CC BY
22
УДК 543.545:547.458
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА КВАРЦЕВЫХ КАПИЛЛЯРАХ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫМИ ЦИТРАТОМ НАТРИЯ, 6,10-ИОНЕНОМ И СУЛЬФОПОЛИСАХАРИДАМИ А.Н. Михалюк, Е.Н. Шаповалова, А.Г. Мажуга, О.А. Шпигун, П. Г. Рудаковская
(кафедра аналитической химии, кафедра органической химии; e-mail: freund-for-me@mail.ru)
Наночастицы золота за последние 10 лет активно применяют в разных областях науки, в том числе в физико-химических методах разделения и определения. Получены и исследованы два кварцевых капилляра для капиллярного электрофореза (КЭ), послойно модифицированные 6,10-ионеном, наночастицами золота, стабилизированными цитратом натрия, К-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозаном (СКПХ) и сульфатом декстрана (СД) соответственно. Установлено, что разделение смеси тетрагидрозолина, пиндолола, тербутали-на, надолола и гидроксизина КЭ проходит более эффективно и экспрессно при нанесении наночастиц золота по сравнению с капиллярами, модифицированными только полимерами и полисахаридом. Наиболее удачная система получена с применением СД в качестве полисахарида. При использовании СД разделены энантиомеры тетрагидрозолина.
Ключевые слова: капиллярный электрофорез, сульфат декстрана, К-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан, Р-блокаторы.
Первые упоминания в литературе об использовании наночастиц золота в капиллярном электрофорезе (КЭ) появились в 2001 г В работе [1] использовали кварцевые капилляры, покрытые наночастицами золота, модифицированными органическими соединениями. Наночастицы золота, адсорбированные на полимерах, активно используют в медицине для разделения методом капиллярного электрофореза фрагментов ДНК, протеинов, нейротрансмиттеров [2]. Исследовано влияние наночастиц золота, стабилизированных цитратом или меркаптопропионатом, на скорость электроосмотического потока и селективность разделения структурных изомеров ароматических кислот, оснований и ароматических аминов соответственно [3]. В обоих случаях наблюдали повышение воспроизводимости результатов анализа и эффективности капилляров. Описан пример послойно модифицированных капилляров [4]. Использованы наночастицы, модифицированные 4-диметилами-нопиридином (ДМАП) (заряженные положительно) и наночастицы золота, модифицированные цитратом натрия (заряженные отрицательно). Перед нанесением наночастиц кварцевые капилляры модифицировали слоями поли(диаллилдиметил)хлорида аммония
(ПАДМА), поли(4-стирен)сульфоната натрия (ПСС). Свойства капилляров сопоставили на примере разделения смеси тиомочевины, нафталина и бифенила. Капилляры оказались очень стабильными - на них получали воспроизводимые результаты в течение 20 дней (проведено 400 анализов). Таким образом, модифицирование капилляров наночастицами золота, особенно в присутствии солей четвертичных аммониевых оснований, позволяет существенно повысить воспроизводимость результатов разделения и экспрессность анализа в КЭ. Для энантиоразделения зопиклона, тропикамида и хлорфенирамина использован капилляр, модифцированный наночастицами золота, функционализированными циклодекстри-ном [5]. При нанесении одного такого слоя наноча-стиц на кварцевую поверхность удалось разделить энантиомеры каждого из лекарственных препаратов за 8-10 мин. Ранее показано, что эффективными хиральными селекторами являются (Н-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозан (СКПХ) и сульфат декстрана (СД) [6-8].
Цель данной работы - исследование в КЭ капилляров с полислойными покрытиями, содержащими ио-нены и наночастицы золота, стабилизированные ци-
тратом и сульфополисахаридами СКПХ и СД, а также изучение возможности их использования для разделения тетрагидрозолина, пиндолола, тербуталина, на-долола, гидроксизина и их энантиомеров (рис. 1).
Экспериментальная часть Реагенты и аппаратура
Исходные растворы (100 мкг/мл) пиндолола, ате-нолола, надолола, тетрагирдрозалина и тербуталина («Sigma-Aldrich», США) готовили растворением точной навески в деионированной воде. Для приготовления буферных растворов использовали соли цитрата натрия, дигидрофосфата калия, гидрофосфата калия тригидрата, гидроксид натрия квалификации «ч.д.а.» («РеаХим», Россия). Все растворы готовили в деионированной воде. рН водных растворов контролировали на универсальном иономере «ЭВ-74». Подготовку растворов проводили в УЗ-бане «Сапфир» (НПФ «Сапфир», Москва). Все растворы хранили при температуре +4°С.
