CC BY
16
УДК 543.545.2
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ЭНАНТИОРАЗДЕЛЕНИЕ ПРОФЕНОВ В ВОДНО-МЕТАНОЛЬНЫХ РАСТВОРАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭРЕМОМИЦИНА В КАЧЕСТВЕ ХИРАЛЬНОГО СЕЛЕКТОРА
М.В. Лебедева, А.Ф. Прохорова, Е. Н. Шаповалова, О.А. Шпигун
(кафедра аналитической химии: email: margoL87@mail.ru)
Продемонстрирована возможность электрофоретического разделения энантиомеров про-фенов в присутствии макроциклического гликопептидного антибиотика эремомицина в качестве хирального селектора с использованием водно-метанольных фоновых электролитов. Изучено влияние содержания метанола, рН фосфатного буферного раствора и концентрации антибиотика на параметры разделения энантиомеров. Показано, что использование водно-метанольного фонового электролита обеспечивает лучшую воспроизводимость времени миграции соединений и стабильность базовой линии по сравнению с водными буферными растворами. Время анализа в неводных условиях не превышает 15 мин.
Ключевые слова: капиллярный электрофорез, энантиоразделение, макроциклические антибиотики, эремомицин, профены.
Разделение энантиомеров биологически активных соединений - важная аналитическая задача, поскольку установлено, что существуют различия в фарма-кодинамике и фармакокинетике индивидуальных изомеров. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) эффективен и удобен при разделении и определении хиральных соединений. Широко используемыми универсальными и селективными хиральными селекторами (ХС) являются макроциклические антибиотики (МА) [1].
Эремомицин - антибиотик, предложенный российскими исследователями, он не уступает по эффективности ванкомицину и селективен по отношению к органическим кислотам [2]. Эремомицин, как и другие МА, адсорбируется на стенках кварцевого капилляра, что приводит к снижению эффективности и существенным искажениям результатов определения аналитов [3]. Уменьшить взаимодействие между МА и поверхностью кварцевого капилляра, а следовательно, понизить адсорбцию хирального селектора позволяет модифицирование поверхности капилляра разными соединениями [4] или использование неводных фоновых электролитов.
Цель данной работы - изучение разделения энан-тиомеров индопрофена, флурбипрофена, кетопро-фена и фенопрофена в присутствии эремомицина в кварцевом капилляре с водно-метанольным фоновым электролитом.
Экспериментальная часть
Реагенты и аппаратура
В работе использовали CH3COOH, HCl и KOH («Germed», Германия), CH3COONa-3H2O («Лаб-тех», Россия), KH2PO4, K2HPO4-3H2O («Реахим», Россия), метанол. В качестве хирального селектора использовали сульфат эремомицина, предоставленный С.М. Староверовым (ЗАО «БиоХимМак С&Т», Россия). Стандартные (0,1 мг/мл) растворы индопрофена, флурбипрофена, кетопрофена и фе-нопрофена (табл. 1) («Sigma-Aldrich», США) готовили растворением точных навесок в метаноле. В качестве фонового электролита (ФЭ) использовали смеси метанола и фосфатного буферного раствора (50 мМ, рН 4,8; 5,8; 7,3) с разными добавками эремомицина. Для приготовления растворов использовали очищенную воду («MilliQ»). Подготовку растворов проводили в УЗИ-бане «Сапфир» (НПФ «Сапфир», Россия); рН водных растворов контролировали на иономере «ЭВ-74».
Использовали систему «Капель-103Р» (НПФ АП «Люмэкс», Россия) со спектрофотометрическим детектором при 254 нм и кварцевый капилляр 44/35 см (внутренний и внешний диаметры 50 и 363 мкм, «Polymicro Technologies», США). Образцы вводили под давлением (25 мбар, 15 с). Приложенное напряжение составляло -20 кВ. Данные получены и
Т а б л и ц а 1
Структурные формулы профенов
Флурбипрофен
Кетопрофен
Фенопрофен
Индопрофен
обработаны с помощью программного обеспечения Мультихром 1.52г (ЗАО «Амперсенд», Россия).
