CC BY
22
ТЕХНОЛОГИЯ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
УДК 544.6.018.2
А. А. Шадрина, Т. Г. Никифорова, Г. В. Андреева
ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ТИОХОЛИНА И Ь-ЦИСТЕИНА
В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ
Ключевые слова: тиохолин, Ь-цистеин, амперометрический анализ, холинэстераза.
Методами циклической вольтамперометрии и амперометрии изучена кинетика окисления тиохолина и Ь-цистеина в зависимости от природы электрода (стеклоуглерод; стеклоуглерод, модифицированный пленкой по-ли-3,4-этилендиокситиофена (РЕБОТ); углеродный планарный электрод и планарный модифицированный) и рН раствора. На вращающемся дисковом электроде, модифицированном полимером РЕБОТ, проведена серия измерений амперометрических откликов на введение в систему тиолов. Определены коэффициенты диффузии тиохолина (4,0±0,3*10'6 см2/с) и цистеина (8,0±0,3*10~6 см2/с). Результаты соответствуют имеющимися в литературе представлениям о двухэлектронном ступенчатом окислении тиохолина и четырехэлектронном цистеина.
Keywords: thiocholine, L-cysteine, amperometric analysis, Cholinesterase.
The work contains the results of studying of L-cysteine and thiocholine oxidating processes on the electrodes of different nature (glassy carbon; glassy carbon modified with film of poly 3,4-ethylenedioxythiophene (PEDOT); screen-printed carbon electrode and screen-printed modified) which have been obtained with using such methods as cyclic voltammetry and amperometry. Amperometric measurements have been carried out on a rotating disk electrode modified with PEDOT, which allowed us to calculate diffusion coefficients of thiocholine (4,0 ± 0,3 x 10'6 cm2/s) and cysteine (8,0 ± 0,3 x 10'6 cm2/s). The obtained results are in agreement with published views of two-electron thiocholine oxidation and four-electron cysteine one. It has been established that amperometric measurements are available for thiols determinations, while cyclic ones can be used only in case of high thiols concentrations.
Введение
В последние годы уделяется большое внимание разработке экспресс-методик определения вредных веществ и токсинов. Мониторинг различных поллютантов становится все более важным, поскольку в современных условиях негативные последствия влияния человеческой деятельности на окружающую среду возрастают. Фосфорорганиче-ские (ФОС) соединения и карбаматы наряду с синтетическими пиретроидами являются наиболее часто используемыми пестицидами в сельском хозяйстве [1,2]. ФОС также используются в медицине и промышленности [3]. Хотя эти вещества подвергаются гидролизу во внешней среде, но в ряде случаев образуются весьма опасные вещества, обладающие высокой нейротоксичностью [4,5]. Некоторые циа-нобактерии также производят нейротоксины, которые высвобождаются в окружающую среду после лизиса клеток [6]. Действие таких нейротоксинов основано на необратимом ингибировании ими ферментов семейства холинэстераз (ацетил- (АХЭ) и бутирил-холинэстеразы (БХЭ)) [7].
