CC BY
149
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ПЕТРОЗАВОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
Март, № 2
УДК 612.822.1.015.36.014.46:615.357.452
Биологические науки 2015
владимир Петрович Андреев
доктор химических наук, профессор кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии эколого-биологического факультета, Петрозаводский государственный университет (Петрозаводск, Российская Федерация) andreev@psu.karelia.ru
АННА вЛАДИМИРОвНА ЗАЧИНяЕвА доктор биологических наук, старший преподаватель кафедры микробиологии, Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова (Санкт-Петербург, Российская Федерация)
anvzanna@aol. com
эндогенные и экзогенные МОДИФИКАТОРЫ активности NA,K-АТФАЗЫ*
Преинкубация гомогената мозга или печени крыс с ацетилхолином (норадреналином) приводит к уменьшению (увеличению) активности №,К-АТФазы и высвобождению диализуемого низкомолекулярного активатора (ингибитора) фермента интактных микросом. Ацетилхолин (норадреналин) индуцирует синтез фактора-активатора (ингибитора) и вызывает ускорение (замедление) синтеза фермента. Низкомолекулярный ингибитор из мозга крупного рогатого скота выделен в индивидуальном состоянии и охарактеризован. Некоторые производные N-оксидов пиридина и хинолина в концентрациях 10-4-10-10 M ингибируют активность №,К-АТФазы микросом мозга. Обнаружен новый активатор (N-оксид 2-(2,4-диметоксистирил)хинолина) №,К-АТФазы, способный активировать фермент в концентрациях 10-6-10-9 М. Так как эти соединения изменяют активность фермента в очень низких концентрациях, они могут оказаться эффективными препаратами при лечении заболеваний, связанных с нарушениями функций №,К-АТФазы.
Ключевые слова: №,К-АТФаза, нейромедиаторы, ацетилхолин, норадреналин, эзерин, ингибиторы, активаторы, мозг, печень, гетероароматические N-оксиды
Предположение о прямом влиянии нейромедиаторов на процессы биосинтеза РНК и белков нервных клеток появилось в середине 60-х годов прошлого века. Оно основывалось на допущении возможности поступления этих соединений в нервные клетки, так как известно, что 20-30 % общего количества ацетилхолина (АХ) и норадреналина (НА) в нервной ткани составляет фонд так называемого свободного медиатора, находящегося в цитоплазме, содержание которого изменяется в зависимости от чередования возбуждения и покоя [9].
При изучении вопроса об их влиянии на процессы транскрипции было обнаружено, что Ах и НА в низких концентрациях (с максимумом при 10-7-10-5 М) изменяют включение предшественников в РНК клеточных ядер [9]. Однако для подтверждения вывода о прямом воздействии медиаторов на экспрессию генов нервных клеток необходимо было детальное исследование синтеза продуктов индивидуальных генов. В качестве такого обьекта нами был выбран фермент №,К-АТФаза.
№,К-АТФаза - интегральный белок, встроенный в цитоплазматическую мембрану и обеспечивающий асимметричное распределение ионов Na+ и K+ между клеткой и внеклеточной средой, играет исключительно важную роль в поддержа-
© Андреев В. П., Зачиняева А. В., 2015
нии процессов возбудимости и водно-солевого обмена в организме животных и человека. Поэтому не удивительно, что большое количество публикаций посвящено изучению механизмов регуляции функционирования этого фермента.
Особенное внимание в последнее время уделяется поиску и выделению эндогенных (природных) и экзогенных (искусственного происхождения) модификаторов активности №,К-АТФазы, которые могут оказывать на нее как прямое, так и опосредованное воздействие. Решение этой проблемы имеет не только научное, но и практическое значение. В частности, изменение концентрации таких веществ в организме человека, как полагают, связано с развитием и течением гипертонии, сердечной недостаточности, некоторых форм рака и многих других заболеваний [27].
Имевшиеся до наших работ литературные данные [1] не давали основания для достаточно обоснованного заключения о возможности регуляции этими нейромедиаторами АТФазы in situ, так как, во-первых, были противоречивы, а во-вторых, действующие концентрации слишком высоки - 10-2-10-3 М [9]. Очевидно, что наблюдаемое in vitro обычно небольшое изменение активности фермента было обусловлено сдвигом ионных или буферных свойств среды при добавлении нейромедиатора, поскольку в таком же
8
В. П. Андреев, А. В. Зачиняева
диапазоне изменялась активность энзима в зависимости от природы буфера.
В качестве модельной системы, позволяющей выяснить механизмы воздействия на №,К-АТФа-зу ацетилхолина, норадреналина и ксенобиотиков, мы выбрали гомогенат мозга крыс, в котором имеются все вещества и органеллы нервных клеток, необходимые для биосинтетических процессов.
Проведенные нами исследования [12] показали, что регуляторное влияние Ах на уровень активности Na,K-ATФазы в гомогенате мозга крыс заключается в индукции синтеза низкомолекулярного фактора-активатора при одновременном снижении синтеза самого фермента.
Однако в опытах in vivo нами было обнаружено, что внутрибрюшинное введение крысам эзерина в нетоксических дозах (0,2 и 0,4 мг/кг), но вызывающих многократное увеличение содержания Ах в мозге [26], оказывает действие, противоположное тому, которое Ах индуцирует в гомогенате: снижение Na,K-ATФазной активности недиализованных микросом и существенное увеличение активности диализованных.
Оказалось, что в этом случае добавление к интактным микросомам лиофилизирован-ного материала, прошедшего через мембрану при диализе микросомно-цитоплазматической фракции, выделенной из мозга животных, получавших эзерин, вызывает снижение их Na,K-ATФазной активности, то есть при воздействии эзерина in vivo имеет место образование фактора-ингибитора и активация синтеза самого фермента.
Свидетельством того, что при воздействии эзерина происходит увеличение количества молекул фермента в мембранах, служит факт прироста числа центров связывания 3Н-уабаина мик-росомами (рис. 1а). Обнаружено, что 3Н-уабаин имеет два типа центров связывания в мембране с различным сродством (что соответствует лите-
Рис. 1. Связывание 3Н-уабаина (в координатах Скэтчар-да) диализованными микросомами: (а) мозга контрольных животных (1) и животных, получавших эзерин (2), (б) контрольного гомогената (1) и гомогената, преинкубированного с НА в концентрации 10-4 М (2). По оси абсцисс - связанный уабаин (а) в нМ-10-2, (б) в нМ-10-3, по оси ординат - отношение связанного уабаина к свободному (а) -10-3 , (б) -10-4
ратурным данным [19], [23]), причем количество тех и других увеличивается после воздействия эзерина.