Начиная работу с новым кварцевым капилляром, его последовательно промывали водой (30 мин), 1 М раствором KOH (30 мин), водой (30 мин), 1 М HCl (30 мин) и водой (30 мин). Ежедневно перед началом работы капилляр последовательно промывали смесью метанола и воды (1:1) и ФЭ в течение 10 и 15 мин соответственно. Между анализами капилляр промывали смесью метанола и воды (3 мин) и ФЭ (5 мин). По окончании работы капилляр промывали во-дно-метанольной смесью (10 мин), водой (10 мин) и оставляли концы капилляра в воде.
Результаты и их обсуждение
Макроциклический антибиотик эремомицин плохо растворим в органических растворителях (спирты,
ацетонитрил) и хорошо растворим в воде, поэтому в качестве ФЭ возможно использование смеси метанола и водного буферного раствора (содержание метанола до 60-70 об.%). Эремомицин имеет аминогруппы, способные к протонированию при рН < 7,65, что приводит к взаимодействию с силанольными группами поверхности кварца. Для оценки адсорбции предложено использовать зависимость общей подвижности адсорбата от введенной в капилляр концентрации [5]. В настоящей работе исследована адсорбция антибиотика эремомицина в диапазоне концентраций от 0,01 до 8,25 мМ в ФЭ, состоящем из метанола и 50 мМ фосфатного буферного раствора (ФБ) в соотношении 60/40 об.% (рН 5,8). Изучение адсорбции при более высоких концентрациях ХС не представляется возможным из-за ограниченной растворимости эремомицина в смеси ФБ-метанол. При увеличении
концентрации эремомицина во вводимой пробе скорость электроосмотического потока (ц) падает, что связано с уменьшением суммарного отрицательного заряда стенок капилляра вследствие адсорбции положительно заряженных молекул селектора. Общая подвижность эремомицина с ростом его концентрации во вводимой пробе увеличивается, а затем выходит на плато (табл. 2).
Начальный (1,03-4,12 мМ) участок полученной изотермы является линейным (у = 0,06х + 0,096; r = 0,990), его можно рассматривать как изотерму Генри. Тангенс угла наклона линейного участка изотермы адсорбции равен константе А, которая пропорциональна степени заполнения поверхности стенки капилляра молекулами эремомицина и характеризует скорость изменения общей подвижности в зависимости от концентрации ХС. Константа А аналогична константе Генри и в исследованных условиях состав-
—3 2
ляет 6^10 см /кВхмМхс. В работах, выполненных ранее, вычислены константы А при использовании водного (рН 5,5) электролита в немодифицированном и модифицированном капиллярах. Установлено, что
при использовании немодифицированного капилля-
—1 2
ра константа А составляет 1,1x10 см /кВхмМхс, для капилляра, модифицированного эремомицином
через 3 -глицидилоксипропилтриэтоксисилан, она
—2 2
равна 8,8x10 см /кВхмМхс. Таким образом, использование водно-органического фонового электролита значительно уменьшает адсорбцию эремомицина на внутренних стенках капилляра.
