CC BY
75
Эндогенный потенциал стволовых клеток
лючевым элементом современной регенеративной медицины и заместительной терапии являются клеточные технологии лечения заболеваний человека с использованием главным образом аутологичных мезенхимальных стволовых клеток. В ближайшей перспективе найдут широкое применение и стволовые клетки, подвергнутые индукции плюрипотент-ности и редактированию геномов»,- полагает академик Игорь Волотовский.
Регенеративная медицина и заместительная терапия базируются на результатах фундаментальных исследований в области мезенхимальных стволовых клеток (МСК) - предшественников всех специализированных клеток организма. В начале XXI века медико-биологическая наука перешла от изучения структуры и функции МСК к технологиям лечения заболеваний, в основе которых лежит трансплантация накопленных in vitro как изолированных МСК, так и их биокомпозитов с биодеградируемыми носителями. Биокомпозиты дали старт тканевой инженерии, использующей инструментальные возможности технических наук, например ЭБ-принтинга. Последние прорывные результаты регенеративной медицины - создание индуцированных стволовых клеток (СК) и технологий редактирования геномов и генов стволовых клеток.
Анализируя применение клеточных технологий в мире, можно выделить несколько этапов становления регенеративной медицины:
■ разработка биотехнологических приемов получения, культивирования, стандартизации клеточного материала (стволовых клеток) из тканей и органов, методов их дифференцировки в специализированные клетки и его длительное хранение;
я создание методов введения стволовых клеток в организм при различных заболеваниях, определение их количества и места введения; я совершенствование принципов и способов получения биоинженерных конструкций (биокомпозитов -искусственных тканей) на основе стволовых клеток и различных биодеградируемых полимерных носителей для их последующей трансплантации, а также создание искусственных органов на основе клеток и носителей, в том числе с использованием 30-принтинга; я репрограммирование и редактирование геномов стволовых клеток.
Белорусские ученые работают в рамках трех первых этапов становления регенеративной медицины, четвертый - на стадии организации.
Исследования в области МСК в нашей стране ведутся с начала двухтысячных годов. К 2011 г. в нескольких учреждениях НАН Беларуси и Министерства здравоохранения уже была создана экспериментальная база, сформировались профессиональные коллективы. Именно они выполнили свою часть программы Союзного государства Беларуси и России «Разработка новых методов и технологий восстановительной терапии патологически измененных тканей и органов с использованием стволовых клеток», утвержденной Постановлением Союзного правительства 26.04.2011 г. и рассчитанной на 2011-2013 гг. Головной организацией белорусской части программы был определен Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, а ее научным руководителем - академик Игорь Волотовский. Белорусские ученые приняли участие в выполнении пяти программных мероприятий. Это способствовало популяризации клеточных технологий лечения заболеваний в медицинской среде. Интерес появился у травматологов-ортопедов, пульмонологов и фтизиатров, офтальмологов, стоматологов, урологов и клиницистов других специальностей. Исследования расширяются и углубляются за счет повышения их методического уровня, постановки оригинальных задач, выходящих за рамки программы.
Так, в Институте биофизики и клеточной инженерии были отработаны все требования к выделению, культивированию и дифференцировке МСК, определены стандартные критерии по всему процессу (кандидат биологических наук Е.С. Лобанок), что позволило в дальнейшем совместно с учеными-медиками Белорусского государственного медицинского университета
(БГМУ) разработать инновационные методики для комплексного лечения пациентов с трофическими язвами разной этиологии. При Институте за счет бюджетных и собственных средств НАН Беларуси создан Республиканский центр «Клеточные технологии», включающий три отделения: поликлиническое, производство биомедицинских клеточных продуктов и банк стволовых клеток. Производство организовано в соответствии с международными требованиями GMP, что подтверждено сертификатом. Институт выполняет роль ведущей организации по проведению фундаментальных исследований в области биологии стволовых и прогениторных клеток, по проблемам влияния гипоксии на рост, развитие и дифференцировку клеток в культуре, эпигенетического контроля процессов диф-ференцировки и индукции плюрипотентности МСК, создания искусственных тканевых структур с использованием биодеградируемых матриц, репрограммиро-вания МСК, редактирования геномов мезенхимальных и соматических клеток. Расширяется спектр методик по культивированию стволовых и прогениторных клеток и доведению технологий до стандартных требований с получением соответствующих сертификатов, что дает право на распространение и оборот клеточного материала. В тесном взаимодействии с клиницистами разрабатываются протоколы лечения. Министерством здравоохранения уже утверждены три инструкции: в области сосудистой хирургии и стоматологии. В стадии завершения еще три разработки: совместно с Институтом физиологии НАН Беларуси (директор - доктор медицинских наук, профессор С.В. Губкин) и 2-й кафедрой хирургических болезней Гродненского государственного медуниверситета (доктор медицинских наук, профессор Н.А. Нечипоренко) - лечение стрессового недержания мочи у женщин; совместно с кафедрой глазных болезней БГМУ (заведующая - доктор медицинских наук, профессор Л.Н. Марченко) - лечение дистрофических поражений роговицы; совместно с кафедрой пластической хирургии и комбустиологии БелМАПО (заведующий - доктор медицинских наук, профессор В.Н. Подгайский) - создание искусственной кожи для лечения ожогов. В планах еще три клеточных технологии терапии и участие в формируемой программе Союзного государства России и Беларуси «Стволовая клетка 2».
