CC BY
12© Коллектив авторов, 2014 УДК 618.39-021.3-036.3-085.357-036.8-07:618.146-091.8]-092.9
ЭНДОМЕТРИЙ: ОТ ЯДЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ДО ТЕСТ-МОДЕЛИ НОВЫХ ЛЕКАРСТВ
Э.К. Айламазян1, академик РАН, профессор, Г.Х. Толибова1, кандидат медицинских наук, М.А. Петросян1, кандидат биологических наук Т.Г. Траль1, С.В. Сердюков2
'НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Российская Федерация, '99034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3; 2НИИэпидемиологии и микробиологии им. Пастера Роспотребнадзора, Российская Федерация, '9710', Санкт-Петербург, ул. Мира, д. '4 E-mail: mariya@labpharm.spb.ru
Введение. Среди множества причин, приводящих к прерыванию беременности, эндокринные факторы играют одну из ключевых ролей. В то же время назначение гестагенных препаратов для сохранения беременности часто носит эмпирический характер.
Целью клинико-экспериментального исследования были гистологическая и иммуногистохимическая оценка гравидарного эндометрия при неразвивающейся беременности I триместра на фоне моно- и политерапии аналогами прогестерона, а также сравнительная оценка способности микронизированного прогестерона и дидрогестерона вызывать секреторную трансформацию эндометрия у экспериментальных модельных животных.
Результаты. Результаты исследования показали, что при неразвивающейся беременности на фоне терапии аналогами прогестерона гормональная патология эндометрия наиболее часто проявляется снижением экспрессии рецепторов прогестерона в децидуальной ткани и повышением экспрессии рецепторов эстрогена в железах и децидуальной ткани. При этом в случае политерапии рецепторный дисбаланс выражен больше, чем при применении одного из аналогов прогестерона. В эксперименте в тесте Глауберга—МакФейла дидрогестерон в большей степени вызывал децидуальную трансформацию эндометрия, чем микро-низированный прогестерон при назначении обоих препаратов per os.
Заключение. Сравнительная экспериментальная оценка гестагенной активности микронизированного прогестерона и дидро-гестерона на модели животных показала способность обоих препаратов вызывать секреторную трансформацию эндометрия, однако фармакологическая эффективность дидрогестерона была выше. Гормональная терапия угрозы прерывания беременности аналогами прогестерона часто не дает ожидаемого результата, причиной этого, возможно, является чрезмерная гормональная нагрузка, приводящая к рецепторному дисбалансу эндометрия и неадекватному ответу ткани на сохраняющую терапию.
Ключевые слова: неразвивающаяся беременность, рецепторы эстрогена и прогестерона, микронизированный прогестерон, дидрогестерон, модель животных, секреторная трансформация эндометрия
ENDOMETRIUM: FROM NUCLEAR RECEPTORS TO TEST MODELS OF NEW DRUGS E.K. Ailamazyan1, G.H. Tolibova1, M.A. Petrosyan1, T.G. Tral'1, S.V. Serdiukov2
1D.O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, Mendeleyevskaya Line, 3, St. Petersburg, Russian Federation, 199034;
2Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Mira Str., 14, St. Peterburg, Russian Federation, 197101
Introduction. Endocrine factors are considered to be important in the etiology of spontaneous abortion.
Aim of the study. Histological and immunohistochemical characterization of the expression of estrogen and progesterone receptors in the gravid endometrium during the first trimester of non-developing pregnancy under the treatment by progesterone analogues.Comparative experimental evaluation of gestagenic activity of micronizedprogesterone and didrogesterone on the animal model.
Results. The study has revealed a decrease of the expression of progesterone receptors in the decidual tissue and an increase of the expression of estrogen receptors in the glands and decidual tissue. The receptor imbalance in case of polytherapy by analogues of progesterone has been found to be more prominent than that in case of monotherapy. Using an experimental animal model, it was revealed that both dydrogesterone and micronized progesterone can cause the secretory transformation of the endometrium, but dydrogesterone was found to be more efficient than micronized progesterone.