Основным параметром, определяющим подвижность аналита в ФЭ, является отношение s/n (s — диэлектрическая проницаемость ФЭ, n — вязкость ФЭ). Молекулы карбоновых кислот в ФЭ заряжены отрицательно (значения pKa в воде больше 4,1), следовательно, они должны двигаться в сторону анода в направлении, противоположном ЭОП. Полярность, при которой следует детектировать профены, определяется, главным образом, соотношением собственной электрофоретической подвижности соединения и подвижности ЭОП. В водно-метанольных ФЭ собственная электрофоретическая подвижность органических кислот оказывается больше подвижности ЭОП, поэтому необходимо использовать отри-
Содержание метанола, об.%
Рис. 1. Зависимость времени миграции профенов от содержания метанола в ФЭ
цательную полярность. В качестве ФЭ использовали смесь метанола и 50 мМ ФБ (рН 5,8) с 2 мМ добавкой эремомицина. Содержание метанола в ФЭ изменяли в диапазоне 0-70 об.%, поскольку при дальнейшем увеличении доли метанола растворимость антибиотика резко уменьшается. Зависимость времени миграции индопрофена, кетопрофена, фенопрофена и флурбипрофена от содержания метанола в ФЭ представлена на рис. 1. Как видно из графика, время миграции профенов монотонно возрастает при увеличении содержания метанола от 0 до 30 об.%, при дальнейшем увеличении содержания метанола до 60 об.% они практически не изменяются, а затем несколько уменьшаются. Так как направление собственной миграции профенов и ЭОП противоположно, а добавка метанола влияет на оба этих параметра, то зависимость времени миграции профенов от доли метанола в ФЭ не должна носить линейный характер, а должна предположительно иметь максимум или выходить на плато, что соответствует полученному графику. При увеличении содержания метанола в ФЭ наблюдается увеличение времени миграции профенов, а также некоторое уменьшение коэффициентов селективности и разрешения пиков энантиомеров профенов. Это связано с тем, что при увеличении доли метанола в ФЭ заряд молекулы эремомицина уменьшается, и электростатические взаимодействия между селектором и профенами ослабляются. Но даже при содержании метанола 60 об.% в ФЭ разрешение между пиками энантиомеров достигается до базовой линии благодаря высокой эффективности. Преимуществом добавки метанола является меньший генерируемый
Т а б л и ц а 2
Концентрация эремомицина, мМ 1,03 2,05 3,09 4,12 6,16 8,25
ц, см2/кВхс 0,101 0,109 0,115 0,120 0,122 0,121
ток и, как следствие, меньшее количество Джоулева тепла, что повышает устойчивость ХС и улучшает воспроизводимость значений времени миграции и площади пиков, а также стабильность базовой линии.
Изучено влияние рН фосфатного буферного раствора на параметры разделения при содержании метанола 60 об.% в ФЭ. При изменении рН от 4,8 до 7,3 время миграции профенов увеличивается примерно в полтора раза, а энантиоселективность ухудшается, лучший результат наблюдается при рН 5,8. Разрешение пиков энантиомеров зависит от концентрации селектора, которую изменяли в интервале 0,5-2,0 мМ. В табл. 3 отражено влияние концентрации эремоми-цина на разделение энантиомеров. Время миграции профенов с ростом концентрации селектора изменяется незначительно. Разрешение пиков энантиомеров увеличивается, что свидетельствует об образовании диастереомерных комплексов. Лучшее разделение
энантиомеров достигается для флурбипрофена и индопрофена, хуже всего разделяются энантиомеры фенопрофена. Следует отметить, что даже при кон -центрации эремомицина 0,5 мМ достигается разделение энантиомеров флурбипрофена и индопрофена практически до базовой линии. На рис. 2 показаны электрофореграммы рацемических смесей флурбипрофена и индопрофена.
Применимость разработанного подхода для аналитических целей показана на примере определения ке -топрофена в геле «Быструмгель» с использованием не-модифицированного капилляра в водно-метанольном ФЭ (60 об.% метанол и 40 об.% ФБ, рН 5,8; 2,0 мМ эремомицина). При построении градуировочной зависимости по оси ординат откладывали площадь, нормированную на время миграции (S/t). Показано, что данный препарат содержит рацемическую смесь кетопрофена, доля энантиомера, мигрирующего первым (12,7 мин),
Т а б л и ц а 3
Влияние концентрации эремомицина (мМ) на разделение энантиомеровпрофенов*
Соединение Концентрация эремомицина, мМ
2,0 1,0 0,5
t1, мин R А t1, мин Rs А t1, мин Rs А
Флурбипрофен 12,7 5,92 1,09 12,9 3,71 1,06 13,4 1,66 1,03
Кетопрофен 13,2 3,80 1,04 13,4 1,32 1,02 14,8 0,60 1,01
Фенопрофен 12,7 2,01 1,03 12,8 0,82 1,01 14,0 0 1,00
Индопрофен 14,7 4,65 1,08 14,9 3,16 1,03 16,2 1,30 1,02
* Условия: метанол (60 об.%), 50 мМ фосфатный буферный раствор, рН 5,8 (40 об.%), U = -20 кВ.