Под руководством доктора медицинских наук, профессора М.П. Потапнева в РНПЦ трансфузиологии и медицинских биотехнологий разработан лабораторный
регламент получения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинно-плацентарного происхождения; показана их 36-кратная экспансия при сокультивирова-нии со стромальными клетками костного мозга и установлено их влияние на дифференцировку ГСК. Совместно с РНПЦ неврологии и нейрохирургии, в частности неврологического отдела, которым заведует доктор медицинских наук, профессор С.А. Лихачев, отработана технология получения и наращивания в культуре ау-тологичных МСК костного мозга для внутривенного и внутрилюмбального введения пациентам с боковым амиотрофическим склерозом; в ходе клинического исследования зарегистрировано замедление нарастания патологической симптоматики со стороны дыхательной системы и улучшение течения заболевания. Совместно с РНПЦ психического здоровья разработан комплексный метод применения недифференцированных и нейродифференцированных МСК для лечения фармакорезистентной симптоматической эпилепсии. В Белорусской медицинской академии последипломного образования (БелМАПО) под руководством доктора медицинских наук М.М. Зафранской разработана методика хирургического лечения повреждений периферических нервов с использованием комбинированных графтов на основе аутологичных МСК, трансдиф-ференцированных в нейрональном направлении.
Метод аллогенной котрансплантации МСК и ГСК детям с онкогематологическими заболеваниями разработан в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии.
В РНПЦ эпидемиологии и микробиологии создана технология выделения и культивирования стволовых и прогениторных клеток из обонятельного эпителия человека, а также биокомпозитов с биодеградируемыми полимерами, показана их эффективность при лечении стенозов гортани и трахеи у экспериментальных животных. Предложена оригинальная технология приготовления культур фибробластов и кератиноцитов кожи и их биокомпозитов с использованием биодеградируемых полимеров фосфата декстрана, хитозана, поли-лактида (кандидат биологических наук З.Б. Квачева); показана эффективность препаратов при восстановлении целостности кожных покровов у животных, а затем у пациентов с хроническими трофическими язвами нижних конечностей. Учеными БГМУ создана модель повреждения хрящевой ткани у кроликов (М.П. По-тапнев), проведена трансплантация животным МСК, дифференцированных в хондрогенном направлении
в комплексе с полимерным носителем, позитивный эффект трансплантации открыл перспективу использования этого метода у человека. В НПО порошковой металлургии НАН Беларуси проведено культивирование МСК из ткани пуповины в стандартных условиях на полилактиде в присутствии хондропротекто-ров глюкозамина, хондроитина, комплекса жирных кислот омега-3 и индукторов хондрогенной диффе-ренцировки (кандидат химических наук Л.В. Цедик). Образование хрящевых структур удалось оптимизировать, идут эксперименты на животных, в перспективе - клиническое применение у человека.
Ученые лаборатории нейрофизиологии Института физиологии НАН Беларуси предложили оригинальную методику соматотопической периневральной имплантации МСК при моделировании инсультов, травм и новообразований головного мозга, болезни Альцгеймера. Выполняется совместный проект Института физиологии и РНПЦ неврологии и нейрохирургии по разработке способа лечения мозговых инсультов с использованием МСК.
Педиатрия
РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии (директор Центра - член-корреспондент НАН Беларуси Ольга Алейникова) - это крупнейшее учреждение здравоохранения, в котором не только проводится лечение детей с тяжелейшими онкологическими и гематологическими заболеваниями, но и осуществляются научные фундаментальные исследования в области биологии и медицины, а также разрабатываются новые технологии.
Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) в Центре практикуется 20 лет, со времени основания учреждения в 1997 г. И если в первые годы выполнялось 5-10 операций в год, теперь - 70. Это ведущий метод лечения пациентов со злокачественными заболеваниями, который помогает сохранить жизнь в самых сложных случаях. Цель аллогенной ТГСК (алло-ТГСК) -замещение несостоятельного, поврежденного костного мозга донорским, а также получение реакции «трансплантат против опухоли». Эта высокотехнологичная операция дает шанс выжить детям с лейкозами, апла-стической анемией, миелодиспластическим синдромом, онкологическими заболеваниями. Алло-ТГСК выполнена 450 маленьким пациентам, и о ее эффективности свидетельствует спасение жизни более 90% детей с апласти-ческой анемией. Спектр терапевтического применения
пересадки стволовых клеток постоянно расширяется -это врожденный иммунодефицит и аденолейкодистро-фия, талассемия и другие жизнеугрожающие патологии. Уровень сложности проводимых операций и выживаемость белорусских пациентов сопоставимы с результатами передовых клиник мира. Этому способствует внедрение гаплоидентичной ТГСК - с использованием клеток неполностью совместимого родственного донора; метода высокоразрешающего HLA-типирова-ния доноров и реципиентов; новых режимов кондиционирования, в том числе со сниженной токсичностью; применение таргетных препаратов в послетрансплан-тационном периоде и т.д.
У пациентов с гемобластозами и солидными опухолями, в протокол лечения которых входит назначение миелоаблативных доз лучевой или химиотерапии, наряду с опухолевыми клетками разрушаются и здоровые клетки костного мозга. Поэтому после противоопухолевой терапии они нуждаются в аутологичной трансплантации ГСК (ауто-ГСК) для восстановления гемопоэза до уровня, необходимого для редукции риска побочных реакций, таких как инфекции, анемия, кровотечение. Ауто-ТГСК показана детям с нейро-бластомой, опухолью головного мозга, саркомой Юин-га, рабдомиосаркомой, лимфомой Ходжкина, неходж-кинской лимфомой и другими опухолями. В Центре ауто-ТГСК выполнена 338 пациентам.
Параллельно началось и изучение функционального состояния ГСК при различных патологиях у детей. Исследование пролиферативной активности клеток-предшественников гемопоэза, их способности к дифференцировке и ответу на цитокины, вырабатываемые стромой костного мозга, имеет большое значение в диагностике миелодиспластического синдрома, ювенильного миеломоноцитарного лейкоза, апласти-ческой анемии, нейтропении и других гематологических заболеваний и в мониторинге за терапией.
В 2002 г. в Центре начались первые исследования негемопоэтических стволовых клеток костного мозга, а в 2012 г. была создана лаборатория клеточной биотехнологии и цитотерапии, которую возглавляет кандидат биологических наук Янина Исайкина. В лаборатории изучаются свойства мезенхимальных клеток костного мозга, в частности их способность восстанавливать поврежденные ткани. Впервые в Беларуси к 2008 г. здесь была разработана и запатентована технология получения биотрансплантата МСК из костного мозга и начато его использование в онкогематологии
Рис. 1. Получение биомедицинского клеточного продукта МСК. Асептический модуль
и регенеративной медицине. А в 2015 г. прошла регистрация биомедицинского клеточного продукта «Клетки мезенхимальные стволовые костного мозга человека» по ТУ БУ600395123.001-2015, что позволяет не только производить МСК, но и реализовывать их на территории Беларуси. Штат квалифицированных специалистов занимается инновационными медико-биологическими исследованиями и разработками. В их числе высокотехнологичные способы получения тканеспе-цифичных клеток из СК костного мозга; изучение пути миграции трансплантированных клеток и их хоу-минга в организме пациента после инфузии, а также различных межклеточных взаимодействий; создание биоинженерных конструкций на основе дифференцированных в хондрогенном или остеогенном направлениях МСК для репарации хрящевой и костной тканей. Производственные помещения (асептические модули) соответствуют требованиям СМР (рис. 1, 2).
