CC BY
20
УДК 543.544
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНАНТИОМЕРНОЙ ЧИСТОТЫ АЛЬБУТЕРОЛА НА СОРБЕНТАХ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ МАКРОЦИКЛИЧЕСКИМИ АНТИБИОТИКАМИ
Е.Н. Шаповалова, И.А. Федорова, А.А. Припорова, И.А. Ананьева*, О.А. Шпигун
(кафедра аналитической химии, *е-тай: [email protected])
Исследовано энантиоразделение альбутерола на сорбентах с иммобилизованными на поверхности силикагеля макроциклическими гликопептидными антибиотиками. Для разделения энантиомеров использовали коммерческие колонки ^^Пш^ (ЗАО «Био-Хим-Мак», Россия) с хиральным селектором эремомицином и ChirobioticTAG («Astec», США) с хиральным селектором агликоном тейкопла-нина. Левалбутерол является R-изомером альбутерола, их удалось разделить на обеих колонках в полярно-органическом режиме, но селективность на колонке ChirobioticTAG выше = 1,7). Максимальное разрешение пиков энантиомеров (1,7) наблюдается для подвижной фазы MeOH:ACN:TEA:CH3COOH (90:10:0,5:0,5). Предел обнаружения соединения, рассчитанный по отношению сигнал:фон = 3:1, составил 0,00002 мг/мл, что соответствует 0,1% S-формы по отношению к общему количеству. Полученные результаты позволили определить энатиомерную чистоту субстанций левалбутерола.
Ключевые слова: макроциклические гликопептидные антибиотики, хиральные селекторы, энантиомеры, оптическая чистота лекарственных форм.
В настоящее время среди задач фармацевтической химии особое место занимает анализ оптической чистоты лекарственных средств. Наиболее сложная проблема заключается в разделении синтетических рацемических смесей на оптически чистые компоненты, так как часто оптические изомеры проявляют разную биологическую и фармакологическую активность [1, 2].
Высокоэффективная жидкостная хроматография позволяет решить сложнейшие проблемы анализа энантиомерного состава оптически активных соединений, а также препаративного получения оптически чистых изомеров разных классов соединений. Хроматографическое разделение энантиомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор, способный различать пространственную конфигурацию оптических антиподов.
Хиральные селекторы на основе макроцикли-ческих антибиотиков, к которым относятся ван-комицин, тейкопланин, ристоцетин А, авопарцин и др., дают широкие возможности для разделения разных классов оптически активных соединений благодаря наличию в их структуре различных по строению фрагментов, способных к многоточечным взаимодействиям с разделяемыми соединениями как в полярных, так и неполярных растворителях, а также благодаря сложному механизму взаимодействия энантиомеров с поверхностью.
Хиральные неподвижные фазы, содержащие один из вышеперечисленных антибиотиков, имеют уникальную селективность и, как известно из литературных данных, все вместе они предоставляют возможность исследователям осуществлять так называемые «комплементарные» энантиоразделе-ния [3-5]. Термин «комплементарный» описывает условия, при которых улучшение селективности энантиоразделения получено при использование той же самой подвижной фазы, но на неподвижной фазе с другим макроциклическим антибиотиком. Причина этого явления кроется в тонких различиях между неподвижными фазами [3].
Цель настоящей работы - изучение разделения энантиомеров лекарственного препарата альбуте-рола на сорбентах, модифицированных антибиотиками (эремомицином, агликоном тейкопланина) и выбор условий определения энантиомерной чистоты лекарственных субстанций.
Экспериментальная часть
Реагенты и аппаратура Для приготовления подвижных фаз использовали следующие реагенты: ацетонитрил (ЛСК), метанол (МеОН), изо-пропанол (-Рг) («для хроматографии», «Ралгеас», Испания); муравьиная кислота (НСООН) (85%, «ос.ч.», «Реахим», Россия), уксусная кислота (СН3СООН) (98%, «ос.ч.», «Реахим», Россия), трифторуксусная кислота (СБ3СООН) (99%,
«ос.ч.», «Реахим», Россия); диэтиламин (DEA), триэтиламин (TEA), трибутиламин (TBA) (99%, «ос.ч.», «Acros Organics», США).