Различия в действии эзерина in vivo и in vitro (в концентрациях, полностью подавляющих активность холинэстераз, его влияние в гомогенате подобно Ах) дают основание предположить, что при нарушении целостности мозга из процессов регуляции уровня активности №,К-АТФазы исключаются какие-то звенья. Одним из них может быть нарушение межклеточных взаимодействий, например исчезновение влияния на холиноцеп-тивные клетки вставочных нейронов, высвобождающих тормозные медиаторы (норадреналин, дофамин), оказывающих противоположное Ах действие на синтетические процессы [10], [11].
С целью проверить данное предположение мы изучили влияние преинкубации гомогената мозга крыс с норадреналином (НА) на активность Na,K-АТФазы микросом [2], [3] и обнаружили, что при этом происходит снижение активности фермента (табл. 1).
Таблица 1
Влияние преинкубации гомогената мозга и м и к р о с о м н о - ц и т о п л а з м ат и ч е с ко й фракции с НА на активность йа,К-АТФазы микросом
Преинку- бированная клеточная фракция Добавленный агент и его концентрация Условия обработки клеточной фракции Активность фермента, % от контроля
Гомогенат НА 10-6 М Без диализа 93 ± 4 (4)
НА 10-5 М 86 ± 7 (13)*
НА 10-4 М 81 ± 6 (15)**
НА 10-3 М 95 ± 4 (10)
НА 10-4 М Диализ 132 ± 10 (9)**
НА 10-4 М + актиномицин D (50 мкг/мл) Без диализа 128 ± 9 (6)*
НА 10-4 М + актиномицин D (50 мкг/мл) Диализ 127 ± 10 (9)*
НА 10-4 М + рибонуклеаза (100 мкг/мл) Без диализа 102 ± 8 (9)
НА 10-4 М + рибонуклеаза (100 мкг/мл) Диализ 98 ± 8 (10)
Микросомно- цитоплаз- матическая фракция НА 10-4 М Без диализа 126 ± 7 (9)*
Примечание. * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; в скобках - число опытов.
Эффект зависит от концентрации НА, и максимум угнетения наблюдается при концентрации 10-4 М. После диализа микросомно-цитоплазма-тической фракции, полученной из преинкубированного с норадреналином гомогената, изолированные микросомы обладают более высокой по сравнению с контролем Na^-АТФазной активностью. Этот факт можно интерпретировать в том смысле, что при преинкубации гомогената с НА имеет место образование диализуемого ин-
Эндогенные и экзогенные модификаторы активности №,К-АТФазы
9
гибитора №,К-АТФазы; сам же фермент при этом претерпевает либо активацию, либо количество его в мембранах увеличивается. Справедливость настоящего предположения подтверждается тем, что: а) диализуемый материал при добавлении к интактным микросомам ингибирует их Na,K-АТФазную активность (на 30 %), б) преинкубация гомогената с НА на фоне ингибитора транскрипции актиномицина D вызывает увеличение активности фермента как у недиализованных, так и диализованных микросом (на 20-25 %) (см. табл. 1). Таким образом актиномицин D полностью препятствует появлению фактора-ингибитора Na,K-АТФазы и не затрагивает активирующее действие НА на фермент. Ингибитор же трансляции (рибонуклеаза) полностью снимает влияние норадреналина на активность Na,K-AT-Фазы как недиализованных, так и диализованных микросом.
Полученные нами экспериментальные результаты позволяют предполагать существование следующих путей воздействия норадреналина на уровень активности №,К-АТФазы: ускорение синтеза фермента на уровне трансляции и одновременная индукция биосинтеза низкомолекулярного фактора-ингибитора с первичным эффектом норадреналина на уровне транскрипции.
Эффект норадреналина при преинкубации недиализованной микросомно-цитоплазмати-ческой фракции является подтверждением справедливости предлагаемой интерпретации. В этом случае наблюдалась активация фермента, то есть при удалении ядер из гомогената НА не индуцирует появление фактора-ингибитора, но сохраняется его активирующий эффект на №,К-АТФазу.
Свидетельством того, что при воздействии НА происходит увеличение количества молекул Na,K-ATФазы в мембранах, служит факт прироста числа центров связывания 3Н-уабаина микросомами (рис. 1б). После преинкубации гомогената с НА (как и в опытах с эзерином in vivo) увеличивается количество центров связывания обоих типов.
Полученные результаты дают основание предполагать, что в нервных клетках существует система норадреналиновой регуляции уровня №,К-АТФазной активности мембран, состоящая в активации синтеза фермента на уровне трансляции и одновременной индукции синтеза низкомолекулярного ингибитора его каталитической активности на уровне транскрипции.
Таким образом, нами показано, что in vitro и in vivo существует сложная система медиаторной регуляции уровня Na^-АТФазной активности нервных клеток, основные черты которой можно представить следующим образом: при активации синтеза энзима параллельно синтезируется фактор-ингибитор, и наоборот - при угнетении синтеза №,К-АТФазы образуется фактор-активатор. Очевидно, что эти разнонаправленные процессы
являются звеньями единой саморегулирующейся системы поддержания активности фермента на оптимальном функционально обусловленном уровне.
С целью сравнить влияние нейромедиаторов на активность фермента нейрональных и других типов клеток мы провели опыты с гомогенатом печени крыс (табл. 2).
Как и ожидалось, в первом приближении биосинтетические процессы в печени и мозге довольно похожи. Например, преинкубация гомогената с АХ в обоих случаях индуцирует синтез низкомолекулярного диализуемого активатора(ов) №,К-АТФазы и ингибирует процесс синтеза самого фермента. Внутрибрюшинное же введение эзерина крысам вызывает снижение активности энзима. Однако анализ данных табл. 2 позволяет сделать вывод, что при использовании печени эффект выражен более резко, чем для мозга: эзе-рин in vivo приводит к гораздо более сильному ингибированию (на 70 %), а АХ - к значительно ярче выраженной активации (на 42 %) фермента и несколько сильнее (на 13 %) подавляет синтез молекул №,К-АТФазы.
Следует отметить, что данные факты не противоречат литературным данным. В кровь (вследствие их синаптической «утечки» при проведении нервного импульса) поступают АХ, НА и другие нейромедиаторы, которые в дальнейшем могут попадать в клетки тканей со слабо выраженной или отсутствующей медиацией соответствующего типа [9].