На базе РНПЦ проведены клинические испытания, которые доказали безопасность и эффективность использования цитотерапии на основе МСК для лечения различных видов соматической патологии. Разрабатываемые технологии создания клеточных биотрансплантатов соответствуют мировым аналогам. Терапия МСК проведена 331 пациенту при таких заболеваниях, как реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) - 138, лекарственно устойчивый туберкулез - 42, болезни сердца - 35, хроническая обструк-тивная болезнь легких - 28, поддержание гемопоэза -27, детский церебральный паралич - 12, апластическая анемия - 11, цирроз печени - 10 и др.
Рис. 2. Хранение стволовых клеток при сверхнизких температурах. Криохранилище с жидким азотом
Одним из самых тяжелых осложнений алло-ТГСК является РТПХ - многофазный иммунопато-физиологический процесс, в результате которого активированные донорские Т-лимфоциты атакуют клетки реципиента. Иммуносупрессивные и противовоспалительные свойства МСК определяются продукцией ими индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO), простаглан-дина E2, HLA-G5, TGF, Ил-10. В экспериментах in vitro в Центре был изучен ингибирующий эффект МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов, в частности активированных цитотоксических лимфоцитов. Результаты исследования стали основой для клинического внедрения. Метод позволяет снизить риск развития РТПХ после аллогенной трансплантации ГСК у детей с 70 до 40%, предотвратить развитие жизнеугрожаю-щей РТПХ 3-4-й степени тяжести, оптимизировать лечение стероидорезистентной формы этого заболевания и повысить выживаемость.
МСК способствуют быстрому восстановлению ге-мопоэза и снижают риск посттрансплантационных осложнений после миелоаблативной терапии, которая сопряжена с повреждением клеток костного мозга и развитием у пациента цитопении. Это подтверждено полученными в лаборатории клеточной биотехнологии и цитотерапии результатами экспериментальных исследований, которые показали, что МСК костного мозга не только активизируют экспансию гемопоэтических клеток, но и приумножают популяцию полипотентных гемопоэтических предшественников, а также помогают сохранить жизнеспособность клеток.
В Центре разработан метод применения МСК, обеспечивающий высокую степень приживления алло-генных ГСК, при этом сокращается период восстановления кроветворения после трансплантации. Входящие в группу риска 27 детей с гемобластозами, злокачественными опухолями и апластической анемией получили котрансплантацию МСК, у всех пациентов (100%) произошло быстрое приживление трансплантата донора. Уровень лейкоцитов у детей, получивших МСК, нормализовался на 4-8 суток быстрее, а зависимость от трансфузий тромбоконцентрата у 90% из них исчезала к 48-му дню (при стандартной терапии - только к 77-му).
Трансплантация собственной и донорской хрящевой ткани ограничена возможностями ее изъятия и сохранения здоровой и жизнеспособной. Альтернативой является успешно применяемая технология репарации дефекта хряща сустава и получения ткани гиалинового хряща при имплантации пациенту ауто-логичных или аллогенных МСК в составе носителя. Она разработана совместно РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии и РНПЦ травматологии и ортопедии. Преимущества МСК - доступность источника клеток, высокий пролиферативный потенциал, пластичность с предрасположенностью к диф-ференцировке в хондрогенном направлении; низкая иммуногенность. Эффективность нового метода лечения доказана результатами клинического испытания. После введения МСК у пациентов отмечается высокая степень регенерации хрящевого дефекта по данным МРТ-исследования, достоверное уменьшение болевого синдрома, улучшение функционального состояния пораженного сустава.
Результаты экспериментов, проведенных РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии, БГМУ и ГрГМУ, демонстрируют, что МСК костного мозга могут in vitro проходить процесс дифференцировки в гепатоцитоподобные клетки, обладающие морфологией и экспрессией генов, характерных для гепато-цитов. В условиях ограниченности донорских органов разработанный метод внутрипаренхимального введения МСК в ткань печени под контролем УЗИ способствует ингибированию фиброзирующих процессов в печени и снижению фиброзной ткани, стимулирует пролиферацию гепатоцитов. Клеточная терапия может рассматриваться как важный компонент лечебных мероприятий, значимо улучшающих общий прогноз и качество жизни пациентов с циррозом печени.
В лаборатории клеточной биотехнологии и ци-тотерапии Центра детской онкологии, гематологии и иммунологии проведены экспериментальные исследования способности МСК костного мозга дифференцироваться в нейрогенном направлении и анализ паракринной функции МСК секретировать нейротрофический фактор мозга, который стимулирует и поддерживает жизнеспособность, развитие и активность нейронов, а также восстанавливает афферентные и эфферентные функциональные связи. Были подобраны условия для получения трансплантата нейроиндуцированных МСК и разработана схема двухэтапного введения клеток пациентам с ДЦП. Последующее наблюдение за ними в Минском городском центре реабилитации детей с психоневрологическими заболеваниями и учеными кафедры детской неврологии БелМАПО показало эффективность предложенной методики. Включение трансплантации МСК в комплексное лечение детей с ДЦП позволило в 2,3 раза повысить у них динамику моторных функций и в 2 раза - умственно-речевого развития.