Фосфатный буферный раствор готовили растворением точных навесок дигидрофосфата аммония («ч.д.а.», «Реахим», Россия). Цитратный буферный раствор получали растворением точных навесок цитрата натрия («ч.д.а.», «Реахим», Россия).
В качестве аналитов использовали стандартные образцы и субстанции фармацевтического препарата левалбутерола гидрохлорида (субстанция 1 и субстанция 2), предоставленные ЗАО «Ф-Синтез». Исходные растворы (0,1-1,0 мг/мл) левалбутерола гидрохлорида (далее левалбутерол) готовили растворением точных навесок в ацетонитриле, метаноле, изопропаноле или воде.
В работе использовали жидкостной хроматограф «LC-20 Prominence» («Shimadzu», Япония) с диодно-матричным детектором «SPD-M20A» («Shimadzu», Япония). Сбор данных и обработку хроматограмм проводили с помощью программного обеспечения LC Solution фирмы «Shimadzu». Скорость подачи элюента составляла 1 мл/мин, объем петли дозатора 20 мкл, ввод пробы осуществляли шприцем объемом 100 мкл; Хмакс = 270 нм. Использовали коммерческие колонки: 1) Nautilus-E (250x4 мм) (ЗАО «Био-Хим-Мак», Россия), диаметр зерна сорбента 5 мкм; 2) Chirobiotic TAG (250x4,6 мм) («Supelco-Sigma-Aldrich», США), диаметр зерна сорбента 5 мкм. Значение рН водных растворов измеряли на рН-метре «рН-410» («Аквилон», Россия). Подвижную фазу перед использованием дегазировали на ультразвуковой ванне «Сапфир 6580» (рабочая ча-
Рис. 1. Структура альбутерола
стота 35 кГц, мощность 60 Вт, НПФ «Сапфир», Россия) в течение 10 мин для снижения колебаний фонового сигнала и обеспечения нормальной работы насоса.
Результаты и их обсуждение
В работе изучали препарат левалбутерол, который является Я-изомером альбутерола (рис. 1) и используется как бронхолитическое средство. Этот препарат применяют для профилактики и купирования бронхоспазма при бронхиальной астме, для симптоматического лечения бронхо-обструктивного синдрома (хронический бронхит, хроническая обструктивная болезнь легких и др.) и ночной астмы, а также для предупреждения преждевременных родов.
Разделение энантиомеров проводили на сорбентах, модифицированных антибиотиками - эремомицином, агликоном тейкопланина. Эремомицин содержит 18 хиральных центров, которые окружают три полости, образованные пятью ароматическими кольцами, кроме того, он содержит шестичленный кислородосодержащий цикл с гидрокси-, амино-, метилзаместителями («гидрофобный карман»), его молекулярная масса составляет 1540 г/моль (рис. 2) [6]. Агликон тейкопланина (производное тейкопланина) имеет молекулярную массу 1197 г/моль и содержит 8
Рис. 2. Структура антибиотика эремомицина
хиральных центров. Агликон состоит из четырех слившихся макроциклических колец, образующих «полужесткую корзину» (рис. 3). Он имеет семь ароматических колец, два из которых содержат хлор в качестве заместителя, а четыре - ионизируемые фенольные фрагменты [3, 4].
Возможность разделения энантиомеров аль-бутерола исследовали в полярно-органическом (ПО) и обращенно-фазовом (ОФ) режимах на ко -лонке КаиШш-Е. В ОФ-режиме в качестве подвижной фазы использовали фосфатный (рН 5) и цитратный (рН 6) буферные растворы, а также органические растворители (метанол, ацетони-трил). Разделения энатиомеров альбутерола в ОФ-режиме достичь не удалось, вещество слабо удерживалось на колонке (к' = 0,1^0,4), что не позволило разделить его энантиомеры.