Согласно данным работы [13], действие АХ на активность ацетилхолинэстеразы микросом мозга и печени также идентично. Однако бесклеточная система печени более чувствительна к АХ, чем система мозга (хотя максимальный эффект
Таблица 2
Влияние эзерина in vivo и НА и АХ in vitro на активность Na.K-АТФазы микросом и РНКаз гомогената печени и мозга крыс
Обьект исследования
Условия опыта Печень Мозг
Без диализа Диализ Без диализа Диализ
На,К-АТФазная активность
Эзерин (0,2 мг/кг) 20 ± 8 (6)** - 90 ± 3 (14)* 139 ± 6 (9)**
НА (10-4 М) гомогенат - - 95 ± 4 (10) 132 ± 10 (9)**
АХ (10-4 М) гомогенат 172 ± 21 (6)** 78 ± 9 (9)* 130 ± 7 (11)*** 91 ± 4 (9)*
РНКазная активность
Эзерин 83 ± 4 77 ± 3
(0,2 мг/кг) (10)** (8)***
Эзерин (0,4 мг/кг) 85 ± 6 (7)* - 87 ± 4 (7)** -
Примечание. * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001; в скобках - число опытов.
10
В. П. Андреев, А. В. Зачиняева
наблюдался при одной и той же концентрации АХ - 10-5 М). Этот факт имеет свой биологический смысл, учитывая, что содержание Ах в крови ниже, чем в нервной ткани.
Обратимый ингибитор холинэстераз эзерин в нетоксичной дозе, повышающей содержание Ах в крови, существенно снижает РНКазную активность гомогената как печени, так и мозга крыс (этот эффект подобен его влиянию на Na,K-АТФазу, табл. 2), но увеличивает [13] активность АхЭ микросом печени.
Нам представлялись закономерными постановка и решение вопроса о том, универсально ли действие обнаруженных низкомолекулярных факторов - модификаторов активности Na,K-АТФазы, или же они воздействуют на фермент только тех клеток, в которых сами вырабатываются, то есть не существуют ли для каждого типа клеток особые соединения - регуляторы. С этой целью материал, прошедший через мембраны при диализе микросомно-цитоплазматической фракции, полученной после преинкубации гомогената печени с АХ (10-4 М), инкубировали с микросомами мозга. Наблюдавшееся в этих опытах существенное увеличение активности №,К-АТФазы (150 %, n = 52, p < 0,0001), по-видимому, свидетельствует о том, что фактор - активатор фермента не обладает строгой тканевой специфичностью.
Поскольку в организме животных и человека существуют различные типы низкомолекулярных модификаторов активности №,К-АТФазы, мы попытались выделить соединения, обладающие подобными свойствами в индивидуальном состоянии.
На первом этапе очистки микросомно-цито-плазматическую фракцию, полученную из гомогената головного мозга крупного рогатого скота, диализовали против 10 объемов дистиллированной воды. Диализат концентрировали в вакууме и разделяли на колонке, заполненной силикагелем. Содержимое полученных фракций анализировали методом ТСХ на силуфоле (рис. 2а) и проверяли их способность изменять активность №,К-АТфазы.
Рис. 2. Анализ методом ТСХ на силуфолах фракций, полученных при разделении колоночной хроматографией на силикагеле диализата микросомно-цитоплазматической (а) и элюата фракции 1 (б) и препаративное разделение на силуфолах соединений фракции 1.1 (в). Проявление: нингид-рином (а, б), «боковое» парами йода (в). Подвижная фаза: вода (а), хлороформ-этанол-вода = 5 : 13 : 5 (б), хлороформ-этанол-вода = 13 : 20 : 5 (в)
Материал первой фракции, полученный с использованием в качестве элюента дистиллированной воды и обладающий способностью ингибировать фермент (М = 66 %, n = 13, p < 0,01), вновь фракционировали на силикагеле, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей хлороформ - этанол - вода (5 : 13 : 5) (рис. 2б).
Далее содержимое фракции 1.1 (М = 68 %, n = 8, p < 0,005), не проявляемое нингидрином, разделяли методом ТСХ на силуфоле с использованием системы растворителей хлороформ - этанол -вода (13 : 20 : 5) (рис. 2в).
После «бокового» проявления парами йода вещества с пластинки элюировали водой и вновь анализировали их способность модифицировать активность №,К-АТФазы (табл. 3).
Таблица 3
Влияние соединений, содержащихся в элюате с силуфола (см. рис. 2), на активность Ха,К-АТФазы микросом мозга крупного рогатого скота
Фрак- ции Эффект в % к контролю Число опытов Коэф. Стью-дента Уровень значимости
1.1.1 100 ± 11 5 0,42
1.1.2 63 ± 10 7 2,48 < 0,05
1.1.3 75 ± 5 9 5,77 < 0,001
1.1.4 74 ± 7 7 4,13 < 0,005
Согласно данным табл. 3, фракция 1.1 содержит или несколько веществ, способных ингибировать фермент, или одно соединение, существующее в нескольких формах [14].
Далее мы исследовали некоторые свойства компонентов фракции 1.1.3 (самое сильное проявление парами йода). Как было показано методом масс-спектрометрии, эта фракция включает хлористый аммоний, который может иметь как эндогенное, так и экзогенное (в химических лабораториях в воздухе всегда содержатся HCl и аммиак, которые при концентрировании больших объемов растворов загрязняют выделяемые соединения) происхождение. Использование цветной реакции между хлористым аммонием и реактивом Несслера [17] позволило количественно оценить содержание этой соли (70 %).
В ИК-спектре фракции 1.1.3 (рис. 3) наблюдаются следующие полосы поглощения (см-1): 3600-2800 (шир., с.), 1615 (с.), 1400 (с.), 1110 (сл.), 1040 (сл.). Их положение соответствует наличию С-Н, О-Н, С-N и N-H (в аммонийной форме) связей.
При кратковременном нагревании компонентов данной фракции при 180 °С вместо одной широкой полосы при 3140 см-1 появляются две (3430 и 3135 см-1), что, возможно, вызвано разложением менее устойчивого, чем хлорид аммония, органического соединения, содержащего в своем составе аммонийные группы.
В спектре 1Н ЯМР ингибитора в D2O (рис. 4) присутствуют дублет при 1,38 м. д. и мультиплет
Эндогенные и экзогенные модификаторы активности №,К-АТФазы
11
Рис. 3. ИК-спектры в KBr фракции 1.1.3 (а), NH4C1 (б)
и фракции 1.1.3, прогретой 20 секунд при 180 °С (в)
в области 3,31-3,82 м. д. (за счет электроотрицательных атомов, например азота и кислорода, дезэкранирующих протоны). Наличие широкого и мощного пика в области 4,0-5,5 м. д. обусловлено примесью HOD и H2O в дейтерированном растворителе. Этот факт не позволил сделать однозначный вывод о наличии или отсутствии гидроксильных групп в исследуемом образце.
Спектр 13С ЯМР фракции 1.1.3 в D2O (рис. 5) содержит четыре сигнала при 20,66, 63,11, 69,02 и 72,68 м. д. (четыре типа атомов углерода); слабая интенсивность поглощения в ИК-спектре в области, соответствующей валентным колебаниям С-Н связей (рис. 5), свидетельствует об их малом количестве. Регистрация спектра 13С ЯМР в режиме dept 135 указывает на отсутствие четвертичных атомов углерода и позволяет сигнал при 63,11 м. д. приписать СН2 группе, а остальные сигналы - СН и СН3 группам.