Conclusion. Comparative experimental evaluation of gestagenic activity of micronized progesterone and didrogesterone has revealed the ability of both preparations to cause the secretory transformation of the endomentrium, however, pharmacological efficiency of didrogesterone was higher. Hormonal treatment of spontaneous abortion by progesterone analogues often does not have expected result that can be explained by excessive hormonal load leading to the endometrial receptor imbalance and inadequate tissue reaction to the hormonal therapy.
Key words: non-developing pregnancy, estrogen and progesterone receptors, micronized progesterone, dydrogesterone, animal model, secretory transformation of the endometrium
ВВЕДЕНИЕ
Проблема неразвивающейся беременности остается одной из актуальных проблем современного акушерства в связи с высокой частотой данной патоло-
гии практически во всех странах мира. Несмотря на многочисленные исследования в этом направлении, единого мнения об этиологии и патогенезе данного осложнения беременности до настоящего времени
не существует, что препятствует проведению эффективной патогенетической терапии. Среди множества причин, приводящих к прерыванию беременности (генетические, инфекционные, иммунологические, анатомические и др.), эндокринные факторы играют одну из ключевых ролей [1—4].
Известно, что способность эндометрия к рецепции бластоцисты является результатом его адекватной гормональной подготовки. Нормальная секреторная трансформация эндометрия возможна только после полноценной I фазы менструального цикла. Однако решающую роль в успешной имплантации бластоцисты играют не столько абсолютное содержание стероидных гормонов в организме женщины и морфологическая структура эндометрия, сколько количество функционально полноценных рецепторов в ткани эндометрия, способных взаимодействовать с соответствующим стероидным гормоном [5, 6].
Одно из самых важных свойств стероидных гормонов — их влияние на уровень стероидных рецепторов внутри клеток-мишеней. Известно, что эстрадиол усиливает синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и рецепторов андрогенов. Андроге-ны могут усиливать синтез собственных рецепторов. Прогестерон не только не усиливает синтез собственных рецепторов, но и подавляет его. Подавляет он и синтез рецепторов эстрадиола [7—10]. Поэтому важно, чтобы гормональная терапия невынашивания беременности проводилась с учетом эффективности и механизма действия назначаемых стероидных препаратов. Среди препаратов гестагенного ряда, наиболее часто назначаемых при угрозе прерывания беременности, — масляный раствор прогестерона, микро-низированный прогестерон и дидрогестерон, применяемые в качестве моно-, а иногда и политерапии. Широкое использование этих препаратов в клинической практике для фармакологической коррекции невынашивания беременности привлекло наше внимание с целью изучения их влияния на эндометрий и экспрессию ядерных рецепторов половых стероидов. Исследование носило клинико-экспериментальный характер. Задачами исследования были гистологическая и иммуногистохимическая (ИГХ) оценка грави-дарного эндометрия у женщин при неразвивающейся беременности I триместра с учетом приема гормональных препаратов, а также сравнительная оценка способности микронизированного прогестерона и дидрогестерона к секреторной трансформации эндометрия у экспериментальных животных.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Оценка экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в гравидарном эндометрии при неразвивающейся беременности I триместра проведена у 130 пациенток (основная группа). В контрольную группу были включены 20 женщин, у которых беременность по их желанию была прервана немедикаментозным путем на сроке от 5 до 11 нед. Критериями исключения из исследования явились установленный анти-
фосфолипидный синдром, сахарный диабет, гистологические признаки инфекционного поражения гравидарного эндометрия, а также беременность, наступившая в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий.
Материал был исследован макро- и микроскопически. Взятый материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 24 ч. В последующем его обезвоживали в спиртах нарастающей концентрации (70—95%), помещали в ксилол и заливали в парафин с помощью автоматической станции Leica TP1020. Для гистологического и ИГХ-исследования готовили парафиновые срезы толщиной 3—7 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли^-лизина (Sigma). Для обзорной окраски применяли гематоксилин и эозин.
При ИГХ-исследовании использовали монокло-нальные антитела к рецепторам эстрогенов-а (Dako, clone 1D5, 1:35) и прогестерона (Dako, clone PgR636, 1:50). В качестве системы визуализации применяли стрептавидиновую систему визуализации LSAB2 System-HRP (Dako). Для проведения ИГХ-реакции использовали стандартный двухэтапный протокол с демаскировкой антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере рН 7,6. Экспрессию рецепторов эстрогена и прогестерона оценивали путем подсчета процента окрашенных ядер, используя систему компьютерного анализа изображений Nikon Eclipse 400 и программу «Морфология 5,0» (ВидеоТест) по методу Histochemical Score (в модификации McCartey, 1986).