Рис. 2. Электрофореграмма флурбипрофена (а) и индопрофена (б). Условия: метанол / ФБ, рН 5,8 (60/40 об.%),
0,5 мМ эремомицин, U = -20 кВ
составляет (50,7±2,2)%, доля энантиомера, мигрирующего вторым (13,3 мин) составляет (49,3±2,2)%. Найденное содержание кетопрофена (2,4±0,1)% совпадает с заявленным производителем (2,5 %).
Из данных, полученных нами ранее [6] следует, что в водном КЭ модифицированные капилляры обладают заметными преимуществами перед не-модифицированными - уменьшение адсорбции ХС на стенках капилляра и времени анализа и, главное, снижение необходимой концентрации ХС для разделения энантиомеров. Так, в капилляре, модифицированном эремомицином через эпоксисилан, частичное разделение энантиомеров флурбипрофена
(^ = 0,52) и кеторпрофена (^ = 0,35) получено при концентрации 0,1 мМ ХС в ФЭ, что намного меньше значений концентрации, представленных в литературе ранее (от 1 до 5 мМ) [2]. Однако получение модифицированных капилляров требует достаточно много времени и сил. Кроме того, их использование накладывает определенные ограничения на значения рН фонового электролита и приложенного напряжения, поэтому в качестве альтернативы можно предложить использование водно-мета-нольного ФЭ в немодифицированном капилляре. В данном случае в оптимальных условиях время анализа не превышает 15 мин.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект №12-03-31255).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРА
1. ProkhorovaA.F., Shapovalova E.N., Shpigun O.A. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2010. 53. P. 1170.
2. ProkhorovaA.F., ShapovalovaE.N., Shpak A.V., Staroverov, S. M., Shpigun, O. A. // J. Chromatogr. A. 2009. 1216. P. 3674.
3. Weinberger R. Practical Capillary Electrophoresis. 2nd ed. 2000. N.Y.
4. Horvath J., Dolnik V. // Electrophoresis. 2001. 22. P. 644.
5. FangN., ZhangH, Li H.-W., YeungE.S. // Anal. Chem. 2007. 79. P. 6047.
6. Лебедева М.В., Прохорова А.Ф., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А., Староверов С.М., Кузнецов М.А. // Сорб. и хром. процессы. 2011. 11. С. 589.
Поступила в редакцию 25.03.13
ELECTROPHORETIC ENANTIOSEPARATION OF PROFENS IN WATERMETHANOL SOLUTIONS USING EREMOMYCIN AS A CHIRAL SELECTOR
M.V. Lebedeva, A.F.Prokhorova, E.N. Shapovalova, O.A. Shpigun
The possibility of electrophoretic enantioseparation of profens in water-methanol solution of eremomycin was demonstrated. Effect of methanol content, phosphate buffer pH, and chiral selector concentration on enantioresolution was studied. Water-methanol run buffer was shown to provide better reproducibility of migration times, baseline stability compared to aqueous buffers. Analysis time in non-aqueous conditions is less than 15 min.
Key words: capillary electrophoresis, enantioseparation, macrocyclic antibiotics, eremomycin, profens.
Сведения об авторах: Лебедева Маргарита Владимировна - аспирант химического факультета МГУ (margoL87@mail.ru); Прохорова Александра Федоровна - мл. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (alexapro@gmail.com); Шаповалова Елена Николаевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (shapovalova@analyt.chem.msu.ru); Шпигун Олег Алексеевич - профессор кафедры аналитической химии химического факультета МГУ, докт. хим. наук, чл.-кор. РАН (shpigun@analyt.chem.msu.ru).