Данные спектроскопии 13С ЯМР однозначно указывают на то, что молекула ингибитора не содержит двойные связи и ароматические кольца ввиду отсутствия сигналов в соответствующих им слабых полях, но не исключают наличия гидроксильных, простых эфирных или аминогрупп, а также дизамещенной тройной связи. Однако поскольку все известные к настоящему времени природные ацетиленовые соединения имеют растительное происхождение, а мы выделили ин-
Рис. 4. Спектр протонного магнитного резонанса фракции 1.1.3 в D2O
гибитор из мозга животных, присутствие в нем тройной связи кажется маловероятным. Кроме того, нагревание водного раствора ингибитора на кипящей водяной бане с 6N HCl в течение 30 мин. не приводит к изменениям в его хроматографическом поведении в тонком слое (ТСХ). Это указывает на отсутствие в молекуле фрагментов, способных к гидролизу или реакциям электрофильного присоединения (для ацетиленовых соединений характерны реакции АЕ с галогенводородными кислотами).
Методом гель-хроматографии на молселекте Г-10 нам удалось освободиться от хлорида аммония во фракции 1.1.3 и оценить молекулярную массу ингибитора (около 200 Да). В качестве реперных веществ использовали глутатион, углекислый натрий и глицин.
После обработки 4 кг мозга крупного рогатого скота нами было выделено около 2 мг белого твердого вещества, содержащего активное начало фракции 1.1.3 и обладающего выраженной способностью ингибировать №,К-АТФазу. Индивидуальность данного соединения доказана методами ТСХ, ВЭЖХ и гель-хроматографии. Оно хорошо растворимо в воде и метаноле и очень плохо в хлороформе.
Нами также были зарегистрированы масс-спектры самого ингибитора и его силилиро-ванного аналога (рис. 6), в которых не удалось идентифицировать пики молекулярных ионов. Интерпретация этих спектров согласуется с приведенными выше данными, а соотношение количеств изотопов кремния 28Si, 29Si и 30Si указывает на то, что силилированию в молекуле исследуемого соединения, по-видимому, подверглись три функциональные группы.
Суммируя имеющиеся данные, мы склонны считать, что выделенный ингибитор содержит
Рис. 5. Спектры 13С ЯМР в обычных условиях (слева) и в режиме dept 135
12
В. П. Андреев, А. В. Зачиняева
Рис. 6. Хроматограмма силилированного ингибитора (а) и его масс-спектр (б)
как минимум четыре атома углерода, тpи ами-но- (в аммонийной форме) и гидроксильн(ую)ые группы. Возможно, он является ациклическим аминоспиртом или его производным, содержащим простую эфирную связь.
К настоящему времени известны различные эндогенные ингибиторы №,К-АТФазы - катионы Ca2+ [16], [18], ванадат-ион [20], нейромедиаторы (ацетилхолин, норадреналин и др. [1], [3],
[9], [12], [18]), гистидил-пролилдикетопиперазин
[20] и «уабаинподобные» гликозиды [25]. В работе Елаева и Байгильдиной [14] сообщалось об эндогенном ингибиторе с молекулярной массой около 190 Да, который, по мнению авторов, является амидом, содержащим морфолиновую структуру.
Анализ полученных нами данных позволяет сделать вывод о том, что выделенный нами из мозга крупного рогатого скота ингибитор [4] Nа,К-АТФазы не имеет аналогов в литературе. Выяснение в деталях его структурной формулы, а также механизмов биосинтеза и взаимодействия с №,К-АТФазой является предметом дальнейших наших исследований.
Кроме того, мы исследовали способность влиять на активность Nа,К-АТФазы некоторых других кислород- и азотсодержащих экзогенных соединений.
Гетероароматические N-оксиды показывают широкий спектр биологической активности и образуются в организме животных и человека при инактивации гетероциклических соединений. Однако их влияние на №,К-АТФазу практически не исследовалось. Мы нашли лишь несколько работ, в которых они используются как лекарственные препараты [1] и при изучении ЭПР-спек-тров (например, 5,5-диметил-1-пирролин N-оксид [25]), а N-оксид 2-гептил-4-гидроксихинолина
применяют как ингибитор цитохромных систем
[21], [22].
Ввиду того, что нами в последние годы синтезировано большое количество гетероароматических N-оксидов (I-V), мы проверили способность соединений этого класса в физиологических концентрациях (10-4-10-10 М) изменять in vitro активность №,К-АТФазы мозга крупного рогатого скота.
Y =Н X = Н(а), 2-Ме(6), 4-Ме(в), 4-МеО(г), 4-Вг(д), 4-SH(e), 4-ЫОг(ж), Э-Ш^з), 9-С1(м), 4-SAg(s), 4-(3-N02Ph), 4-5Ph(2,4^N02KH). ^SCH^CHjOKfo),
4-CH=CHPh(4-OMe)(T), 4-CH=CHPh(2,4-OMe(v), 2-CH=CHPhf4'NMe2)№>, 4-CH=CHph(4-NNMe?)(x}, 2-CH=NPh(4'NM
Y = Me, X = N0^4)
N-оксиды 4-метокси- и 4-бромпиридина, 2-метил, 4-метокси-, 4-меркапто-, 3-нитрофенокси, 4-стирил и 2-стирилхинолина, моно-N-оксида хиноксалина и соединение IV в концентрации 10-4 М не изменяли (n = 10) активность, и поэтому для них при более низких концентрациях исследования не проводили. Данные для других соединений представлены в табл. 4.
Полученные результаты [5] показали, что 16 из них являются ингибиторами (на 67-20 %) №,К-АТФазы даже при концентрациях 10-8 М, что сопоставимо или превышает эффективность строфантинов К и G. Активность 15 ингибиторов (за исключением № 9) сохраняется постоянной в диапазоне концентраций 10-4-10-8 М и только при дальнейшем уменьшении их концентрации претерпевает изменения. По-видимому, этот феномен можно объяснить образованием прочных комплексов N-оксидов с Na^-АТФазой. Так, если предположить существование таких аддуктов состава 1 : 1, то до тех пор, пока число молекул N-оксида будет превышать число центров связывания фермента, его ингибирование не должно изменяться. Это мы и наблюдаем в указанном диапазоне концентраций. Как только число молекул N-оксида станет меньше числа молекул фермента, не связанные с ингибитором молекулы Na,K-АТФазы будут повышать общую активность энзима, и тем в большей степени, чем больше будет соотношение фермент / N-оксид. В этом случае даже двукратное изменение указанного соотношения должно приводить к заметным изменениям активности фермента. Например, для соединений № 5-7, 14, 20 при переходе от 10-8 к 10-9 М ингибиторный эффект пропадает полностью и только для № 14 активен даже при 10-10 М. Активирующее действие соединения № 9 при 10-4 М, по-видимому, является неспецифическим и может быть обусловлено значительной концентрацией ионов Ag+.