Продолжаются клинические исследования по применению МСК в терапии пациентов с хронической об-структивной болезнью легких в рамках Государственной программы «Здоровье народа и демографическая безопасность Республики Беларусь на 2016-2020 годы».
На базе Центра размещается Банк концентрата стволовых клеток пуповинной крови, в котором хранится более 1300 единиц пуповинной крови. Накоплен собственный большой опыт терапии с помощью гемопоэтических и негемопоэтических СК, а также налажено тесное сотрудничество с другими национальными научно-практическими учреждениями - Гродненским государственным медицинским университетом, БГМУ, РНПЦ онкологии и медицинской радиологии имени Н.Н. Александрова, РНПЦ травматологии и ортопедии, РНПЦ пульмонологии и фтизиатрии. Растет число пациентов из-за рубежа, которым оказывается медицинская помощь с трансплантацией СК.
Наряду с расширением области применения репа-ративных свойств СК дальнейшие перспективы связаны с использованием генетически модифицированных МСК в таргетной противоопухолевой терапии. Первое клиническое исследование (с участием пациентов с аденокарциномой желудочно-кишечного тракта) уже стартовало.
Хирургия
Эффективное лечение инфицированных раневых дефектов кожи и мягких тканей различного генеза -особенно длительно незаживающих ран и трофических язв - остается проблемной областью медицины. Поэтому идет постоянный поиск новых методов лечения, направленных на коррекцию локального патологического гомеостаза, санацию раневой инфекции, стимуляцию развития и созревания грануляционной ткани, а также на ускорение эпителизации трофических дефектов кожи. Тематические исследования в этом направлении были начаты в 2009 г. на 2-й кафедре хирургических болезней БГМУ под руководством члена-корреспондента НАН Беларуси Станислава Третьяка. Проводились они по трем ГНТП совместно с учеными Института физики им. Б.И. Степанова, Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, НПК «Люзар», РНПЦ эпидемиологии и микробиологии.
В эксперименте поэтапно были отработаны методики эксплантации жировой ткани и кожного лоскута, пригодных для выделения и культивирования как ММСК, так и фибробластов кожи (ФК) соответственно; выбраны способы моделирования у лабораторных животных (850 крыс) раневых дефектов (чистых, гнойных, с замедленной регенерацией), методы подготовки ран к выполнению локальной клеточной трансплантации (с локальным применением светодиодной терапии - антибактериального светодиодного и фоторегуляторного воздействия); разработаны способы доставки клеточных биопрепаратов (инъекционный и аппликационный). Результаты лечения оценивали с применением микробиологического и ги-стоморфологического методов, компьютерной планиметрии. В процессе выполнения доклинических исследований была показана эффективность применения как ММСК жировой ткани, так и ФК: отмечено ускорение появления полноценных грануляций в ране, увеличение скорости эпителизации, сокращение сроков полного заживления.
На основе полученных данных были разработаны методы комплексного лечения пациентов с трофическими язвами ног: с локальным использованием комбинированной светодиодной фототерапии и биомедицинских клеточных продуктов.
Лечение включало несколько этапов: выполнение забора жировой ткани и/или кожного лоскута у пациента хирургическим способом - липэктомия; обогащение
клеточной массы in vitro (выделение МСК, их культивирование); подготовка трофической язвы реципиента к клеточной трансплантации; выполнение локальной трансплантации аутоММСК и/или ФК;
послеоперационное наблюдение.
Подготовка трофической язвы к клеточной трансплантации и выращивание клеточного материала осуществлялись параллельно специалистами по клеточным технологиям Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси и/или РНПЦ эпидемиологии и микробиологии и хирургами, что позволяло получать информацию как о состоянии язвенных дефектов, так и о степени готовности материала к трансплантации. Клеточные культуры подвергались типологическому, микробиологическому и вирусологическому тестированию; использовались ММСК 3-4 пассажей.
