CC BY
28
УДК 581.192.2:631.81.095.337
ЭНДОГЕННОЕ ОБРАЗОВАНИЕ НИТРАТОВ В РАСТЕНИЯХ И ВЛИЯНИЕ НА ЭТОТ ПРОЦЕСС ОТДЕЛЬНЫХ СТРЕССОРОВ И СЕЛЕНА
1И.В. Верниченко, д.б.н., 1О.В. Селицкая, к.б.н., 2П.А. Яковлев, к.б.н.
1РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, e-mail: [email protected] 2Всероссийский центр карантина растений, e-mail: [email protected]
Представлены результаты лабораторных опытов в чашках Петри со стерильными проростками тритикале (X Triticosecale Wittm.) и пшеницы (Triticum aestivum L.), доказывающие наличие процесса эндогенного образования нитратов в тканях растений и влияние на этот процесс внешних условий. Обсуждается физиологическая целесообразность окисления восстановленных соединений азота до нитратной формы, в связи с незаменимой ролью нитратов в жизни растений, в частности, прямое или косвенное (через молекулу NO) влияние нитратов на стрессо-устойчивость растений. Показано возрастание эндогенного образования нитратов в стерильных проростках тритикале и пшеницы, которое изменялось при воздействии повышенной концентрации солей и некоторых других стрессоров и влияние на этот процесс ультрамикроэлемента селена. В проростках тритикале в условиях без стресса содержание нитратов через 7 дней увеличилось более чем в 8. Применение селена более чем в 3 раза повышало образование нитратов в проростках пшеницы в бесстрессовых условиях. В условиях повышенных концентраций солей хлористых аммония и натрия добавление селена снижало эндогенное образование нитратов в стерильных проростках пшеницы на 35% и в 4раза соответственно.
Ключевые слова: тритикале, пшеница, стресс-факторы, эндогенное образование нитратов, селен, меченные 15N-соединения, стерильные культуры.
ENDOGENOUS FORMATION OF NITRATES IN PLANTS AND ROLE OF SOME STESS FACTORS AND SELENIUM
Dr.Sci. I.V. Vernichenko, lPhD. O.V. Selitskaya, 2PhD. P.A. Jakovlev
1 Russian Timiryazev State Agrarian University, e-mail: [email protected] 2All-Russian Center for Plant Quarantine, e-mail: [email protected]
The results of laboratory studies with triticale (X Triticosecale Wittm.) and wheat (Triticum aestivum L.) sterile seedlings in Petri dishes proving the possibility of endogenous formation of nitrates in plant tissues and the influence of external factors on this process are shown. The physiological expediency of the reduced nitrogen compounds to nitrate forms playing an indispensable role in the plant development, in particular direct or indirect (through a nitrogen monoxide) effect of nitrate to the plant stress resistance is discussed. The increase of endogenous formation of nitrates was observed in triticale and wheat sterile seedlings changing from the effects of high concentration salt solutions and some other stress factors and the influence of selenium on this process. The increase of nitrate content was noted in triticale 7 old days sterile seedlings more than 8 times in stress free conditions. In additional the increase of nitrate content was shown in wheat sterile seedlings more than three times in stress free conditions. Our studies also showed that the decrease endogenous formation of nitrates in wheat sterile seedlings using selenium with ammonium chloride and sodium chloride respectively 35% and 4 times.
Keywords: triticale, wheat, stress factors, endogenous formation of nitrates, 15N-labeled substances, sterile crops.
Со времен классических исследований Д.Н. Прянишникова [1] показано, что значение нитратной формы азота, несмотря на то, что она служит основной и главной формой питания растения, сводится лишь к промежуточной роли как источника азота, после ее восстановления до аммиака, для синтеза основных азотсодержащих соединений. Однако совершенствование методов определения
содержания нитратов в растениях и новые подходы в изучении роли этой формы азота в питании растений позволило расширить и углубить наши представления о роли нитратов в жизни растений.