Существует большое количество методов обнаружения нейротоксинов, включая хромато-масс-спектрометрию [8], различные фотометрические и рН-метрические методы [9,10]. В качестве дополнительных инструментов для предварительного скрининга токсичных веществ и оценки экологических рисков довольно распространены различные электрохимические сенсоры и биосенсоры [11], действие которых основано на определении активности
(или степени ингибирования) ферментов семейства эстераз. В литературе приведено значительное количество исследований по разработке различных электрохимических элементов, модифицированных такими медиаторами, как берлинская лазурь [12], диоксид марганца [13], и т.д. Некоторые из этих устройств регистрируют анодный ток окисления пероксида водорода, который образуется в результате ферментативных реакций [12, 13]:
БХЭ
(СНз)зМ+СН2СН2<ЭСОР + Н2О ^ РСООН + (СНз)зМ+СН2СН2<ЭН (1)
Холиноксидаза (СНз)зМ+СН2СН2ОН + Н2О + 2О2 ^ 2Н2О2 + (СНз)зЫСН2СОО (2)
Н2О2 ^ О2 + 2е- + 2Н+ (з)
Указанный метод включает в себя использование двух ферментов (бутирилхолинэстеразу и холиноксидазу), и поэтому не совсем удобен. Более доступным способом мониторинга ингибиторов ферментов является измерение токов окисления тиохолина [14,15]. Данное соединение образуется в результате гидролиза тиохолиновых эфиров (синтетических аналогов холиновых эфиров) в присутствии холинэстераз, и каталитическая активность последних может быть установлена с помощью определения содержания тиохолина в тестируемых растворах. Основные реакции для такого способа обнаружения ингибиторов эстераз [16,17], следующие:
БХЭ
(CH3)3N+CH2CH2SCOR + H2O ^ RCOOH + (CH3)3N+CH2CH2SH (4)
2 (CH3)3N+CH2CH2SH ^ 2 e- + 2 H+ + (CH3)3N+CH2CH2S-SCH2CH2N+(CH3)3 (5)
Схема механизма окисления тиохолина может быть описана следующим образом [18]. Тиолы рассматриваются как слабые кислоты (рКа тиохолина 7,7 [19]; рКа L-цистеина для SH группы 8,14 [20]):
RSH ^ RS- + H+ (6)
В результате электроокисления частиц RS- образуются радикалы RS^:
RS- ^ RS^ + e- (7)
которые способны атаковать сульфгидрильную группу другой (возможно, адсорбированной) молекулы тиола с образованием димеров вида RSSR (7, 8):
RS^ + RSH ^ R-S-S-R + H+ + e- (8)
Таким образом, электрохимические измерения могут успешно использоваться для анализа ферментативной активности эстераз (в том числе с помощью определения тока окисления тиохолина), а также остаточной активности в присутствии нейротокси-нов. Как уже отмечалось, для разработки электрохимических сенсоров широко применяются проводящие полимеры и композиты на их основе. В литературе имеются многочисленные примеры использования полимеров в датчиках и сенсорах для селективного обнаружения глюкозы, лактатов, холестерина, фенола, ФОС [21-24]. Для коммерческих приложений поли-3,4-этилендиокситиофен (PEDOT) стал одним из наиболее успешно использующихся проводящих полимеров, благодаря своей прекрасной проводимости и высокой стабильности [25,26]. Авторы работы [27] описывают определение тиохо-лина с помощью электродов, модифицированных пленками PEDOT:PSS. В настоящей работе будут рассмотрены некоторые вопросы, связанные с таким использованием пленок PEDOT, с более подробным изучением процессов окисления тиолов на электродах различной природы: стеклоуглерод (GC),
стеклоуглерод, модифицированный пленкой PEDOT (GC/PEDOT),
планарный углеродный электрод, выполненный методом трафаретной печати screen-printed (SP), screen-printed/PEDOT (SP/PEDOT).
Экспериментальная часть
Реактивы и оборудование
Бутирилхолинэстераза (БХЭ) из сыворотки крови лошади (EC 3.1.1.8), активность 264 АЕ/мг; пропионилтиохолин хлорид, (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) (Hepes), L-цистеин, 5,5'-дитиобис (2-нитробензойная кислота) (DTNB) Sigma (США); 3,4-этилендиокситиофен
(EDOT) 97% Aldrich; бычий сывороточный альбумин (БСА) Serva (США); все другие реагенты марки не ниже чда и использовались без предварительной очистки. Все водные растворы готовились с использованием бидистиллированной деионизованной воды. Поскольку тиохолин не является коммерчески доступным реагентом, тиохолин получали ферментативным гидролизом 21,2мг пропионилтиохолин хлорида в 1мл 0,04M БХЭ в фосфатном буферном растворе (pH 7,0) или в буферном растворе HEPES (pH 7,5). По прошествии 24 часов концентрацию тиохолина определяли традиционным методом Эллмана [28].