Наличие сильных полярных групп в структуре макроциклических антибиотиков делает возможным использование подвижных фаз с содержанием метанола до 100%. В этом случае, чтобы повлиять на энантиоселективность разделения, используют добавку (кислота/основание) в подвижную фазу. Известно, что концентрация этой добавки влияет на удерживание полярных молекул и, кроме того, может увеличивать энантио-разделение слабо полярных молекул. Ключевым фактором для получения полного разделения является соотношение добавки кислота/основание. Каждая из антибиотиковых фаз имеет отличное от другой оптимальное соотношение состава добавки [3].
Энантиоразделения исследуемого препарата удалось добиться в ПО-режиме хроматографии. В качестве подвижной фазы использовали органические растворители (метанол, ацетони-трил) с добавками кислот (уксусная кислота, муравьиная кислота, трифторуксусная кислота)
и оснований (триэтиламин, трибутиламин, ди-этиламин). В ПО-режиме исследовали влияние соотношения метанола и ацетонитрила в составе подвижной фазы на энантиоразделение (табл. 1). При варьировании природы органического растворителя выявили, что частичная замена метанола на ацетонитрил в составе подвижной фазы не влияет на разрешение пиков. В то же время такая замена влияет на удерживание веществ и селективность (они проходят через максимум), что позволяет оптимизировать условия анализа по времени, получая при этом хроматограммы с хорошим разрешением пиков. Максимальное разрешение пиков энантиомеров наблюдается при соотношении МеОН:ЛСН = 80:20.
Исследовано влияние концентрации амина и кислоты (в интервале 0,025-0,300%) на разрешение пиков энантиомеров (табл. 2). Разрешение пиков энантиомеров увеличивается при уменьшении концентрации кислоты и амина в составе подвижной фазы, поэтому в дальнейшем были использованы низкие концентрации добавок.
При варьировании природы кислоты и амина использовали следующие кислоты и амины: уксусная кислота, муравьиная кислота, трифто-руксусная кислота, триэтиламин, трибутиламин, диэтиламин (табл. 3). Исследование показало, что наилучшее разделение пиков энантиомеров достигается при использовании триэтиламина и уксусной кислоты в качестве добавки в подвижную фазу.
На основании проведенных исследований лучшее разрешение пиков энантиомеров альбутерола на сорбенте, содержащем эремомицин получили для подвижной фазы МеОН:ЛС№ТЕЛ:СН3СООН (80:20:0,075:0,025). Для увеличения значения снизили скорость подачи подвижной фазы с 1,0 до 0,5 мл/мин и достигли разрешения 1,0. Хромато-
ОН
Рис. 3. Структура антибиотика агликона тейкопланина
Т а б л и ц а 1
Влияние соотношения MeOH:ACN в подвижной фазе на хроматографические параметры для левалбутерола (1) и S-альбутерола (2). Подвижная фаза - MeOH:ACN
(0,05:0,05 ТЕА:СН3СООН)
Соотношение ацетонитрил:метанол в подвижной фазе, об.% t', мин R s а k' N, тт/м
1 2 1 2
0:100 2,6 3,1 1,1 1,2 1,23 10570 9080
5:95 2,9 3,4 1,1 1,2 1,38 7450 7020
10:90 5,5 6,0 1,1 1,1 2,62 11900 8630
20:80 3,0 4,3 1,2 1,4 1,43 9040 9090
30:70 2,6 5,1 1,1 2,0 1,24 11430 5850
О б о з н а ч е н и я: (' - исправленное время удерживания, - разрешение (фактор разрешения), а - коэффициент селективности, к' - фактор емкости для первого энантиомера, N - число теоретических тарелок на метр.