Общепризнано мнение, что единственным источником накопления нитратов в растениях служат поглощаемые ими экзогенные ионы N03", внесенные с удобрениями или образованные в результате
нитрификации азота удобрений и почвы. Необходимо отметить, что даже при полном подавлении процесса нитрификации в почве и питании растений только восстановленной формой азота, нельзя совсем исключить возможности появления и накопления в тканях растений эндогенных нитратов. Дело в том, что имеются отдельные крайне немногочисленные публикации, в которых на основании прямых или косвенных экспериментальных данных высказывается мнение о вероятности процесса окисления восстановленных соединений азота до нитратов в тканях растений [2-4].
В предшествующих исследованиях [5-7] с помощью соединений, меченных стабильным изотопом азота при изучении путей ассимиляции поглощенных растениями аммонийного и нитратного азота был показан факт образования нитратов из поглощенного меченного аммония в самих растениях. В этих опытах при некорневой подкормке растений ячменя и цветной капусты аммиачной селитрой, содержащей метку1^ только в аммонийной группе, когда исключался контакт азота удобрения с почвой, практически отсутствовала его предварительная нитрификация, заметная часть поглощенного растениями меченого аммонийного азота через сравнительно короткие экспозиции после его внесения была обнаружена в растениях в форме нитратов. Аналогичные данные были получены позже в опытах с растениями томатов и кукурузы в условиях песчаных культур с одновременным внесением с меченым аммонийным азотом и ингибиторов нитрификации [8].
Окончательное решение обозначенной проблемы азотного обмена растений немыслимо без использования в подобных исследованиях с одновременным применением меченных ^ азотных соединений и стерильных условий вегетации. Применение метода изотопной индикации в стерильных условиях является прямым возможным методическим подходом, позволяющим получить однозначный и достоверный ответ на поставленный вопрос и установить происхождение появляющихся в растениях нитратов.
В связи с этим были проведены стерильные опыты с молодыми растениями пшеницы, в которых единственным источником экзогенного азота была меченая соль (15NH4)2SO4. Растения выращивали в стеклянных колбах на кварцевом песке [9]. Проведенный изотопный анализ различных форм азота надземной части и корней пшеницы дает основание утверждать о наличии процесса окисления аммонийного азота в тканях растений до нитратов. Это явление было отмечено при всех испытанных нормах внесения аммонийного азота. Меченный аммонийный азот подкормки через 2 суток после ее проведения обнаруживался как в корнях, так
и в надземной массе пшеницы в форме 15NOз" [10, 11].
Для того чтобы окончательно освободиться от чужой (микробиологической) генетической информации необходимо применение каллюсных форм и целых растений, выращенных из апикальных меристем. Поэтому в опытах с использованием были использованы различные стерильные растения, в том числе и картофеля, полученные методом культуры тканей из апикальных меристем, а также кал-люсы картофеля. В этих опытах с соблюдением ряда модификаций по очистке нитратов и изотопной методики (за которые были получены 5 патентов), стерильность культур контролировали в течение всего периода вегетации растений, что дает основание сделать однозначный вывод о способности к окислению восстановленных форм азота до нитратов именно в тканях растений [10, 11]. Обобщая изложенное, считаем доказанным факт эндогенного окисления восстановленных соединений азота в тканях растений до нитратов [12].
Биологическая целесообразность образования нитратов в растениях может быть обусловлена несколькими причинами. Одним из объяснений обнаруженного явления, по мнению М.М. Гуковой [4], может быть процесс детоксикации повышенного содержания свободного аммония в тканях растений. Однако в наших опытах [9] данный процесс отмечался и при минимальной дозе аммонийного азота (1/5 от смеси Прянишникова), то есть в отсутствии избытка азота. Следовательно, необходимость образования нитратов в тканях растений диктуется также и другими причинами. Так, значение нитратной формы азота для питания растений не ограничивается его субстрактной ролью, то есть тем, что нитраты являются промежуточной и запасной формой азота для синтеза сложных органических соединений, а имеют свое безусловно незаменимое физиологическое значение. Объяснить физиологическую роль нитратной формы азота для растений можно следующим образом:
1 - нитратная форма азота необходима для оптимального прохождения процесса фотосинтеза [13];
2 - нитратная форма азота улучшает процессы дыхания в митохондриях растительных клеток, так как служит акцептором электронов [14, 15];
3 - значение нитратов для растений подтверждает установленный в последние годы факт, что ионыNOз" могут стать сигнальными молекулами (сигналингом) для начала синтеза и функционирования целого ряда ферментов азотного и углеводного обменов растений, в частности ферментов ан-тиоксидантной защиты от негативного воздействия на них различных стрессов [16, 17].