Экспериментальную часть исследования проводили на самках кроликов породы шиншилла, полученных из питомника «Рапполово» РАМН. Животные содержались в регламентированных условиях вивария НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН на стандартном рационе. Всего в эксперименте было использовано 45 инфантильных самок кроликов массой 600—1000 г.
Способность препаратов вызывать секреторную трансформацию эндометрия оценивали в соответствием с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» методом Глауберга—МакФейла [11,12]. Согласно этому методу, эстрогенподготовленным самкам кроликов в течение 5 дней ежедневно вводили испытуемые соединения — микронизированный прогестерон и дидрогестерон в заданном диапазоне доз (0,004—0,5 мг/кг). Для каждого препарата было сформировано 4—5 рандомизированных групп животных (соответственно количеству доз). Все подопытные животные получали препараты ежедневно в виде масляного раствора (растворитель — оливковое масло) в объеме 0,3 мл per os (внутриже-лудочно) с использованием зонда. На следующий день после последнего введения препарата кроликов под легким эфирным наркозом выводили из опыта путем введения воздуха в латеральную ушную вену. После вскрытия фрагмент одного рога матки брали для гистологической обработки. Поперечные срезы
16
№5, 20М Молекулярная медицина
препаратов матки толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали на свето-оптическом уровне при увеличении х 12.
Оценку гестагенной активности проводили по 4-балльной шкале МеРИаП, принимая во внимание степень прегравидных изменений эндометрия, вызванных введением испытуемых препаратов.
Для каждого фрагмента матки оценивали несколько срезов, после чего проводили статистическую обработку полученных в группе данных. Результаты опытов обрабатывали методом регрессионного анализа. Вычисления вели по уравнению регрессии у=а+Ь ^х, где у — фармакологический эффект (индекс МеРИаП), х — доза гестагена, мг/кг (в логарифмическом масштабе), а и Ь — коэффициенты регрессии.
Биологическую активность соединений оценивали по ЕД50 (соответствует индексу МеРИаП, равному 2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Все пациентки основной группы (п=130) во время беременности принимали гестагенные препараты: микронизированный прогестерон, дидрогесторон, масляный раствор прогестерона или их сочетание. Монотерапия отмечена у 96 (73,8%) пациенток, из которых 62 (64,7%) применяли микронизированный прогестерон, 26 (27,0%) — дидрогестерон и 8 (8,3%) — прогестерон. Политерапия применялась у 34 (26,2%) пациенток, из них у 19 (55,6%) были использованы микронизированный прогестерон, дидрогестерон и прогестерон, у остальных 15 (44,4%) — различные комбинации из 2 препаратов.
Результаты клинического исследования показали, что при медикаментозной поддержке беременности аналогами прогестерона (как в виде моно- так и политерапии) эндометрий часто подвергается лечебному патоморфозу, при этом классические морфологические признаки эндокринной патологии могут не выявляться.
При гистологическом исследовании гравидарно-го эндометрия у 44 (34%) пациенток основной группы отмечалась патология II фазы менструального цикла, которая характеризовалась нарушением формирования полноценной гравидарной перестройки эндометрия на стадии предецидуальных клеток и стадии незрелых децидуоцитов с нарушением формирования клубков спиральных артерий и гравидарной перестройкой желез спонгиозного слоя. В то же время у 39 (30%) пациенток при гистологическом исследовании отмечалась эктазия желез компактного слоя с гиперхромными мелкими ядрами в сочетании с неполноценной гравидарной перестройкой эндометрия и нарушением трансформации желез компактного слоя, что является отражением неполноценности I и II фаз менструального цикла.
При ИГХ-исследовании гравидарного эндометрия с оценкой рецепторов эстрогена и прогестерона у всех пациенток основной группы наблюдалось не только снижение экспрессии рецепторов прогестерона, но и повышение экспрессии рецепторов эстрогена как в
децидуальной ткани, так и в железах эндометрия (по сравнению с показателями в контрольной группе).