Пленки поли-3,4-этилендиокситиофена осаждались на стеклоуглеродной подложке (GC) (площадь 0,07 см ) при гальваностатических условиях (j = 0,6 мА/см2) с одновременной регистрацией потенциала электрода (обычно 1,02-0,92 В) из растворов, содержащих 0,05М мономера и 0,5М перхлората лития LÍCIO4 в ацетонитриле. Измеренные потенциалы даны относительно хлорид серебряного электрода (Ag/AgCI) в насыщенном растворе хлорида калия. Вольтамперометрические и амперометри-ческие измерения проводились на электрохимическом комплексе AUTOLAB PGSTAT 30 (Eco Chemie, Нидерланды). Отдельные электрохимические измерения проводились в атмосфере аргона, но отличий от результатов, полученных в измерительной ячейке с доступом воздуха, не наблюдалось. Часть измерений были выполнены на вращающемся дисковом электроде GC при скоростях вращения от 300 до 3050 оборотов в минуту.
Результаты и обсуждение
Циклическая вольтамперометрия
В данной работе процессы электроокисления тиохолина и L-цистеина (также содержащего сульфгидрильную группу) были исследованы методом циклической вольтамперометрии в диапазоне потенциалов от -0,1 в 0,7В на электродах GC и GC, модифицированных пленками PEDOT (GC/PEDOT), при скоростях развертки 0,005-0,02В/с в фосфатном буферном растворе с рН = 6,86. Типичные результаты таких измерений на электроде GC/PEDOT представлены на рис. 1 для тиохолина и L-цистеина в концентрации 4мМ и при скорости развертки и = 0,005В/с. Как видно из врезки к рис.1, разностные токи окисления тиохолина имеют нечетко выраженный максимум большой протяженности. На циклических вольтамперометраммах (ЦВА), снятых в растворах L-цистеина, отчетливый максимум появляется при Е—+0,45В. Аналогичные результаты получены на GC электродах с той разницей, что в случае L-цистеина наблюдаются две площадки (Е1—+0,46В, Е2^0,66В). Что касается SP-электродов, на ЦВА максимумов не наблюдается в указанном диапазоне электродных потенциалов для растворов обоих тио-лов. В случае SP/PEDOT электродов циклические кривые, полученные в таких растворах, близки к полученным на GC/PEDOT электродах.
-0,2
E, B
0,0 0,2 0,4 0,6
Рис. 1 - ЦВА, полученные на GC/PEDOT электроде в 4мМ растворах тиохолина и L-цистеина в фосфатном буфере рН 6,86 при скорости развертки потенциала и = 0,005В/с. Врезка к рис. 1- Разностные вольтамперограм-мы, полученные вычитанием фонового анодного тока (фосфатный буфер рН 6,86) из анодного тока вольтамперограмм, снятых в 4мМ растворах тиохолина и L-цистеина на GC/PEDOT электроде
Таким образом, кинетика изучаемых процессов несколько зависит от природы подложки. Возможно, последовательность стадий, протекающих при электроокислении тиолов, включает адсорбцию начальных или промежуточных продуктов на поверхности электрода. С другой стороны, указанные выше анодные токовые максимумы могут возникнуть в результате диффузии реагирующих частиц исследуемых растворов в соответствии с известными представлениями о диффузионно-контролируемых электродных процессах [29]. В рамках этих представлений наблюдаемые величины пиковых токов (Ip) должны быть пропорциональны концентрации исследуемых частиц (C0). В предельных случаях полностью обратимых или полностью необратимых электродных процессов, которые не включают предшествующие химические реакции, эти токи должны также быть пропорциональны квадратному корню из скорости развертки электродного потенциала (и):
Ip = Ku1/2CQ,
где K - некоторая константа, которая принимает различные значения в указанных предельных случаях [29].