4 - возможно влияние нитратов на увеличение толерантности растений к различным стрессовым ситуациям может быть прямым или косвенным, че-
рез синтез другой очень важной сигнальной молекулы - окиси азота [18-22], которая во многом определяет устойчивость к стрессам как животных, так и растительных клеток [22].
Синтез молекул NO в растениях может происходить двумя путями. Во-первых, путем окисления аминокислоты аргинина под действием фермента NO-синтазы (окислительный путь). Во-вторых, образование молекул NO в растениях происходит в результате восстановления азота нитратов с участием ферментов нитрат- и нитритредуктаз (восстановительный путь) [22-24]. Под действием отдельных неблагоприятных внешних условий может возрастать потребность растений в нитратах, и, следовательно, в их эндогенном образовании, как в связи с их прямой протекторной ролью или как предшественников для синтеза молекул NO. Эндогенное образование нитратов в растениях может быть связано также с процессом детоксикации повышенных количеств образованных под действием неблагоприятных внешних условий молекул окиси азота, то есть нитраты могут являться своего рода депо для азота NO.
В связи с этим при действии неблагоприятных условий на прорастающие растения (где содержание нитратов невелико) исходного количества NOз-может не хватать для инициации различных антистрессовых ответов растительных клеток. И в этом случае вполне вероятно будет наблюдаться повышенное накопление эндогенно образованных нитратов. Использование в подобных исследованиях стерильных проростков обусловлено не только низким исходным содержанием нитратов в семенах, но и тем, что в течение первых 7 суток после прорастания в молодых растениях обычно отсутствует нитратредуктаза [25], что позволяет легче обнаружить накопление эндогенно образованных в них нитратов.
Для доказательства этого предположения были проведены стерильные лабораторные опыты в чашках Петри с проростками пшеницы [26]. Для предотвращения микробиологической деятельности проводили обеззараживание семян и стерилизацию лабораторной посуды и растворов [27].
Перед стерилизацией отбирали цельные семена, промывали водопроводной водой и удаляли те, которые всплывали на поверхность. Затем семена по очереди замачивали в 96% этиловом спирте (5 мин) и 0,05% растворе хлоргексидина (20 мин). После каждого замачивания семена промывали стерильной дистиллированной водой. Далее семена переносили на влажную фильтровальную бумагу в чашках Петри по 50 штук. В варианте с селеном фильтровальную бумагу смачивали раствором Na2SeOз. Чашки Петри закрывали и ставили в термостат при 20°С на 3 суток. Затем полученные проростки асептическим методом переносили на следующие среды для имитации стресса: контроль (дистиллированная вода); 3,8% р-р сахарозы (имитация засухи); 0,5% р-ры ШаС1, ШЩС1, Na2SO4 и Cda2 300 мкм/л. Одним из стрессовых факторов была также повышенная температура - 37°С. Экспозиция проростков в условиях стрессовых факторов - 5 суток. По истечении этого времени измеряли содержание нитратов в проростках нитратным ионселективным мембранным электродом «ЭЛИТ-021» на приборе АНИОН-4110 (рН-метр - иономер - кондуктометр) в паре с хлорсереб-ряным электродом сравнения. Экстракцию нитратов растительного материала проводили в 1% растворе алюмокалиевых квасцов.
