раствора для внутривенного введения.
В заключительной части эксперимента мы проводили гипоксическую пробу с целью выявления действия препаратов на изменения в работе миокарда после ре-оксигенации. При данной пробе положительные сдвиги наблюдались во всех группах принимавших препарат, так приросты давления на фоне введения препарата фосфоглив (лиофилизат) в дозе 0,5 мл/кг и 5,0 мл/кг составили соответственно 96,9+8,9 и 110,9+4,8 мм рт. ст. и были достоверно выше, по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, где прирост давления составил 72,2+5,9 мм рт. ст. В группе интактных животных данный показатель был на уровне 129,8+6,7 мм рт. ст.
Результаты исследования подтверждают возможное защитное действие исследуемого препарата на мембраны клеток, приводящее к усилению реакции со стороны сердечно-сосудистой системы на постгипоксическую реоксигеницию. В данном случае препарат также демонстрировал сопоставимые эффекты в двух дозах в ответ на реоксигенацию, достоверно более высокие по сравнению с группой животных, получавших Ь-КЛЫБ.
В ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН была разработана оригинальная технология получения инъекционной формы препарата фос-фоглив, позволившая создать уникальную фосфолипидную наносистему эмульгированных мицелл и липосом, представляющую собой устойчивые частицы со сред-
ним диаметром 30-50 нм [1]. Можно предположить, что, как и любые другие наночастицы, они могут обладать совершенно иными физико-химическими свойствами по сравнению с микро- и макросистемами того же состава, и изучение этих свойства представляется актуальным для комплексного экспериментального исследования [9, 5, 8].
Накопленные к настоящему времени данные о роли биомембран в жизнедеятельности клетки и об универсальном характере повреждений мембран при широком спектре патологических состояний, позволяет предполагать, что репарация поврежденных мембран независимо от повреждающего фактора, будет неспецифично приводить к нормализации клеточных функций. Вероятно такую неспецифичную “мембранную терапию” целесообразно включать в схему лечения многих заболеваний, в комбинации с соответствующей специфической терапией, направленной на прекращение данного патологического воздействия.
Выводы
1. Препарат фосфоглив (лиофилизат) обладает эндотелиопротективными свойствами при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота, заключающимися в преобладании эндотелийзависимого расслабления сосудов и снижении коэффициента эндотелиальной дисфункции.
2. Препарат фосфоглив (лиофилизат) обладает кардиопротективными свойствами при экспериментальном моделировании дефицита оксида азота, заключающимися в способности препарата предотвращать исчерпание миокардиального резерва, а также изменять реактивность миокарда в ответ на 3-х минутную гипоксию с последующей реоксигенацией.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ипатова О. М. Фосфоглив: механизм действия и применение в клинике. Под редакцией академика РАМН А.И.Арчакова. - Москва: Изд-во ГУ НИИ биомедицинской химии РАМН, 2005.-318с.
2. Никитин И.Г. Гепатопротекторы: мифы и реальные возможности //Фарматека.-2007.-Т.147, №13.- С.14-18.
3. Покровский М. В., Кочкаров В. И., Покровская Т. Г. и др. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME-индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте //Кубанский научный медицинский вестник. Краснодар, 2006. - Т.12.
4. Сторожаков Г.И., Байкова И.Е. Глицирризин в лечении хронических вирусных гепатитов //Клин. фармакология и терапия.-2000.-№ 9.-С.39-41
5.Bautista L. E. Inflammation, endothelial dysfunction, and the risk of high blood pressure: epidemiologic and biological evidence // J. Hum. Hypertens. - 2003. - V. 17(4). -P.223-230.
6.Jeong H. G., Kim J. Y. Induction of inducible nitric oxide synthase expression by 18-beta-glycyrrhetinic acid in macrophages. FEBS Lett.- 2002, 513, 208-212.
7. Kusano G., Shibano M., Watanabe H., Ozaki K. Pharmaceutical botanical studies on some glycyrrhiza species. Yakugaku Zasshi. 2003, 123, 619-631.
8. Moghimi S. M., Yunter A. C., Murray J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacol Reviews. 2001, 53, 283-318.
9. Soloviev A.I., Stefanov A.V., Bazilyuk O.V., Sagach V.F. Phospholipid vesicles (liposomes) restore endothelium-dependent cholinergic relaxation in thoracic aorta from spontaneously hypertensive rats. Journal Hypertens. 1993, 11(6): 623-627.
ENDOTHELIOPROTECTIVE EFFECTS OF FOSFOGLIV PREPARATIONS DURING EXPERIMENTAL MODELLING OF DEFICIENCY OF NITROGEN OXYDE
E.B. Artyushkova, M.V. Pokrovskiy, T.G. Pokrovskaya, E.V. Artyushkova,
O.N. Belokoneva, E.I. Chardikova
Experimental research of endothelio- and cardioprotective effects of fosfogliv preparation (capsule) and fosfogliv preparation (liofilizat) at the L-NAME-induced deficiency of nitrogen oxyde have been carried out.
With the help of complex of physiological methods were achieved results specifying on distinct endothelio- and cardioprotective action of fosfogliv preparation (capsule) and fosfogliv preparation (liofilizat) received on the nanotechnologies basis.
The present research allows to recommend these preparations to wide clinical studying.