Локальные трансплантации аутоММСК выполнены у 29 пациентов на 49 язвенных дефектах ног. Как правило, проводилась повторная клеточная пересадка. Нежелательных явлений не наблюдалось, что подтвердило безопасность технологии. У всех пациентов лечение завершилось стойким положительным эффектом. Наряду с заживлением раневого дефекта и полным восстановлением кожных покровов отмечалось улучшение всех показателей качества жизни: существенное снижение болевых ощущений, увеличение физической активности в повседневной жизнедеятельности, снятие эмоционального дискомфорта.
Описанная методология является инновационной альтернативой в лечении трофических язв ног. Она может применяться как самостоятельная процедура для ускорения процессов регенерации (как окончательный метод лечения), а также в сочетании с операциями, направленными на коррекцию этиопатогенетических факторов.
В рамках выполнения совместных НИР внесено 13 рационализаторских предложений, получено три патента, Министерством здравоохранения Республики Беларусь утверждены три инструкции по применению: Метод лечения с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани у пациентов с трофическими язвами: рег. №093-0911 / сост. Е.В. Баранов, С.И. Третьяк, И.Д. Волотовский, Е.С. Ло-банок, И. Б. Василевич; Метод лечения пациентов с трофическими язвами и гнойно-воспалительными заболеваниями кожи и мягких тканей с применением фототерапевтического светодиодного комплекса: рег. №143-1211 / сост. Е.В. Баранов, Г.А. Скороход, А.В. Буравский, А.В. Мостовников; Метод комплексного
лечения пациентов с длительно незаживающими ранами с применением локальной светодиодной фототерапии и аутологичных культивируемых дермальных фи-бробластов: рег. №066-1016 / сост. С.И. Третьяк, Е.В. Баранов, А.В. Буравский, И.Д. Волотовский, З.Б. Квачева, И.Б. Василевич. Сейчас на кафедре ведутся исследования по возможности применения биокомпозиций и клеточных биопродуктов, в том числе СК, для лечения и профилактики спаечной болезни.
Представленные разработки позволяют обеспечить формирование сырьевой базы клеточной трансплантологии в стране, многократно увеличить эффективность использования клеточного материала, приемлемого для трансплантации, массово использовать клеточные трансплантаты в клинической практике в комплексной терапии заболеваний внутренних органов, патологии нейроэндокринного характера, костно-суставного и мышечного аппарата, ран различного этиопатогенеза, существенно снизить стоимость лечения.
Стоматология
Сотрудники кафедры ортопедической стоматологии и ортодонтии с курсом детской стоматологии БелМАПО под руководством доктора медицинских наук, профессора Сергея Рубниковича совместно с учеными Института биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси изучают эффективность клеточных технологий в рамках проекта по разработке биотрансплантата на основе МСК жировой ткани, иммобилизованных на биодеградируемом носителе, для применения в лечении болезней периодонта.
Экспериментальная часть исследования по использованию аутологичных МСК для лечения рецессии десны проведена на базе ЦНИЛ БелМАПО в соответствии с регламентированными требованиями к эксперименту. В качестве модели использовали 60 нелинейных ран-домбредных беспородных самок белых крыс, которых разделили на 5 групп в зависимости от планируемого метода лечения, по 10 особей в каждой. Контрольную группу составили 10 лабораторных животных со здоровой десной - интактных. Предварительно у одной особи в стерильных условиях производили забор 1-2 мл жировой ткани для получения аллогенных МСК. Их выделение и культивирование осуществляли в лабораторных условиях в Институте биофизики и клеточной инженерии. Животным с экспериментально смоделированной рецессией десны в группе I не выполняли
Рис. 3. Десна пациентки с диагнозом «рецессия десны» до (А) и после (Б) комплексного лечения с применением смеси ауто-МСК жировой ткани с коллагеновым гелем 7%
никаких лечебных манипуляций. В группе II в область рецессии инъекционно вводили физиологический раствор, в группе III - стерильный биопластический кол-лагеновый материал «Коллост®» (7% гель, ООО «Ниар-медик плюс») в эквивалентном объеме, в группе IV -суспензию алло-МСК в физиологическом растворе, в группе V - смесь алло-МСК и материала «Коллост» в эквивалентном объеме (в 0,1 мл смеси одной особи вводилось 100 тыс. МСК жировой ткани). Сравнительный анализ результатов патоморфологических и мор-фометрических исследований показал, что инъекции суспензии клеточного трансплантата на материале «Коллост» привели к значительному достоверному улучшению регенерации тканей периодонта через 28 дней.