Особо следует отметить резко выраженный (180-190 %) активирующий эффект соединения
Эндогенные и экзогенные модификаторы активности №,К-АТФазы
13
Таблица 4
Влияние гетероароматических N-оксидов на активность Na.K-АТФазы микросом
Активность фермента, % от контроля
№ х Концентрация N-оксида
10-4 М 10-6 М 10-8 М 10-9 М 10-10 М
PyO
1 4-Me 78 ± 1 (10)*** 81 ± 2 (10)*** 83 ± 1 (10)***
2 4-NO2 91 ± 2(9)***
3 4-[CH=CHC6H5 (4-OCH3)] 63 ± 2 (10)*** 83 ± 1 (10)*** 80 ± 1 (10)***
4 2-[CH=CHC6H5 (4-OCH3)] 96 ± 1 (10)**
5 4-[CH=CHC6H3 (2,4-OCH3)] 34 ± 3 (9)*** 34 ± 1 (10)*** 37 ± 1(10)*** 97 ± 2 (10) 97 ± 4 (15)
6 4-[CH=CHC6H4 (4-N(CH3)2] 22 ± 2 (20)*** 29 ± 1 (9)*** 37 ± 1(10)*** 97 ± 2 (10) 102 ± 2 (10)
QO
7 H 39 ± 3 (10)*** 22 ± 2 (10)*** 27 ± 3 (10)*** 99 ± 2 (10) 93 ± 5(10)
8 4-Me 104 ± 1 (10)**
9 4-SAg 170 ± 5 (9)*** 76 ± 3 (10)*** 74 ± 3 (9)***
10 4-N3 64 ± 1 (10)*** 72 ± 1 (10)*** 65 ± 9 (7)**
11 4-CP 68 72 77 76
12 4-Вга 75 77 85 82
13 4-NO2 33 ± 2 (9)*** 32 ± 1 (10)*** 33 ± 1 (10)*** 101 ± 4 (10)
14 2-Me-4NO2 41 ± 1 (10)*** 43 ± 1 (10)*** 46 ± 1 (10)*** 94 ± 2 (10)* 90 ± 4 (15)*
15 4-SC6H4 (2,4-NO2) 62 ± 3 (10)*** 72 ± 1 (10)*** 73 ± 1 (9)***
16 4 -SCH2CH2OH 91 ± 2 (10)**
17 4- [CH=CHC6H3 (2,4-OCH3)] 56 ± 4 (10)*** 188 ± 2 (10)*** 179 ± 1 (10)*** 108 ± 2 (10)** 100 ± 2 (10)
18 4-[CH=CHC6H4 (4- (CH3)2] 47 ± 1 (10)*** 44 ± 1 (10)*** 50 ± 1 (10)*** 96 ± 4 (10)
19 2-[CH=CHC6H4 (4-N(CH3)2] 59 ± 2 (10)*** 58 ± 2 (10)*** 69 ± 3 (10)*** 104 ± 3 (10)
20 2-[CH=NC6H4 (4-N(CH3)2] 56 ± 2 (10)*** 60 ± 1 (10)*** 57 ± 1 (10)*** 98 ± 2 (10) 90 ± 2 (15)**
AcrO
21 9-NO2 87 ± 3 (10)** 104 ± 4 (10) 98 (10) 111 ± 5 (15)*
22 9-Cl 108 ± 4 (15)* 99 ± 4 (10) 114 ± 5 (15)* 97 ± 2 (10)
Другие соединения
23 Фуроксан IV 66 ± 1 (10)*** 65 ± 1(10)*** 64 ± 1 (10)*** 97 ± 3 (10)
24 V 28 ± 1 (10)*** 29 ± 1(10)*** 31 ± 1 (10)*** 99 ± 2 (9)
25 Фталимид 39 ± 3 (10)*** 22 ± 2 (10)*** 27 ± 3 (10)*** 99 ± 2 (10) 93 ± 5 (10)
Примечание. а Данные работы [15], n = 10, Р < 0,05. * - Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001; в скобках - число опытов.
№ 17 (№ 22 - менее активен), так как в настоящее время неизвестны вещества, обладающие подобным действием на фермент. Ввиду того что данное воздействие вызывается очень низкими его концентрациями (10-6-10-8М), можно предположить, что в составе №,К-АТФазы имеется, по крайней мере, один особый центр, ответственный за взаимодействие с соединениями, активирующими фермент. Таким образом, следует ожидать открытия и других эндогенных активаторов данного энзима. Ингибирующая способность соединения № 17 при более высокой концентрации (на 42 % при 10-4 М), по-видимому, является неспецифической.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Выделение эндогенного ингибитора ^,К-АТФазы
2 кг мозга, полученного на Петрозаводском мясокомбинате [4] в день забоя животных, гомогенизировали в дистиллированной воде (из расчета 1 мл на мозг). Гомогенат центрифугировали 15 мин. при
12 000 g, супернатант диализовали против 10 объемов дистиллированной воды в течение 12 ч. при +4 °C. Полученный диализат концентрировали в вакууме при 30-35 °С до объема 10 мл и использовали для дальнейших исследований. Материал, не прошедший через мембраны, центрифугировали 60 мин. при 30 000 g. Осадок микросом суспензировали в 0,05 М трис-HCl (pH 7,55) и хранили при -20 °С (в течение 1 месяца активность №,К-АТФазы оставалась почти неизменной). Определение способности выделенных соединений модифицировать активность №,К-АТФа-зы осуществляли, как описано ранее [12]. Выделение ингибитора из диализата состояло из следующих этапов.
1. В колонку диаметром 20 мм, содержащую 20 г силикагеля L 100/250 мкм фирмы Chemapol, вносили 1 мл диализата от 200 г мозга и элюировали водой, собирая аликвоты объемом 5 мл. Содержимое фракций анализировали методом ТСХ на си-луфоле (подвижная фаза - вода, проявление 0,1 % спиртовым раствором нингидрина, рис. 1а).
14
В. П. Андреев, А. В. Зачиняева
2. Материал первой фракции концентрировали до обьема 1 мл, наносили на 20 г силикагеля L 40/100, помещенного в колонку диаметром 20 мм, и элюировали системой растворителей хлороформ -этанол - вода (5 : 13 : 5). Анализ содержимого фракций осуществляли методом ТСХ на силуфо-ле (подвижная фаза хлороформ - этанол - вода (5 : 13 : 5), проявление 0,1 % спиртовым раствором нингидрина, рис. 1б). Для дальнейшей работы использовали непроявляемую нингидрином фракцию 1.1.