Наиболее часто гормональная патология эндометрия проявлялась в снижении экспрессии рецепторов прогестерона в децидуальной ткани <50% и повышении экспрессии рецепторов эстрогена в железах и де-цидуальной ткани в сочетании со снижением экспрессии рецепторов прогестерона >30% — соответственно у 37 (28,5%) и 54 (41,5%) женщин. В контрольной группе отмечалось равномерное распределение рецепторов прогестерона в пределах 95—100% в децидуальной ткани. В железах экспрессия рецепторов прогестерона была равна 0. Экспрессия рецепторов эстрогена в железах и децидуальной ткани не превышала 25—30%.
Нормальные показатели экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона по отношению к эмбрио-гистологическому сроку беременности при применении гормональной терапии выявлены у 39 (30,0%) обследованных.
Лекарственная политерапия с применением ми-кронизированного прогестерона и дидрогестерона характеризовалась неравномерным распределением и резким снижением экспрессии рецепторов прогестерона в децидуальной ткани у 101 (77,7%) обследованной. Кроме того, указанное снижение в сочетании с повышением экспрессии рецепторов эстрогена диагностировано у 18 (52,9%) женщин. В контрольной группе повышения экспрессии рецепторов эстрогена не выявлено.
К сожалению, фармакологическая коррекция невынашивания беременности гестагенными препаратами не всегда эффективна. Выявленные нами в результате клинических исследований изменения рецепторного профиля эндометрия на фоне сохраняющей беременность терапии обусловили необходимость проведения сравнительного экспериментального изучения гестагенной активности 2 препаратов, широко применяемых в клинической практике невынашивания, — микронизированного прогестерона и дидрогестерона.
По химической структуре микронизированный прогестерон идентичен эндогенному гормону. Дидрогестерон относится к ретропрогестинам, его молекулярная структура близка к структуре прогестерона, однако имеет уникальные конформационные изменения молекулы, увеличивающие его биодоступность и селективность к рецепторам прогестерона.
Результаты наших экспериментальных исследований показали, что при оральном введении в исследуемом диапазоне доз (0,004—0,5 мг/кг) оба препарата вызывали дозозависимое усиление секреторных процессов в эндометрии экспериментальных животных, однако при 4-кратном увеличении минимальной дозы значительного роста активности препаратов не наблюдалось.
На рисунке графически представлена зависимость индекса МеРИаП, отражающего гестагенную активность соединений, от логарифма дозы. Так, в дозовом диапазоне от 0,004 до 0,25 мг/кг микронизированный
Степень секреторной трансформации эндометрия матки инфантильных крольчих при введении исследуемых препаратов
прогестерон и дидрогестерон вызывали слабую секреторную трансформацию эндометрия, оцениваемую в пределах 0,3—1,0 балла по шкале МеРИаП. При увеличении дозы до 0,5 мг/кг активность дидрогестерона значительно возрастала, превосходя микронизиро-ванный прогестерон в 2,3 раза.
В результате обработки экспериментальных данных методом регрессионного анализа для каждого соединения была определена биологическая активность, оцениваемая по ED50. Так, эффективная доза, вызывающая 50% эффект, для дидрогестерона составила 1,47 мг/кг, для микронизированного прогестерона — 284 мг/кг.
Таким образом, полученные при эксперименте результаты показали, что дидрогестерон обладает способностью вызывать значительную секреторную трансформацию эндометрия в более низких дозах, чем микронизированный прогестерон. Действительно, в клинической практике для достижения необходимого фармакологического эффекта при назна-
чении микронизированного прогестерона требуются значительно более высокие дозы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты гистологического и ИГХ-исследо-вания гравидарного эндометрия показали, что при неразвивающейся беременности на фоне терапии аналогами прогестерона гормональная патология эндометрия наиболее часто проявляется в снижении экспрессии рецепторов прогестерона в децидуальной ткани и повышении экспрессии рецепторов эстрогена в железах и децидуальной ткани. При этом в случае политерапии 2 и более препаратами снижение экспрессии рецепторов прогестерона было более выраженным, чем у пациенток, принимающих 1 препарат. Причиной этого, возможно, становится чрезмерная гормональная нагрузка, приводящая к рецепторно-му дисбалансу эндометрия и неадекватному ответу ткани на сохраняющую терапию. Сравнительная экспериментальная оценка гестагенной активности микронизированного прогестерона и дидрогестеро-на на модели животных показала способность обоих препаратов вызывать секреторную трансформацию эндометрия, однако фармакологическая эффективность дидрогестерона была выше.