Результаты. Проведенные исследования подтвердили наличие в проростках растений процесса эндогенного образования нитратов (табл. 1). Так, в проростах тритикале за 7 дней в оптимальных условиях содержание нитратов возросло с исходного содержания в семенах 5,0 мкг на чашку Петри до 40,0 мкг, то есть это увеличение составило более чем в 8 раз. Искусственно создаваемые стрессы на 3-й день прорастания по-разному влияли на процессы образования нитратов в молодых растениях тритикале: повышенное содержание солей ШаС1 и ШЩС1 увеличивало процессы образования нитратов путем окисления восстановленных форм азота в растениях. В тоже время имитация засухи и загрязнение Cd несколько снижали процессы эндогенного образования нитратов по сравнению с оптимальными условиями, хотя и в этих условиях содержание нитратов в большинстве случаев также было
1. Образование нитратов в проростках тритикале (7 суток) в условиях различных абиотических стрессовых факторов
Вариант Содержание N03" в пересчете на чашку Петри Количество эндогенно образованного N03" в пересчете на чашку Петри
мкг % от контроля (без стресса) мкг % от исходного содержания в семенах* % от контроля (без стресса)
Контроль (без стресса) 40,2 100 35,2 700 100
+ ШН4С1 49,8 240 44,8 900 127
+ ШаС1 69,4 220 64,4 1300 183
Засуха (3,7% сахарозы) 27,1 120 22,1 440 63
+ Cd(NOз)2 36,1 175 31,1 620 88
НСР0,95 5,3 4,6
* Исходное содержание нитратов в семенах тритикале составляло 5,0 мкг/чашку.
2. Содержание нитратов и их эндогенное образование в проростках пшеницы (7 суток)
Содержание NO3" в расче- Количество эндогенно образованного NO3" в пере-
Вариант Внесение Se те на чашку Петри счете на чашку Петри
мкг % от контроля мкг % от исходного* % от контроля
Контроль (без стрес- - 11,1 100 6,6 150 100
са) + 25,1 225 20,6 460 310
шша - 14,9 135 10,4 230 160
+ 11,5 105 7,0 155 105
+№01 - 51,9 470 47,4 1050 720
+ 16,1 145 11,6 260 175
+№2804 - 11,1 100 6,6 150 100
+ 7,1 65 2,6 50 40
Засуха (3,8% сахаро- - 4,5 40 - - -
зы) + 4,6 41 - - -
+Cd - 3,3 30 - - -
+ 3,5 32 - - -
Повышенная темпе- - 6,6 60 2,1 47 32
ратура (37о С) + 4,6 41 0,1 2 2
НСРо,95 2,3 1,6
* исходное содержание NO3- в семенах пшеницы составляло 4,5 мкг/чашку Петри.
значительно выше по сравнению с исходным их содержанием в сухих семенах.
В следующей серии стерильных опытов изучали влияние применения селена как фактора повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям внешней среды [28-31] в плане его влияния на образование нитратов в проростках пшеницы (табл. 2).
Стрессовые факторы, обусловленные повышенным содержанием в среде КЩС1 и КаС1, существенно увеличивали интенсивность этого процесса. При повышенной концентрации №2804 не было отмечено дополнительного эндогенного образования КОз- по сравнению с контролем (без создаваемого стресса), которое четко прослеживается при засолении среды хлористыми солями (табл. 2). Засуха, повышенная температура и загрязнение Cd полностью подавляли эндогенное образование нитратов проростках пшеницы. Эти неблагоприятные условия влияли на ферментные системы, участвующие в окислении восстановленных форм азота до нитратов. Хотя этот вопрос требует дальнейшего изучения.