3. Содержимое фракции 1.1 высушивали в вакууме. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл H2O и разделяли методом ТСх на силуфолах (нанесение полоской, подвижная фаза хлороформ - этанол - вода (13 : 20 : 5), рис. 1в). После «бокового» проявления парами йода вещества с пластинки элюировали водой и анализировали их способность модифицировать активность №,К-АТФазы.
4. Содержимое фракции 1.1.3 высушивали в вакууме, сухой остаток растворяли в 1 мл H2O и вносили в колонку (2 х 75 см) с гелем молселект Г-10 (тонкий), уравновешенный дистиллированной водой. Элюирование проводили со скоростью 15 мл/ч, аликвоты обьемом 2 мл отбирали с помощью коллектора фракций.
Доказательство индивидуальности выделенных веществ
Об индивидуальности выделенного нами ингибитора №,К-АТФазы свидетельствует наличие лишь одного регистрируемого компонента при использовании описанных ниже хроматографических методов разделения.
1. ТСХ на силуфолах и на силикагеле L 5/40 (фирмы Chemapol) с 13 % гипса. Использовали следующие системы растворителей: хлороформ - этанол -вода (13 : 20 : 5, 5 : 13 : 5), бензол - этанол (2 : 1), бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 1). Проявление пластинок во всех случаях осуществляли парами йода.
2. ВЭЖХ (насос HPP-5001, УФ-детектор LCD 2040, самописец TZ 4620, фирмы Laboratorni pristroje, Praha, X = 235 нм). Хроматографирование осуществляли с использованием колонок Separon C[8, CN, NH2 и следующих систем растворителей: ацетонитрил - вода (84 : 16), вода, хлороформ - этанол -вода (13 : 20 : 5), хлороформ - этанол (10 : 1). *
3. Газожидкостная хроматография:
а) Силилирование.
Смесь 0,2 мг сухого остатка (фракции 1.1.3), 1 мкл пиридина и 100 мкл ^метил-И-(триметилсилил) трифторацетамида (MSTFA) нагревали при 60 °С в течение 20 мин.
б) Условия ГЖХ-анализа.
Газовый хроматограф HP 5890 фирмы Hewlett-Packard (USA), оснащенный пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой
12,5 м х 0,2 мм (внутренний диаметр), неподвижная фаза HP-1 с толщиной слоя 0,33 мкм.
Расход газа-носителя (гелий) - 1,5 см3/мин, водорода и воздуха к детектору - 25 и 250 см3/мин соответственно. Температуру колонки изменяли от 40 до 280 °С со скоростью 10 °С/мин. Температура испарителя и детектора - 250 и 300 °С соответственно. Объем вводимых проб составлял 0,5-1,0 мкл в режиме разделения потока 1 : 10. Регистрацию результатов проводили с использованием интегратора HP 3396A фирмы Hewlett-Packard (USA).
Исследование структуры ингибитора Ш,К-АТФазы
ИК-спектр соединения, представленного фракцией
1.1.3, снимали в KBr на приборе Specord M 80, ПМР-и 13С ЯМР-спектры в D2O - на приборе Bruker AM (500 Мгц), масс-спектр ингибитора - на приборе МХ 1321 (70 eV), а его силилированного производного -на хромато-масс-спектрометре GC/MS 5988A (70 eV) фирмы Hewlett-Packard (кварцевая капиллярная колонка 25 м х 0,32 мм, толщина пленки неподвижной фазы HP-1-0,52 мкм. Температуру колонки программировали от 40 до 270 °C со скоростью 4 ^/мин. Остальные условия аналогичны тем, которые описаны в разделе ГЖХ).
Гетероароматические N-оксиды были синтезированы в соответствии с методами, описанными в работах [1], [6], [7], [8]. Их способность in vitro модифицировать активность №,К-АТФазы была исследована, как описано в работах [1], [2]. Написание данной статьи отчасти вызвано тем, что в работах [8], [15] были использованы экспериментальные данные, касающиеся выделения и характеристики ингибитора Na^K-АТФазы и влияния полученных нами гетероароматических N-оксидов на его активность, без разрешения авторов и без ссылок на соответствующие работы [4], [5].
* Работа выполнена при поддержке Программы стратегического развития ПетрГУ в рамках реализации комплекса мероприятий по развитию научно-исследовательской деятельности на 2012-2016 гг.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Андреев В. П. Молекулярные комплексы гетероароматических N-оксидов и ацетиленовых аминов с v-акцепторами как модель исследования нуклеофильности и основности соединений с пространственно доступными реакционными центрами: Дисс. ... д-ра химич. наук. Петрозаводск, 2007. 427 с.
2. Андреев В. П., Елаев Н. Р., Унжаков А. Р. Регуляция норадреналином биосинтеза Na^K-АТФазы и ее низкомолекулярного ингибитора // Нейрохимия. 1984. Т. 3. № 4. С. 443.
3. Андреев В. П., Елаев Н. Р., Унжаков А. Р. Регуляция норадреналином биосинтеза №,К-АТФазы и ее низкомолекулярного ингибитора. Деп. в ВИНИТИ 12.11.84, № 7248-84.
4. Андреев В. П., Платонов А. В. Выделение и характеристика нового эндогенного низкомолекулярного ингибитора Na,K-ATPaзы из мозга крупного рогатого скота. Деп. в ВИНИТИ 02.04.97, № 1066-В97.
Эндогенные и экзогенные модификаторы активности №,К-АТФазы
15
5. Андреев В. П., Корвачева Е. Г, Нижник Я. П. О влиянии N-оксидов пиридина и хинолина на активность №,К-АТФазы микросом мозга крупного рогатого скота // химико-фармацевтический журнал. 2006. Т. 40. № 6.
С. 96-97.
6. Андреев В. П., Батоцыренова Е. Г, Рыжаков А. В., Родина Л. Л. Процессы внутримолекулярного переноса заряда в ряду стирильных производных N-оксидов пиридина и хинолина // Химия гетероциклических соединений. 1998. № 8. C. 1093-1102.
7. Андреев В. П., Рыжаков А. В., Теканова С. Г Стирильные производные N-оксида хинолина // Химия гетероциклических соединений. 1995. № 4. C. 518-521.
8. Батоцыренова Е. Г. Влияние эндогенных и экзогенных модификаторов на активность №,К-АТФазы: Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. СПб., 2005. 23 с.
9. Голиков С. Н., Долго-Сабуров В. Б., Елаев Н. Р., Кулешов В. И. Холинергическая регуляция биохимических систем клетки. М.: Медицина, 1985. 224 с.