Т а б л и ц а 2
Влияние соотношения TEA и CH3COOH в подвижной фазе на хроматографические параметры левалбутерола (1) и S-альбутерола (2). Подвижная фаза - MeOH:ACN (80:20)
Добавка в подвижную фазу t', мин R s а k' N, тт/м
(TEA:CH3COOH), об.% 1 2 1 2
0,05:0,05 3,4 4,3 1,2 1,3 1,62 9040 9090
0,1:0,1 6,2 6,8 1,1 1,1 2,95 7450 6820
0,1:0,2 6,2 6,8 0,9 1,1 2,95 6900 5830
0,1:0,3 6,3 6,8 0,6 1,1 3,00 5940 4090
Т а б л и ц а 3
Влияние природы кислоты и амина в составе подвижной фазы MeOH:ACN (80:20) на разделение энантиомеров альбутерола
Добавка в подвижную фазу, об.% t', мин Rs s
1 2
(0,025:0,025) TEA:CF3COOH 1,17 1,29 0,3
(0,075:0,025) TEA:CF3COOH 6,63 7,30 0,5
(0,025:0,025) TEA:HCOOH 1,37 1,51 0,3
(0,075:0,025) TEA:HCOOH 1,41 1,52 0,3
(0,025:0,025) TEA:CH3COOH 4,31 5,82 0,8
(0,075:0,025) TEA:CH3COOH 6,11 6,91 0,9
(0,025:0,025) TBA:CH3COOH 4,26 - 0
(0,075:0,025) TBA:CH3COOH 5,02 5,22 0,3
(0,025:0,025) DEA:CH3COOH 2,96 - 0
(0,075:0,025) DEA:CH3COOH 3,43 3,53 0,2
грамма смеси рацемической смеси представлена на рис. 4.
Сорбент, модифицированный эремомицином, не позволил добиться необходимого, согласно требованиям фармакопеи, разрешения пиков альбуте-рола (RS > 1,5), поэтому исследование продолжили на сорбенте с агликоном тейкопланина.
Для разделения энантиомеров альбутерола использовали коммерческую колонку Chirobiotic TAG (250x4,6 мм, диаметр зерна сорбента 5 мкм). Разделение энантиомеров альбутерола проводили в ПО- и ОФ-режимах. Как и в предыдущем случае, разделения энантиомеров исследуемого препарата удалось добиться только в ПО-режиме хроматографии. В качестве подвижной фазы в ПО-режиме использовали органические растворители (метанол, ацетонитрил) с добавками уксусной кислоты и триэтиламина.
Для альбутерола разрабатывается фармакопейная статья (USP), в которой энантио-разеделение проводят на силикагеле, модифицированном агликоном тейкопланина [8]. Предлагаемый для определения энантиомерной чистоты альбутерола состав подвижной фазы -MeOH:ACN:TEA:CH3COOH. Условия, прописанные в USP, не позволили нам добиться необходимого разрешения пиков энантиомеров (RS = 1,1), поэтому мы оптимизировали условия, уменьшив сначала содержание кислоты, а затем и амина в подвижной фазе до 0,05%, чтобы разрешение пиков было достаточным (табл. 4, рис. 5).
Разделения энантиомеров альбутерола удалось достичь на колонках как с эремомицином, так и с агликоном тейкопланина в полярно-органическом
режиме. Составы подвижных фаз для двух селекторов, при которых наблюдалось наилучшее разрешение, очень похожи. Это может объясняться тем, что и эремомицин и агликон тейкопланина содержат карбоксильные группы, первичные, вторичные амины и ароматические кольца, которые одинаково взаимодействуют с функциональными группами аналита. Более сильное удерживание и высокий фактор разрешения энантиомеров аль-бутерола на колонке Chirobiotic TAG связаны с большей доступностью ароматических колец в его структуре (по сравнению с эремомицином) и возможностью дополнительных специфических п-п-взаимодействий. Достаточно простая структура молекулы альбутерола позволяет беспрепятственно взаимодействовать хиральным центрам антибиотиков и анализируемого вещества, вероятно, поэтому небольшого количества хиральных центров на агликоне тейкопланина достаточно для энантиоразделения альбутерола, а ионизация препарата в ПО-режиме усиливает возможность энан-тиораспознавания.