Применение в опыте селена вызывало различное влияние на процессы эндогенного образования нитратов в зависимости от внешних условий. Так, при оптимальных условиях (контроль) селен более чем в 3 раза увеличивал данный процесс. Влияние селена на повышение процесса образования нитратов в проростках пшеницы объясняется тем, что в отсутствии искусственно создаваемых стрессов
внесение селена, несмотря на его низкие используемые в опыте концентрации, в свою очередь стало для молодых растений стрессором. Подобное влияние повышенных концентраций селена на эндогенное образование в растениях окиси азота, метаболизм которой тесно связан с нитратами, обнаружено недавно китайскими исследователями [32]. В тоже время в условиях солевого стресса при повышенном содержании хлорида аммония и, особенно, хлорида натрия применение селена значительно снижало эндогенное образование нитратной формы азота, вызванное неблагоприятными внешними условиями в связи с ослаблением их негативного влияния на растения при внесении селена, который оказывал протекторное действие. Так, при повышенном содержании в среде хлористого аммония эндогенное образование нитратов при внесении селена снизилось на 35%, а при избытке хлористого натрия, который вызывал максимальное накопление эндогенных нитратов, добавление селена снизило образование в растениях нитратного азота в 4 раза.
Таким образом, установлена и еще раз доказана положительная роль селена в повышении устойчивости растений к неблагоприятным условиям внешней среды. Однако расшифровка механизма влияния различных стрессоров на интенсивность процесса эндогенного образования в растениях нитратов и/или окиси азота, а также антистрессового действия селена на данный процесс требует дальнейшего всестороннего изучения.
Литература
1. Прянишников Д.Н. Азот в жизни растений и земледелии СССР. - М.: АН СССР, 1945. - 200 с.
2. Routchenko W, Delmas J. De la formation de nitrates dans des plantes supérieures dont l'alimentation azotee est exdu-sivement ammoniacale. Comptes Rendus // Dela academinedes sciences, 1963, 256(13). - Р. 2910-2913.
3. Yamafuji K, Osajima Y. Dehydrogenation of ammonia to nitrate by enzymes isolated from green algae // Enzymologia, 1963, 26. - Р. 75-86.
4. Гукова М.М. Нитраты в азотном обмене растений // Известия ТСХА, 1971, № 6. - С. 72-80.
5. Верниченко И.В. Усвоение растениями аммиачного и нитратного азота удобрений при различных условиях их применения (опыты с 15N): автореф. дисс. к.б.н. - М.: ТСХА, 1975. - 16 с.
6. Верниченко И.В., Верниченко Л.Ю., Муравин Э.А., Плешков Б.П. Ассимиляция растениями поглощенного аммонийного и нитратного азота аммиачной селитры (опыты с 15N) // Известия ТСХА, 1976, Вып. 5. - С. 64.
7. Верниченко И.В. Поглощение и скорость усвоения аммонийного и нитратного азота цветной капустой при корневом и некорневом внесении // Доклады ТСХА, 1982. - С. 73-80.
8. Ягодин Б.А., Верниченко И.В., Дхиллон К.С. Усвоение растениями аммонийного и нитратного азота удобрений в зависимости от обеспеченности микроэлементами // Вопросы агрохимии азота. - М.: ТСХА, 1982. - С. 3-8.
9. Ягодин Б.А., Верниченко И.В. Возможность окисления аммонийного азота в тканях растений до нитратов (опыты с 15N) // Известия АН СССР. Сер. Биологическая, 1984, №2. - С. 266-272.
10. Ягодин Б.А., Верниченко И.В., Савидов Н.А. Окисление аммонийного азота до нитратов в тканях стерильных растений картофеля // Известия ТСХА, 1991, № 4. - С. 3-11.
11. Савидов Н.А., Ягодин Б.А., Верниченко И.В. Накопление эндогенных нитратов в тканях сельскохозяйственных растений / 2-ой съезд Всесоюзного об-ва физиологов растений. Тез. докл. Ч. 2. - М, 1992. - С. 183.
12. Верниченко И.В. Эндогенное образование нитратов в растениях // Агрохимия, 2002, № 3. - С. 73-85.
13. Липс С.Г. Роль ионов неорганического азота в процессах адаптации растений // Физиология растений, 1997, Т. 44, № 4. - С. 487-498.
14. Igamberdiev A.U., Hill R.D. Plant mitochondrial function during anaerobiosis // Ann. Bot., 2009, 103. - Р. 259-268.
15. Вартапетян Б.Б., Полякова Л.И., Степанова А.О., Долгих Ю.И. Физиологическая роль нитрата в условиях анаэробного стресса у толерантных и чувствительных к аноксии клеток каллюсов Sacharum officinarum // Физиология растений. 2012, Т. 59, № 6. - С. 739-745.