Требуемая пропорциональность пиковых токов концентрации тиола (C0) наблюдается для обоих процессов, по крайней мере, в случае электродов, модифицированных пленкой PEDOT (см. рис. 2). Что касается зависимости пиковых токов Ip от скорости развертки и, то дробный показатель в уравнении (1) был около 0,3, а не 0,5, как требуется теорией. В обоих случаях электроокисления тиолов наблюдались смещения потенциалов пиков Ер в сторону более положительных значений при увеличении скорости развертки и, т.е. эффект, который также следует из приведенных выше теоретических представлений. К сожалению, не удалось более тщательно изучить эту зависимость в широкой области скоростей развертки, так как пики тока экранирова-
лись фоновыми токами при и> 0,02В/с, а ширина таких пиков существенно увеличивалась. На наш взгляд, такие помехи и снижение показателя степени в уравнении (1) являются результатом многостадийного характера исследуемых процессов, которые, скорее всего, включают предшествующие химические реакции и/или стадию адсорбции, как упоминалось выше.
I , мкА/см
p'
600 450
GC/PEDOT тиохолин GC/PEDOT L-цистеин., GC тиохолин GC L-цистеин
300
150
С, мМ
Рис. 2 - Пропорциональность величины тока пика концентрации тиолов. Условия измерения: скорость развертки потенциала 0,01В/с
Исходя из приведенного механизма (реакции 6-8), можно сделать вывод, что форма циклической кривой должна зависеть от рН раствора, что подтверждается экспериментальными данными (рис. 3), по крайней мере, в случае тиохолина: кривые смещаются в отрицательную область с увеличением рН. В случае цистеина эти эффекты выражены слабее. Качественно результаты повторяются на всех электродах, что согласуется с литературными данными [15,18].
pH 6,0
pH 6,86 pH 8,0
j, мкА/см
100
80-
60-
40-
✓
20- .—
0-
0,0
0,2
0,4
0,6
E, B
Рис. 3 - Разностные вольтамперограммы, полученные вычитанием фонового анодного тока (фосфатный буфер) из анодного тока вольтамперограмм, снятых на электродах «егееп-printed/PEDOT в 4мМ растворах тиохолина при разных значениях рН раствора (6,0, 6,86 8,0) при скорости развертки потенциала и = 0,01В/с
Указанные трудности заставили нас перейти к другому способу обнаружения тиолов, а именно амперометрическим измерениям при фиксированных значениях потенциала. Этот переход является также результатом очевидной невозможности достоверно обнаружить тиолы при их содержании менее 0,5мМ с помощью циклической вольтамперо-метрии. В этих условиях емкостные токи используемых РЕБОТ-модифицированных электродов со-
0
поставимы с токами электроокисления тиолов. В случае же амперометрических измерений при постоянном потенциале емкостные токи несущественные, что и определило выбор таких условий.
Амперометрические измерения
Амперометрические измерения на РББОТ-модифицированных электродах проводились в фосфатном буферном растворе рН = 6,86 с различными концентрациями тиохолина (от 1,5*10_5М до 2*10~4М) и Ь-цистеина (от 1*10~6М до 3*10~5М) при потенциале рабочего электрода +0,45В отн. Ад/АдС1 (см. рис. 4) в случае тиохолина и при +0,5В в случае Ь-цистеина. Исследования проводились на вращающемся дисковом электроде при скоростях вращения от 300 до 2000 об/мин. Амперометрические измерения возможно использовать исключительно для определения низких концентраций тиолов, поскольку линейное возрастание откликов наблюдалось только до концентрации 0,1мМ для тиохолина и 0,15мМ для Ь-цистеина.