10. Елаев Н. Р. О характере синаптической регуляции синтеза белков в нервных клетках // Доклады АН СССР. 1975. Т. 222. № 6. С. 1477-1479.
11. Елаев Н. Р. Норадреналин как регулятор синтеза РНК и Na^K-АТФазы в нервных клетках // Проблемы эндокринологии. 1981. Т. 27. № 1. С. 58-62.
12. Елаев Н. Р., Андреев В. П., Шаврина Н. В. Эндогенные ингибиторы и активаторы Na^K-АТФазы // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1983. Т. 95. № 2. С. 40-42.
13. Елаев Н. Р., Рылеева Е. А., Судакова Н. М., Онегина Л. К. Регуляция уровня АХЭ микросом печени и мозга как проявление трофической функции ацетилхолина // Физиологический журнал СССР. 1983. Т. 69. № 4. С. 554-556.
14. Елаев Н. Р., Байгильдина А. А. Ингибитор Na^K-АТФазы из мембраны нервных клеток. Выделение и общие характеристики // Биохимия. 1994. Т. 59. № 3. C. 389-394.
15. Комов В. П., Батоцыренова Е. Г. Влияние гетероароматических N-оксидов на активность мембранной Na+, К+-АТФазы // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2008. № 2. С. 32-34.
16. Петруняка В. В., Панюшкина Е. А., Северина Е. П. Активация и ингибирование Na^K-АТФазы мембран эритроцитов эндогенными Са2+-зависимыми регуляторами. Са2+-зависимое действие уабаина на Са2+-АТФазу // Биологические мембраны. 1990. Т. 7. № 4. С. 352.
17. Резников А. А., Муликовская Е. П. Методы анализа природных вод. М., 1954. 135 с.
18. Abashidze S., Jariashvili T., Kometiani Z. The effect of EGTA and Ca++ in regulation of the brain Na,K-ATPase by noradrenaline // BMC Biochemistry. 2001. Vol. 2. № 8. URL: http://biomedcentral.eom/471-209/2/8
19. Adams M., H e f f r o n J. J. Na+-K+-ATPase content of fast- and slow-twitch muscle fibres // Biochem. Soc. Trans. 1981. Vol. 9. № 2. P. 220.
20. Battani F., Peterkofsky A. // Biochem. Biophis. Res. Comm. 1980. Vol. 94. № 1. P. 240.
21. D ibr o v P. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P., Verkhovskaya M. L. The sodium cycle. I. Na+-dependent motility and modes of membrane energization in the marine alkalotolerant vibrio Alginolyticus // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 850. № 3. P. 449-457.
22. Dibrov P. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P., Verkhovskaya M. L. The sodium cycle. II. Na+-coupled oxidative phosphorylation in Vibrio alginolyticus cells // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 850. № 3. P. 458-465.
23. Goodfrain T., de Poyer A., Lutete D. N. Identification with potassium and vanadate of two classes of specific ouabain binding sites in a Na+, K+-ATPase preparation from the guinea-pig heart // Biochem. Pharmacol. 1980. Vol. 29. № 8. P. 1195-1199.
24. Taga R., Okabe E. Hydroxyl radical participation in the in vitro effects of gram-negative endotoxin on cardiac sarcolemmal Na,K-ATPase activity // Jpn J. Pharmacol. 1991. Vol. 55. № 3. P. 339-349.
25. Schneider R., Wray V, Nimtz M., Lehmann W. D., Kirch U., Antolovic R. Schoner Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump // The Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273. № 2. P. 784-792.
26. To r d a C. Effect of convulsion inducing agents on the acetylcholine content and on the electrical activity of the brain // Am.
J. Physiol. 1953. Vol. 173. № 1. P.179-183.
27. X i e Z., A s k a r i A. Na+-K+-ATPase as a signal transducer // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 2434-2439.
Andreev V. P., Petrozavodsk State University (Petrozavodsk, Russian Federation) Zachinyaeva A. V., Military Medical Academy named after S. M. Kirov (St. Petersburg, Russian Federation)
ENDOGENOUS AND EXOGENOUS MODIFICATORS OF NA,K-ATPASE ACTIVITY
Preincubation of the rat brain and liver homogenates with acetylcholine (noradrenaline) leads to a decrease (increase) in Na,K-ATPase activity and to a release of dialysate of the low-molecular factor activating (desactivating) Na,K-ATPase of intact mi-crosomes. The acetylcholine (noradrenaline)-induced synthesis of activating (desactivating) factors and inhibition (activation) of Na,K-ATPase synthesis were revealed. A new low-molecular factor activating enzymes was isolated and characterized. Some N-oxides of pyridine and quinoline derivatives in concentrations ranging from 10-4 to 10-10 M inhibit Na,K-ATPase activity in cattle brain microsomes. A new Na,K-ATPase activator, 2-(2,4-dimethoxystyryl) quinoline-N-oxide), has been found, which is capable of acting at concentrations within 106-10-9 M. Since these compounds activate enzymes in very low concentrations, they can probably be effective in treatment of some disorders involving violation of the Na,K-ATPase function.
Key words: Na,K-ATPase, neurotransmitters, acetylcholine, noradrenaline, eserine, inhibitors, activators, brain, liver, heteroaromatic N-oxides
REFERENCES
1. Andreev V. P. Molekulyarnye kompleksy geteroaromaticheskikh N-oksidov i atsetilenovykh aminov s v-aktseptorami kak model’ issledovaniya nukleofil’nosti i osnovnosti soedineniy sprostranstvenno dostupnymi reaktsionnymi tsentrami: Diss. ... d-ra khim. nauk [Molecular complexes of heteroaromatic N-oxides and acetylenic amines with v-acceptors as model
16
В. П. Андреев, А. В. Зачиняева
of investigation of nucleophylicity and basicity of compounds with steric free reactive centers. Dr. chem. sci. diss.]. Petrozavodsk, 2007. 427 p.
2. Andreev V. P., Elaev N. R., Unzhakov A. R. Regulation of Na,K-ATPase biosynthesis with noradrenaline [Reguly-atsiya noradrenalinom biosinteza Na,K-ATFazy i ee nizkomolekulyarnogo ingibitora]. Neyrokhimiya. 1984. Vol. 3. № 4. P. 443.
3. Andreev V. P., Elaev N. R., Unzhakov A. R. Regulyatsiya noradrenalinom biosinteza Na,K-ATPazy i ee nizkomole-kulyarnogo ingibitora [Regulation of Na,K-ATPase biosynthesis with noradrenaline]. Departm. VINITI: 12.11.84, № 7248-84.