Клинические исследования осуществлялись с участием 63 человек в возрасте 20-34 лет с диагнозом «рецессия десны». Были получены одобрение комиссии по этике о внедрении метода лечения этой патологии с использованием клеточного трансплантата в клиническую практику в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации, а также добровольное информированное согласие всех пациентов на операцию по забору жировой ткани. В зависимости от способа восстановления уровня десны пациенты были распределены на две группы. В 1-й применяли только традиционную консервативную перио-донтологическую терапию, во 2-й - дополнительно назначали инъекции клеточного трансплантата на основе смеси ауто-МСК и материала «Коллост» (рис. 3).
Анализ итогов клинических исследований свидетельствует, что включение в комплекс лечебно-профилактических мероприятий предложенного метода клеточной терапии по сравнению с группой
с традиционным лечением достоверно уменьшает распространенность (в 1,8 раза, р<0,001) и интенсивность рецессии десны (в 2,6 раза, р<0,001), улучшает процессы микроциркуляции. Комплексная оценка состояния периодонта показала, что через 1-2 года после лечения хорошее состояние было лишь у 16,7% пациентов 1-й группы (стандартный лечебный комплекс), и у 94% пациентов 2-й группы (с использованием смеси ауто-МСК жировой ткани с коллагеновым гелем 7%) (рис. 3). Полученные результаты подтверждают необходимость применения мероприятий, направленных на улучшение микроциркуляции тканей периодонта и восстановление контура маргинальной десны.
Положительные итоги данного экспериментально-клинического исследования позволили предложить для внедрения в практическое здравоохранение новый метод лечения патологии десны. Министерством здравоохранения Республики Беларусь утверждена инструкция по применению №048-0518 «Метод лечения рецессии десны с использованием смеси аутологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани с коллагеновым гелем 7%» (учреждения-разработчики: БелМАПО, БГМУ, Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси).
Перспективы клеточной терапии и нейросетевых технологий
Во всем мире, включая Беларусь, постоянно идет поиск эффективных способов восстановления функций головного мозга, в последнее время - в области клеточной биологии и нейрофизиологии. Немаловажную роль в разработке новых методик клеточной терапии сыграли исследования сотрудников Института физиологии НАН Беларуси и нейрохирургов РНПЦ неврологии и нейрохирургии. Коллектив ученых под руководством академика Владимира Кульчицкого и члена-корреспондента Юрия Шанько сумел за последние несколько лет адаптировать клеточные технологии для лечения социально значимых заболеваний мозга на базе нескольких клинических центров страны - РНПЦ неврологии и нейрохирургии, МНПЦ хирургии, трансплантологии и гематологии, Городской клинической больницы скорой медицинской помощи Минска. Пройден сложный период научного обоснования перспективности применения клеточных технологий в клинической практике. В настоящее время в лечебных учреждениях Республики Беларусь начинается этап периневральной имплантации стволовых клеток, которая обладает рядом
преимуществ по сравнению с их традиционными системными аппликациями (внутривенно, внутриарте-риально, в ликворопроводящую систему мозга).
В научных статьях наряду с обнадеживающими результатами отмечаются негативные реакции при применении клеточных технологий. Так, белорусскими учеными установлены побочные эффекты системного введения СК при инсультах и травмах головного мозга. Обнаружено, что при внутривенном и внутри-артериальном введении эти клетки обладают крайне низкой способностью преодолевать гематоэнцефаличе-ский барьер и проникать из сосудистого русла в ткань мозга. При введении в ликвор возникает иная сложность, которая обусловлена затруднением перемещения СК против кранио-каудального тока ликвора. Для преодоления этих недостатков нейрохирурги осуществляют имплантацию СК непосредственно в ткань мозга, но эти манипуляции сопряжены с дополнительным оперативным вмешательством (трепанация черепа), что нежелательно в остром периоде развития заболевания.
Своеобразным выходом из сложившейся ситуации стала разработка методик периневральной миграции мезенхимальных СК в мозг, которые отличаются от общепринятых хирургических манипуляций. Предложен соматотопический способ введения МСК для осуществления целенаправленного их перемещения в конкретный участок головного мозга. Так, при развитии инсульта в передней и средней черепных ямках используют интраназальное периневральное введение клеток, как правило, в границах верхней носовой раковины через систему обонятельных нервов. При локализации деструктивного очага в задней черепной ямке целесообразно осуществлять инъекцию МСК в области окончаний тройничного нерва в нижней носовой раковине или непосредственно в пространство Меккеля, где расположен ганглий Гассера тройничного нерва.