На основании полученных результатов для определения энантиомерной чистоты фармацевтического препарата была выбрана колонка Chirobiotic TAG, содержащая в качестве хирального селектора агликон тейкопланина. Оптимальный состав подвижной фазы MeOH:ACN:TEA:CH3COOH (90:10:0,5:0,5).
Для проверки пригодности хроматографиче-ской системы раствор альбутерола хроматографи-ровали в выбранных условиях пять раз. Перед началом определения хроматографическую колонку промывали подвижной фазой до формирования
Рис. 4. Хроматограмма смеси энантиомеров альбутерола на колонке Nautilus E. Подвижная фаза - MeOH:ACN:TEA:CH3COOH (80:20:0,075:0,025). Скорость потока 0,5 мл/мин; X = 270 нм, R = 1,0
Т а б л и ц а 4
Влияние содержания кислоты и амина в составе подвижной фазы МеОИ:ЛСК (90:10) на разделение энантиомеров альбутерола
Добавка в подвижную фазу мин R s
(ТБА:СИ3СООИ), об.% 1 2
0,1:0,3 31,93 32,83 1,1
0,1:0,2 32,10 32,95 1,1
0,1:0,1 32,14 33,12 1,3
0,1:0,05 32,07 33,34 1,6
0,05:0,05 29,08 31,59 1,7
стабильной базовой линии. Разрешение пиков ле-валбутерола и 8-альбутерола 1,7. Эффективность хроматографической колонки (У) для пиков ле-валбутерола и 8-альбутерола составила 10500 и 7300 теоретических тарелок соответственно. Относительное стандартное отклонение (£.) для площади пиков левалбутерола и 8-альбутамола составило соответственно 0,07 и 0,08 (по нормативной документации не более 20%) Фактор ассиметрии (А8) пиков левалбутерола и 8-альбутерола составил соответственно 0,95 и 0,97.
В выбранных условиях получены хромато-граммы ряда градуировочных растворов альбу-терола и построена градуировочная зависимость площади пика левалбутерола от концентрации в смеси энантиомеров (табл. 5). Предел обнаружения соединения, рассчитанный по отношению сигнал:фон = 3:1 составил 0,00002 мг/мл, что соответствует содержанию 0,1% 8-формы по отно-
шению к общему количеству. Полученные характеристики показывают, что возможно определение и разделение энантиомеров альбутерола с хорошей воспроизводимостью и чувствительностью. По требованиям фармакопейной статьи, содержание 8-альбутерола в препарате не должно превышать 0,2% [8]. Полученные результаты позволили определить эннатиомерную чистоту двух субстанций препарата левалбутерол.