Перед использованием буферный раствор фильтровали через насадку с ФЭ на шприц «МШехФвУ», мембрана «Бигароге®РУБР» («МППроге», Франция), размер пор 0,22 мкм.
Для модифицирования капилляров использовали 6,10-ионен, синтезированный на кафедре аналитической химии химического факультета МГУ. По данным элементного анализа содержание азота в этом соединении составило 6,67%, углерода - 46,26%, водорода - 8,54%. Кроме того, использовали СКПХ (молекулярная масса 5 кДа), предоставленный докт. хим.
наук В.П. Варламовым, сульфат декстрана («Sigma-Aldrich», США), наночастицы золота, стабилизированные цитратом натрия (размер частиц 10 нм), синтезированные в лаборатории биологически активных соединений кафедры органической химии МГУ.
Работу проводили с помощью системы «Капель-105М» («Люмэкс», Россия) с УФ-детектором (длина волны 235 и 270 нм). Использовали кварцевый капилляр 38,7/29,3 см (d = 50 мкм) («Polymicro Technologies», США). Образцы вводили гидродинамически (10 мбар, 30 с). Приложенное напряжение составляло 15 кВ. Для обработки информации использовали программу «Elforan». Рассчитывали время миграции, эффективность капилляра, разрешение пиков, селективность разделения, эффективную элек-трофоретическую подвижность.
Методика
Модифицирование капилляра проводили послойно следующим образом. Капилляр промывали 10 мин деионированной водой, 10 мин 1 М раствором KOH. После этого капилляр снова промывали 10 мин деи-онированной водой, затем 20 мин раствором 6,10-ио-нена (2 мг/мл) под давлением 1000 мбар. После этого (и после любой последующей стадии модифицирования) концы капилляра погружали в воду и оставляли на ночь. Затем капилляр промывали раствором наночастиц золота в течение 20 мин под давлением 1000 мбар и оставляли на ночь. На следующий день капилляр промывали водой 10 мин. Слои СКПХ или СД наносили в течение 40 мин, используя растворы с концентрацией 1 мг/мл.
Рис. 1. Структурные формулы исследуемых соединений
Новый капилляр перед работой промывали водой (10 мин), фоновым электролитом (15-30 мин). Каждые 4-5 анализов ФЭ обновляли. Между анализами капилляр промывали по 2 мин дистиллированной водой и раствором ФЭ. В качестве ФЭ мы использовали цитратный буферный раствор с рН 6,5 концентрации 25 мМ. В качестве маркера электроосмотического потока (ЭОП) использовали воду и метилэтилкетон.
Таким образом, было изготовлено два капилляра: кварцевый капилляр, модифицированный 6,10-ио-неном, наночастицами золота и К-(3-сульфо-3-карбокси)пропионилхитозаном (Капилляр-1), и кварцевый капилляр, модифицированный 6,10-ионеном, наночастицами золота и сульфатом декстрана (Ка-пилляр-2).
Свойства полученных капилляров после нанесения очередного слоя модификатора исследовали, наблюдая за направлением и величиной электроосмотического потока (ЭОП). У кварцевого капилляра ЭОП направлен от анода к катоду (положительная полярность). После нанесения 6,10-ионена пик маркера ЭОП (метилэтилкетон) фиксировали при отрицательной полярности. Это согласуется с предполагаемой сменой заряда поверхности с отрицательного на положительный. Однако воспроизводимость миграции маркера ЭОП была невысокой = 0,09), а ее величи-
Г —5 2
на достаточно низкой (цэоп = 8,77x10 см /(Вхс)). После нанесения наночастиц золота пик маркера ЭОП снова фиксировали при положительной полярности С?фоп) = 0,06, Цэоп = 1,24х10"4 см2/(Вхс)), это указывает на отрицательный заряд данных наночастиц. После нанесения полисахаридов пик маркера ЭОП также фиксировали при положительной полярности.
Величина миграции ЭОП на капилляре с СКПХ (Капилляр-1) и СД (Капилляр-2) повысилась и составила 2,03х10—4 и 2,16х104 см2/(Вхс). Из всех предыдущих систем последние две оказались самыми стабильными (^ = 0,04 и ^ = 0,03).