4. Andreev V. P., Platonov A. V. Vydelenie i kharakteristika novogo endogennogo nizkomolekulyarnogo ingibitora Na,K-ATFazy iz mozga krupnogo rogatogo skota [Isolation and characterization of new endogeneous lowmolecular inhibitor of Na,K-ATPase from the brain of cow]. Departm. VINITI; 02.04.97, № 1066-В97.
5. Andreev V. P., Korvacheva E. G., Nizhnik Ya. P. Molecular-biological problems of drug design and mechanism of drug action. Pharmaceutical Chemistry Journal. 2006. Vol. 40. № 7. P. 347-348.
6. Andreev V. P., Batotsyrenova E. G., Ryzhakov A. V.,. Rodina L. L Intramolecular charge transfer processes in a series of styryl derivatives of pyridine and quinoline N-oxides. Chemistry of Heterocyclic Compounds. 1998. Vol. 34. № 8. P. 941-949.
7. Andreev V. P., Ryzhakov A. V., Tekanova S. V. Styryl derivatives of quinoline N-oxides. Chemistry of Heterocyclic Compounds. 1995. Vol.31. № 4. P. 453-456.
8. Batotsyrenova E. G. Vliyanie endogennykh i ekzogennykh modifikatorov na aktivnost' Na,K-ATPasy: Avtoref. diss. ... kand. biol. nauk [Influence of Endogenous and exogeneous modificators on Na,K-ATPase activity. Author’s abstract, PhD. biol. sci. diss.]. St. Petersburg, 2005. 23 p.
9. Golikov S. N., Dolgo-Saburov V. B., Elaev N. R., Kuleshov V. I. Kholinergicheskaya regulyatsiya biokhi-micheskikh sistem kletki [Holinergic regulation of biochemical systems of cell]. Moscow, Meditsina Publ., 1985. 224 p.
10. Elaev N. R. About character of synaptic regulation of synthesis of protein in nervous cells [O kharaktere sinapticheskoy regulyatsii sinteza belkov v nervnykh kletkakh]. Doklady AN SSSR. 1975. Vol. 222. № 6. P. 1477-1479.
11. Elaev N. R. Noradrenaline as regulator of Na,K-ATPase synthesis in nervous cells [Noradrenalin kak regulyator sinteza RNK i Na,K-ATFazy v nervnykh kletkakh]. Problemy endokrinologii. 1981. Vol. 27. № 1. P. 58-62.
12. Elaev N. R., Andreev V. P., S h a v r i n a N. V. Endogenous acetylcholine-induced Na,K-ATPase activators and inhibitors. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 1983. Vol. 95. № 2. P. 209-212.
13. Elaev N. R., Ryleeva E. A., Sudakova N. M., Onegina L. K. Regulation of the acelylcholine nivel of microsomes of liver and brain as expression of trophic function of aceltylcholine [Regulyatsiya urovnya atsetilkholinesterazy mikrosom pecheni i mozga kak proyavlenie troficheskoy funktsii atsetilkholina]. Fiziologicheskiy zhurnal SSSR. 1983. Vol. 69. № 4. P. 554-556.
14. Elaev N. R., B ay g i l ’d i n a A. A. Inhibitor of Na,K-ATPase from membrane of nervous cells/ Isolation and general characteristics [Ingibitor Na,K-ATFazy iz membrany nervnykh kletok. Vydelenie i obshchie kharacteristiki]. Biokhimiya. 1994. Vol. 59. № 3. P. 389-394.
15. Komov V. P., Batotsyrenova E. G. Influence of heteroaromatic N-oxides on activity of membranous Na,K-ATPase [Vliyanie geteroaromaticheskikh N-oksidov na aktivnost’ membrannoy Na+, K+-ATFazy]. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii. 2008. № 2. С. 32-34.
16. Petrunyaka V. V., Panyushkina E. A., Severina E. P. Activation and inhibition of membranous Na,K-ATPase of erythrocytes with endogenous Ca2+ -dependent regulators. Ca-dependent action of ouabaine on Ca2+ATpase [Aktivatsiya i ingibirovanie Na,K-ATFazy membrane eritrotsitov endogennymi Ca2+-zavisimymi regulyatorami. Ca-zavisimoe deystvie ouabaina na Ca2+-ATFazu]. Bioligicheskie membrany. 1990. Vol. 7. № 4. P. 352-358.
17. R e z n i k o v A. A., Mu l i k o v s k ay a E. P. Metody analizaprirodnykh vod [Methods of analysis of natural waters]. Moscow, 1954.135 p.
18. Abashidze S., Jariashvili T., Kometiani Z. The effect of EGTA and Ca++ in regulation of the brain Na,K-ATPase by noradrenaline // BMC Biochemistry. 2001. Vol. 2. № 8. URL: http://biomedcentral.com/471-209/2/8)
19. Adams M., Heffron J. J. Na+-K+-ATPase content of fast- and slow-twitch muscle fibres // Biochem. Soc. Trans. 1981. Vol. 9. № 2. P. 220.
20. Battani F., PeterkofskyA. // Biochem. Biophis. Res. Comm. 1980. Vol. 94. № 1. P. 240.
21. Dibro v P. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P., Verkhovskaya M. L. The sodium cycle. I. Na+-dependent motility and modes of membrane energization in the marine alkalotolerant vibrio Alginolyticus // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 850. № 3. P. 449-457.
22. Dibrov P. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P., Verkhovskaya M. L. The sodium cycle. II. Na+-coupled oxidative phosphorylation in Vibrio alginolyticus cells // Biochim. Biophys. Acta. 1986. Vol. 850. № 3. P. 458-465.
23. Goodfrain T., de Poyer A., Lutete D. N. Identification with potassium and vanadate of two classes of specific ouabain binding sites in a Na+, K+ ATPase preparation from the guinea-pig heart // Biochem. Pharmacol. 1980. Vol. 29. № 8. P. 1195-1199.
24. T a g a R., O k a b e E. Hydroxyl radical participation in the in vitro effects of gram-negative endotoxin on cardiac sarcolemmal Na,K-ATPase activity // Jpn J. Pharmacol. 1991. Vol. 55. № 3. P. 339-349.
25. Schneider R Wray V., Ni mtz M., Lehmann W. D., Kirch U., A ntolo vic R. Schoner Bovine adrenals contain, in addition to ouabain, a second inhibitor of the sodium pump // The Journal of Biological Chemistry. 1998. Vol. 273. № 2. P. 784-792.
26. T o r d a C. Effect of convulsion inducing agents on the acetylcholine content and on the electrical activity of the brain // Am.
J. Physiol. 1953. Vol. 173. № 1. P.179-183.
27. X i e Z., A s k a r i A. Na+-K+-ATPase as a signal transducer // Eur. J. Biochem. 2002. Vol. 269. P. 2434-2439.
Поступила в редакцию 28.12.2011