16. Forde B.G. Local and long-range signaling pathways regulating plant responses to nitrate // Ann. Rev. Plant Biol., 2002, 53. - Р. 203-224.
17. Сидоренко Е.С., Харитонашвили Е.В. Нитрат-ион сигнал для роста и развития корневой системы // Агрохимия, 2011, № 7. - С. 37-43.
18. Delledonner M., Xia Y., Dixon R.A., Lamb C. Nitric oxide function as a signal in plant resistance // Nature, 1998, 394. - Р. 585-588.
19. Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. - М.: Наука, 2002. - С. 294.
20. Wendehenne D., Hancook J.T. New frontiers in nitric oxide biology in plant // Plant Science, 2011, 181. - Р. 507-508.
21. Mur L.A., Mandon J., Persijn S., Cristescu S.M., Moshkov I.E., Novikova G.V., Hall M.A., Harren F.J.M., Hebelstrup K.H., Gupta K.J. Nitric oxide in plants: an assessment of the current of knowledge // AoB Plants, 2013, 5: doi: 10.1093/aobpla/pls052
22. Мамаева А.С., Фоменков А.Х., Носов А.В., Мошков И.Е., Мур Л.А.Д., Холл М.А., Новикова Г.В. Регулятор-ная роль оксида азота у растений // Физиология растений, 2015, Т. 62, № 4. - С. 459-473.
23. Трифонова Т.В., Максютова Н.Н., Викторова Л.В., Галеева Е.И., Яфарова Г.Г., Минибаева Ф.В. Регуляция активности нитратредуктазы и ее вовлечение в образование оксида азота в листьях пшеницы // Доклады Академии Наук, 2010, Т. 435, № 6. - С. 846-849.
24. Глянько А.К. Инициация синтеза оксида азота (NO) в корнях этиолированных проростках гороха (Pi-sumsativumL.) // Биохимия, 2013, Т. 78, № 5. - С. 620-626.
25. Oaks A. Strategies of nitrogen assimilation in Zea mays: early seedling growth // Maydica, 1997, 2. - Р. 203-210.
26. Кидин В.В., Дерюгин И.П., Кобзаренко В.И. и др. Практикум по агрохимии: под ред. В.В. Кидина. - М.: КолосС, 2008. - 599 с.
27. Hasanuzzaman M., Hossain M., Fujita M. Exogenous selenium pretreatment protects rapeseed seedlings from cadmium-induced oxidative stress by up regulating antioxidant defense and methylglyoxal detoxification system // Biol. TraceEl-ementsRes., 2012, 149. - Р. 248-261.
28. Верниченко И.В., Осипова Л.В., Быковская И.А., Яковлев П.А. Влияние селена и цинка на засухоустойчивость растений сортов ячменя и их способность нормализовать азотное питание после перенесенной засухи (опыты с 15N) // Агрохимия, 2015, № 3. - С. 43-55.
29. Верниченко И.В., Яковлев П.А. Изучение протекторного действия Se, Si и Zn на устойчивость зерновых культур к почвенной засухе // Агрохимический вестник, 2014, № 4. - С. 14-17.
30. Яковлев П.А. , Верниченко И.В., Большакова Л.С. Влияние обработки семян микроэлементами на урожайность яровых зерновых культур в условиях почвенной засухи // Агрохимический вестник, 2014, № 1. - С. 25-27.
31. Яковлев П.А. Продуктивность яровых зерновых культур в условиях воздействия абиотических стрессовых факторов при обработке семян селеном, кремнием и цинком // Агрохимический вестник, 2014, № 4. - С. 38-40.
32. Chen Y., Mo H-Z., Hu L-B., Li Y-Q., Chen J. et al. The Endogenous Nitric Generation in Brassica rapa // PLoS ONE 2014, 9(10): e110901. doi:10.1371/journal.pone.0110901.