Результаты и их обсуждение
При разделении исследованных веществ на Капил-ляре-1 время миграции увеличивается в ряду тетраги-дрозолин < пиндолол < атенолол < надолол < тербу-талин < гидроксизин. Скорость миграции соединений определяется величиной положительного заряда на азоте, а также размером частиц и структурой разделяемых веществ. Чем больше заряд и меньше размер частицы, тем больше подвижность вещества и меньше время миграции. Определенный вклад в подвижность частиц может вносить также взаимодействие веществ с модификатором (СКПХ) на стенках капилляра. Все соединения, кроме атенолола и надолола, удалось разделить за 6 мин, эффективность капилляра достигала 65650 ТТ (рис. 2, а, таблица).
Содержание СКПХ в ФЭ варьировали от 0 до 1,08%. Установлено, что с ростом содержания СКПХ время миграции тестовых соединений снижается, а эффективность и разрешение пиков увеличиваются. В случае максимального содержания СКПХ получены наиболее узкие и симметричные пики для тербу-талина, тетрагидрозолина и пиндолола.
При использовании Капилляра-2, модифицированного СД, время миграции исследуемых соединений стало меньше. Порядок выхода соединений остался прежним, за исключением тербуталина, его время миграции стало меньше, чем у надолола. Смесь пяти
Рис. 2. Электрофореграмма смеси 1-тетрагидрозолина, 2-пиндолола, 3-тербуталина, 4-надолола, 5-ги-дроксизина: а — Капилляр-1 (концентрация компонентов 25 мкг/мл); б — Капилляр-2 (концентрация компонентов 20 мкг/мл); ФЭ — 25 мМ цитратный буферный раствор (рН 6,5), и = 15 кВ, X = 235 нм
Сопоставление свойств модифицированных капилляров*
Капилляр Соединение 1 , мин N ТТ 8/8 ** кв а Я (п,п + 1)
Капилляр-1 Тетрагидрозолин 3,63 65700 1,10 1,17 2,8
Пиндолол 4,17 31300 1,49 1,05 1,1
Тербуталин 4,42 47900 0,22 1,16 1,7
Гидроксизин 5,11 2100 1,51 - -
Атенолол 4,23 61700 0,82 - -
Надолол 4,35 43800 0,36 - -
Капилляр-2 Тетрагидрозолин 3,09 297200 1,88 1,13 5,9
Пиндолол 3,47 198100 4,89 1,03 3,1
Тербуталин 3,64 220800 1,48 1,03 0,7
Надолол 3,71 140200 2,33 1,05 0,7
Гидроксизин 3,86 132000 1,76 - -
Атенолол 3,60 60900 1,68 - -
*Условия см. в подписи к рис. 2.
"Отношение площади пика соединения на электрофореграмме на модифицированном капилляре к площади пика на кварцевом капилляре.
соединений разделили за 4 мин (рис. 2, б, таблица), эффективность Капилляра-2 (до 297220 ТТ) выше, чем Капилляра-1 при сопоставимой селективности. Влияние концентрации СД в ФЭ (0,00-1,08%) на разделение исследованных соединений аналогично влиянию СКПХ. Следует отметить, что при содержании 1,08% СД в ФЭ получена максимальная эффективность, например, по тетрагидрозолину она достигает 438030 ТТ.
Меньшее по величине время миграции соединений на капилляре, модифицированном СД обусловлено, вероятно, большим отрицательным зарядом поверхности капилляра, что ускоряет ЭОП. В молекуле СД больше сульфогрупп, и они менее экранированы, чем в СКПХ. Таким образом, на Капилляре-2 можно разделить модельные соединения за меньшее время и с большим разрешением (таблица). Важно отметить, что высота и площадь пиков определяемых соединений на электрофореграмме, полученной для Капилляра-2, существенно выше, чем для кварцевого капилляра и капилляра-1(таблица), что повышает чувствительность их определения.
Предварительно в лаборатории исследованы модифицированные капилляры, покрытые 6,10-ио-
неном и полисахаридами без наночастиц золота. Воспроизводимость миграции маркера ЭОП в модифицированных золотом капиллярах выше, чем в случае их аналогов без наночастиц (для капилляров без наночастиц золота с СКПХ и СД р = 1,24*10-4 и 2,00*10-4 см2/(В*с) соответственно с = 0,18 и 0,05). На данных капиллярах разделение смеси требует меньше времени. Капилляр-2 значительно превосходит по эффективности свой аналог (до 197970 ТТ в цитратном буферном растворе). Таким образом, Капилляр-2 можно рекомендовать к применению в КЭ для быстрого и эффективного разделения бета-блокаторов и других азотсодержащих соединений.