С учетом дискуссионного характера вопросов гормональной терапии невынашивания беременности требуются дальнейшие расширенные исследования с углубленной оценкой морфофункционального и ре-цепторного профиля эндометрия на фоне различной медикаментозной поддержки беременности. В то же время ограниченный выбор препаратов гестагенного ряда, разрешенных для поддержания беременности, делает поиск и изучение новых эффективных и безопасных фармакологических средств, сохраняющих беременность, весьма перспективным направлением.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Айламазян Э.К. Репродуктивное здоровье женщины как критерий биоэкологической диагностики и контроля окружающей среды. Журнал акушерства и женских болезней. 1997; 1: 6-10. (Aylamazian E.K. Reproductive health of the woman as criterion of bioecological diagnostics and environment control. J. akusherstva i gzenskih bolezney. 1997; 1: 6-10 (in Russian)]
2. Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г. Патоморфоло-гическая диагностика ранних самопроизвольных выкидышей. СПб: ГРААЛЬ, 1999. [Glukhovets B.I., Glukhovets N.G. Patomorfo-logicheskaya diagnostics of early spontaneous abortions. SPb: GRAAL, 1999 (in Russian)]
3. Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. М.: Триада-Х, 2005. [Sidelnikova V.M. Habitual loss of pregnancy. M.: Triada-H, 2005 (in Russian)]
4. Радзинский В.Е., Димитрова В.И., Майскова И.Ю. Неразвивающаяся беременность. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. [Radzinskij V.E., Dimitrova V.I., Majskova I.Ju.
Not developing pregnancy. M.: GEOTAR-Media, 2009 (in Russian)]
5. Bulletti C., Flamigni C., Giacomuccii E. Reproductive failure due to spontaneous abortion and recurrent miscarriage. Human Reproduction Update. 1996; 2 (2): 118-36.
6. Милованов А.П., Болтовская М.Н., Фокина Т.В., Старосветская Н.А., Назимова С.В. Неразвивающаяся беременность: гистологические и иммуногистохимиче-ские маркеры эндокринных нарушений в соскобах эндометрия. Архив патологии. 2008; 6: 22-5.
[Milovanov A.P., Boltovskaya M.N., Fokina T.V., Starosvetskaja N.A., Nazimova S.V. Not developing pregnancy: histologic and im-munohistochemical markers of endocrine violations in the soskobakh an endometriya. Arhiv patologii. 2008; 6: 22-5 (in Russian)]
7. Смирнов А.Н. Молекулярная биология прогестерона. Рос. хим. журн. 2005; 49 (1): 64-74. [Smirnov A.N. Molecular biology
of a progesterone. Rus. Chem. J. 2005; 49 (1): 64-74 (in Russian)]
8. Conneely O.M., Lydon J.P., De Mayo F. O'Malley B.W. Reproduktive function of the progesterone receptor. J. Soc. Gynecol. Investig. 2000; 7: 5-32.
9. Drummond A.E., Britt K.L., Dyson M. et al. Ovarian steroid receptors and their role in ovarian function. Mol. and Cel. Endoc. 2002; 191 (1): 27-33.
10. Корхов В.В., Тапильская Н.И. Гестагены в акушерско-гинекологической практике. СПб: Спец. лит., 2005.
[Korkhov V.V., Tapilskaya N.I. Progestogens in obstetric and gynecologic practice. SPb: Spec. lit., 2005 (in Russian)]
11. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К, 2012.
[Guide to carrying out preclinical researches of medicines. M.: Grif i K, 2012 (in Russian)]
12. Cekan Z., Seda M., Mikulaskova I.A. et al. Oral progestational activity of 6-cloro-17a-hydroxy-16methylene-pregno-4,6-diene-3,20-dione acetate. Steroids. 1966; 2: 205-7.
Поступила 3 мая 2014 г.
18
№5, 2014 Молекулярная медицина