Имплантация МСК в подслизистую оболочку полостей носа выбрана в силу минимизации побочных эффектов для пациента и простоты выполнения этой манипуляции для нейрохирурга. Учтена способность МСК к периневральной миграции. Кроме того, в пользу введения МСК именно в рецептивное поле обонятельного нерва свидетельствует присутствие стволовых обонятельных клеток в слизистой оболочке полости носа. Поскольку центральные структуры обонятельного анализатора находятся в передней черепной ямке, было предположено, что основная масса
имплантированных МСК будет концентрироваться именно там, что и подтвердилось (рис. 4). Таким образом, с учетом высокой плотности окончаний обонятельного нерва в области верхней и отчасти средней носовой раковины рекомендовано введение суспензии МСК в мягкие ткани именно в эти области носа. Результаты использования метода на лабораторных животных представлены на рис. 4А. В других участках мозга в указанном временном интервале обнаружены единичные МСК (рис. 4В). При введении МСК в окончания тройничного нерва отмечено распределение флуоресцирующих клеток в месте травмы в задней черепной ямке (рис. 4D). В области передней черепной ямки выявлены лишь единичные клетки (рис. 4С).
Эксперимент в очередной раз продемонстрировал соматотопический принцип распределения МСК в участках повреждения головного мозга в зависимости от локализации в нем центральных «станций анализаторов» (определение И.П. Павлова). У обонятельного нерва такая станция расположена в передней черепной ямке, у тройничного - в задней.
В процессе выполнения совместных исследований ученых НАН Беларуси с нейрохирургами РНПЦ неврологии и нейрохирургии в клинических условиях получены дополнительные факты, свидетельствующие о целесообразности учитывать соматотопический принцип миграции МСК в полость черепа после их имплантации в зоны окончаний черепно-мозговых нервов.
Периневральная имплантация МСК сопровождается активацией репаративного потенциала эндогенных СК. В головном мозге обнаружено три участка, в которых присутствуют специальные пулы СК: область обонятельных луковиц, гиппокамп и структуры головного мозга вблизи желудочков мозга. К сожалению, при развитии нейродеструктивных процессов, болезни Паркинсона, Альцгеймера у эндогенных стволовых клеток не хватает репаративного потенциала для восстановления нарушенных функций нервной системы. В этих ситуациях на помощь приходят клеточные технологии, включающие пери-невральную имплантацию аутологичных СК, взятых из жировой ткани самого пациента. Они мигрируют вдоль нервных волокон с периферии до нервных ядер в головном и спинном мозге и выделяют разнообразные трофические факторы, которые благотворно влияют на функции клеток вблизи травмы, а также на активность эндогенных СК мозга.
Рис. 4. Флуоресцирующие мезенхимальные стволовые клетки через три недели после повреждения головного мозга в соматосенсорной зоне (А) и в области мозжечка (D). A, B - последствия интраназальной аппликации МСК; C, D - последствия введения МСК в пространство Меккеля
Источник: Kulchitsky V, Zamaro A, Shanko Y., Koulchitsky S. Positive and negative aspects of ceii technologies in cerebral diseases //J. Neurol. Stroke. 2018. Vol. 8 (2). P. 87-88.
Клеточные методики не всегда являются панацеей. Необходимо продолжить поиск других подходов в терапии, например можно комбинировать клеточные технологии и создание нейросетевых структур в ЭБ-про-странстве. Такое сочетание позволяет осуществлять биопринтирование: в специальном геле формируется популяция нейроноподобных элементов, которые устанавливают контакты друг с другом, и в ЭБ-простран-стве геля образуется нейронная сеть, напоминающая реальную нейросетевую структуру мозга. На базе лаборатории нейрофизиологии Института физиологии НАН Беларуси сотрудники кафедры биофизики БГУ сконструировали биопринтер, с помощью которого реально формировать нейросетевые структуры. Клеточные технологии выходят на новый, популяцион-ный уровень, когда не только отдельные СК, а нейро-сети будут основой для проведения реконструктивных операций с целью восстановления участков мозга с обширными нейродеструктивными процессами.
Таким образом, сегодняшний день можно назвать революцией в исследовании возможностей применения стволовых клеток в медицине, о чем свидетельствуют более 4800 зарегистрированных клинических испытаний (в том числе проводимых и в Беларуси), призванных оценить терапевтический потенциал этих клеток.