ности, суммарное уравнение, предложенное в этой работе [32], следующее:
RSH + 2H2O ^ RSO2H + 4H+ +4e-
(9)
МКА/СМ 0,20
120
9060300
1/j, см /мкА
15 мкМ
2000 об/мин 1000 об/мин 500 об/мин
C, мкМ
Рис. 4 - Зависимость электрохимических откликов на введение в систему тиохолина, полученная на вращающемся дисковом ОС/РЕБОТ электроде в фосфатном буфере рН=6,86 при потенциале +0,45В. Врезка к рис. 4 - График зависимостей Левича-Коутецкого, полученных из амперометрических измерений для тиохолина
Поскольку в случае тиохолина схема реакций (6-8) включает предшествующую реакцию диссоциации (что подтверждается зависимостью от рН), то следует использовать представления Левича-Коутецкого [30], а именно: проводить обработку результатов измерений в координатах 1/ от 1/ш (см. врезку к рис. 4).
Из зависимостей 1/] от 1/ш1/2 (см. врезку к рис. 4) были рассчитаны наклоны для каждой концентрации тиохолина и цистеина. Из уравнения Ле-вича-Коутецкого были определены коэффициенты диффузии 4,0±0,3*10~6 см2/с для тиохолина и 2,2±0,2*10~5 см2/с для цистеина для двухэлектрон-ного окисления. Значения согласуются с приведенными в литературе [15,31]. Полученный коэффициент диффузии тиохолина вполне реален для органических молекул. Значения коэффициента для цис-теина, в том числе приведенные в литературе, слишком велики, поэтому, скорее всего, имеет место четырехэлектронный механизм окисления. В част-
Рассчитанный для четырехэлектронного окисления коэффициент диффузии цистеина составил 8,0±0,3*10 см2/с.
Выводы
Используя методы ЦВА и амперометрии, на электродах GC, GC/PEDOT, screen-printed, screen-printed/PEDOT были проведены исследования кинетики электроокисления тиохолина и цистеина в зависимости от природы электрода и рН раствора (рН 6,0; 6,86 и 8,0). На вращающемся дисковом электроде GC/PEDOT проведена серия измерений амперо-метрических откликов на введение в систему тиохолина и цистеина. Определены коэффициенты диффузии тиохолина (4,0±0,3*10- см/с) и цистеина (8,0±0,3*10-6 см2/с), которые согласуются с литературными данными. Полученные результаты соответствуют имеющимся в литературе представлениями о двухэлектронном ступенчатом окислении тиохолина и четырехэлектронном для цистеина. Предложены способы определения концентрации тиолов: для относительно высоких концентраций -ЦВА, для низких концентраций - амперометрия.