К сожалению, при использовании Капилляра-1 и Капилляра-2 даже в присутствии СКПХ и СД в ФЭ не удалось разделить энантиомеры большинства модельных соединений. Удалось разделить энантиоме-ры тетрагидрозолина с Я, = 0,6 (^ = 0,002) за 3 мин (содержание СД в ФЭ составило 1,08%). При использовании капилляра, модифицированного 6,10-ионе-ном и СД без наночастиц золота разделены энанти-омеры тетрагидрозолина, атенолола, доксиламина, хлорфенирамина, орфенадрина.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-03-00405а) и Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт № 8245/
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Neman B., Grushka E., Lev O. // J. Anal. Chem. 2001. 73. P. 5220.
Chung-Shu Wu, Fu-Ken Liu, Fu-Hsiang Ko. // Anal. Bioanal. Chem.. 2011. 399. P. 103.
Kasicka V., MiksikI., Rezanka P. // J. Sep. Sci. 2010. 33. P. 372.
Qishu Qua, Dengping Liu, Debby Mangelings, Chun Yang, Xiaoy Hu. // J. Chromatogr. A. 2010. 1217. P. 6588.
Min Li, Xi Liu, Fengyi Jiang, Liping Guo, Li Yang. // J. Chromatogr. A. 2011. 1218. P. 3725.
Budanova N., Shapovalova E., Lopatin S., Varlamov V., Shpigun O. // Chromatographic 2004. 59. P. 709.
Буданова Н. Ю., Шамшурин Д. В., Шаповалова Е.Н. / Сб. Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии. М., 2006. С. 386.
Phinney K.W., Sander L.C. // Anal. Bioanal. Chem. 2003. 375. P. 763.
Поступила в редакцию 12.03.13
ФЭ - фильтующий элемент или фоновый электролит?
Перед использованием буферный раствор фильтровали через насадку с ФЭ на шприц «МШех®ОУ», мембрана «Вигароге®РУВБ» («МИПроге», Франция), размер пор 0,22 мкм.
Новый капилляр перед работой промывали водой (10 мин), фоновым электролитом (15-30 мин). Каждые 4-5 анализов ФЭ обновляли.
SEPARATION OF NOTROGEN-CONTANING COMPOUNDS ON SILICA CAPILLARIES MODIFIED WITH CITRATE- STABILIZED GOLD NANOPARTICLES, 6,10-IONENE, N-(3-SULFO-3 CARBOXY) PROPIONILECHITOSANE AND DEXTRAN SULPHATE
A.N. Mikhalyuk, E.N. Shapovalova, A.G.Maguga, O.A. Shpigun, P.G. Rudakovskaja
(Division of Analytical Chemistry; Division of Organic Chemistry)
Gold nanoparticles are applied in different fields of science for a last 10 years, e.g. physicochemical separation methods. Two fused-silica capillaries for capillary electrophoresis (CE) modified layer-by-layer with citrate- stabilized gold nanoparticles, 6,10-ionene, N-(3-sulfo-3-carboxy) propionylchitosane (SCPH) and dextran sulfate (DC) are prepared and investigated. It is found out that separation of tetrahydrosoline, pindolol, terbutalin, nadolol, hydroxyzine is most effective and fast in case of modifying with gold nanoparticles and polysaccharide in comparison with case of polysaccharide only. The most successful system for CE with utilization of dextran sulfate as polysaccharide is received. The enantiomers of tetrahydrozoline are separated on capillary modified with gold nanoparticles, 6,10-ionene and dextran sulfate.
Key words: capillary electrophoresis, dextran sulfate, N-(3-sulfo-3-carboxy)propionylchitosan, P-blockers.
Сведения об авторах: Михалюк Анна Николаевна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ (freund-for-me@mail.ru); Шаповалова Елена Николаевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (shapovalova@analyt.chem.msu.ru); Мажуга Александр Григорьевич - доцент кафедры органической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук. (magu-ga@mail.ru); Шпигун Олег Алексеевич - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, чл.-корр. РАН, докт. хим. наук (shpigun@analyt.chem.msu.ru); Рудаковская Полина Григорьевна -аспирант кафедры органической химии (polinaru@list.ru).