Литература
1. Y. D. T. de Albuquerque, L. F. Ferreira, Analytica Chimica Acta, 596, 2, 210-221 (2007);
2. M. Ovalle, M. Stoytcheva, R. Zlatev, B. Valdez, Electrochimica Acta, 55, 2, 516-520 (2009);
3. Shan Fu, Hang-Xin Cheng, Ying-Han Liu, Xiao-Bai Xu, Chemosphere, 75, 5, 588-594 (2009);
4. V. P. Androutsopoulos, A. F. Hernandez, J. Liesivuori, A. M. Tsatsakis, Toxicology, 307, 89- 94 (2013);
5. Ch. A. Vidair, Toxicology and Applied Pharmacology, 196, 2, 287-302 (2004);
6. J. Patocka, R. C. Gupta, K. Kuca, Mil. Med. Sci. Lett. (Voj. Zdrav. Listy), 80, 129-139 (2011);
7. R. C. Gupta, Toxicology of Organophosphate & Carbamate Compounds. Elsevier Inc., 2006, 768 p.
8. M. Koitka, J. H^hel, D. Obst, A. Rottmann, H. Gieschen,
H. Borchert, Analytical Biochemistry, 381, 1, 113-122 (2008);
9. H. J. Harmon, Biosensors & Bioelectronics, 16, 12, 10351041 (2001);
10. N. Tekaya, O. Saiapina, H. B. Ouada, F. Lagarde, H. B. Ouada, N. Jaffrezic-Renault, Environmental Pollution, 178, 182-188 (2013);
11. S. Andreescu, J. L. Marty, Biomolecular Engineering, 23,
I, 1-15 (2006);
12. H. Tavakolia, H. Ghourchian J. Iran. Chem. Soc., 7, 2, 322-332 (2010);
13. E.A. Dontsova, Y.S. Zeifman, I.A. Budashov, A.V. Eremenko, S.L. Kalnov, I.N. Kurochkin, Sensors and Actuators B, 159, 1, 261- 270 (2011);
14. Х. Май Тхи Тхань, Э. П. Медянцева, Р. М. Варламова, Г. Р. Сахапова, О. В. Николаева. Вестник Казанского технологического университета, 15, 15, 149-153 (2012);
15. L. Rotariu, L.G. Zamfir, Camelia Bala, Sensors and Actuators B, 150, 1, 73-79 (2010);
16. A. Giinther, U. Bilitewski, Analytica Chimica Acta, 300, 1-3, 117-125 (1995);
17. D. Du, J. Ding, Y. Tao, X. Chen, Sensors and Actuators B, 134, 2, 908-912 (2008);
18. F. C.M. de Oliveira, S. H.P. Serrano, Electrochimica Acta, 125, 566-572 (2014);
19. L. F. Sgobbi, C. A. Razzino, I. G. Rosset, A. C.B. Burtoloso, S. A.S. Machado, Electrochimica Acta, 112, 1 500-504 (2013);
20. J. Kulys, A. Drungiliene, Analytica Chimica Acta, 243, 1, 287-292 (1991);
21. P. J. Lamas-Ardisana, O. A. Loaiza, Biosensors and Bioe-lectronics, 56, 1, 345-351 (2014);
22. A. Aghaei, M. Reza M. Hosseini, M. Najafi, Electrochimica Acta, 55, 5, 1503-1508 (2010);
23. T.A. Sergeyeva, O.A. Slinchenko, L.A. Gorbach, V.F. Matyushov, O.O. Brovko, S.A. Piletsky, L.M. Sergeeva, G.V. Elska, Analytica Chimica Acta, 659, 1-2, 274-279 (2010);
24. R. R. Dutta, P. Puzari, Biosensors and Bioelectronics, 52, 1, 166-172 (2014);
25. L. Lu, O. Zhang, J. Xu, Y. Wen, X. Duan, H. Yu, L. Wu, T. Nie, Sensors and Actuators B, 181, 1, 567- 574(2013);
26. Y. Chang, K. Lee, R Kiebooms, A Aleshin, A.J Heeger, Synthetic Metals, 105, 3, 203-206 (1999);
27. G. Istamboulie, T. Sikora, E. Jubete, E. Ochoteco, Talanta, 82, 3, 957-961 (2010);
28. G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andres, R.M. Feather-stone, Biochem. Pharmacol., 7, 2, 88-95 (1961);
29. Z. Galus, Fundamentals of Electrochemical Analysis. Ellis Horwood, New York, 1976, p. 313.
30. В.Г. Левич, Физико-химическая гидродинамика. ГИФМЛ, Москва, 1959. 700 с.
31. N. Sattarahmady, H. Heli, Analytical Biochemistry, 409, 1, 74-80 (2011);
32. A. Abbaspour, A. Ghaffarinejad, Electrochimica Acta, 53, 23, 6643-6650 (2008).
© А. А. Шадрина - инженер-исследователь каф. электрохимии института химии СПбГУ, Shadrina5@yandex.ru; Т. Г. Никифорова - доцент каф. электрохимии института химии СПбГУ, tn1329@mail.ru; Г. В. Андреева - аспирант инженерного химико-технологического института КНИТУ, galiya1105@mail.ru.
© A. A. Shadrina - research engineer, Department of Electrochemistry, Institute of Chemistry, St. Petersburg State University, Shadrina5@yandex.ru; T. G. Nikiforova - associate professor, Department of Electrochemistry, Institute of Chemistry, St. Petersburg State University, tn1329@mail.ru; G. V. Andreeva - post graduate student of Institute of Chemical Engineering and Technology, Kazan National Research Technological University, galiya1105@mail.ru.