Анализ метанольных растворов двух субстанций левалбутерола показал, что первый образец (субстанция 1) содержит 5,0±0,1% примеси 8-альбутерола, что недопустимо по данным ФСП. Хроматограмма образца представлена на рис. 6, а. Второй образец (субстанция 2) не содержит примеси 8-альбутерола (рис. 6, б), что дает право использовать его в качестве лекарственного препарата. Для проверки правильности результатов повторили определение 8-альбутерола
Рис. 5. Хроматограмма разделения энантиомеров альбутерола на колонке Chirobiotic TAG. Подвижная фаза - MeOH:ACN:TEA:CH3COOH (90:10:0,05:0,05), Rs = 1,72
Т а б л и ц а 5
Метрологические характеристики хроматографического определения S-альбутерола
(n = 3; P = 0,95)
Диапазон определяемых концентраций S-альбутерола, мг/мл Диапазон определяемого содержания S-альбутерола, % Уравнение градуировочной зависимости r s r
0,0003-0,01 0,1-5 Y = (71±1)x105X + (12±5)x104 0,998 0,08
Т а б л и ц а 6
Определение содержания 8-альбутерола в субстанции 2 методом градуировочного графика и методом добавок (п = 3; Р = 0,95)
Вещество Введенная концентрация, мкг/мл Метод градуировочного графика Метод добавок
с, мкг/мл Sr с, мкг/мл Sr
S-альбутерол 0 0 0 -
10 10±1 0,08 9±2 0,09
Рис. 6. Хроматограмма субстанции 1 (а) и субстанции 2 (б) левалбутерола на колонке Chirobiotic TAG. Подвижная фаза - MeOH:ACN:TEA:CH3COOH (90:10:0,05:0,05)
методом добавок в тех же условиях. Были полу- ченные двумя методами (табл. 6), подтверждают
чены хроматограммы раствора препарата без правильность количественного определения. добавок и с добавками S-альбутерола (5, 8, 10, Таким образом, исследовано влияние органи-
20, 30 мкг/мл). Результаты определения, полу- ческого модификатора, природы и концентрации
амина и кислоты на разделение энантиомеров аль-бутерола на силикагеле, модифицированном эремо-мицином и агликоном тейкопланина. Показана возможность разделения энантиомеров альбутерола на сорбенте, модифицированном эримомицином, подвижная фаза - МеОН:АС№ТБА:СН3СООН (80:20:0,075:0,025 об.%). Показано, что разделение энантиомеров альбутерола оптимально на сор-
бенте, модифицированном агликоном тейкоплани-на, подвижная фаза - МеОН:АС№ТЕА:СН3СООН (90:10:0,5:0,5 об.%). Установлены метрологические характеристики методики определения ле-валбутерола. Проведена оценка энантиомерной чистоты двух субстанций левалбутерола. В одной из субстанций левалбутерола обнаружено 5% 8-энантиомера.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(проект № 15-03-05979а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Пахомов В.П., Чеча О.А. // Ведомости научного центра экспертизы лекарственных средств медицинского применения. 2006. № 3. С. 38.
2. Василенко И.А., Лебедева М.В., Листров В.А. // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2015. Т. 10. № 1. С. 92.
3. Chirobiotic Handbook. Advanced Separation Technologies Inc. Whippany New Jersey, 1999.
4. Ward T.J., FarrisA.B. // J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 906. P. 73.
5. Armstrong D.W. // J. Chin. Chem. Soc. 1998. Vol. 45. P. 581.
6. Staroverov S.M., KuznetsovM.A., Nesterenko P.N., Vasia-rov G.G., Katrukha G.S., Fedorova G.B. // J. Chromatogr. A. 2006. Vol. 1108. P. 263.
7. Armstrong D.W., Tang Y.B., Chen S.S., Zhou Y.W., Bag-will C., Chen J.R. // Anal. Chem. 1994. Vol. 66. P. 1473.
8. The United States Pharmacopoeia. Official Monographs. The United States Pharmacopeial Convention. 2014. Vol. 37. P. 3513.
Поступила в редакцию 12.09.16
DETERMINATION OF THE ENANTIOMERIC PURITY OF ALBUTEROL ON THE MACROCYCLIC GLYCOPEPTIDES BONDED PHASES
E.N. Shapovalova, I.A. Fedorova, A.A. Priporova, I.A. Ananieva*, O.A. Shpigun
(analytical chemistry division, *e-mail: [email protected])
In this research, the separation of albuterol enantiomers on silica gel modified by macrocyclic glycopeptides (eremomycin - column Nautilus-E, BioChemMac, Russia and teicoplanin aglycone - column Chirobiotic TAG, Astec, USA was investigated. Enantiomers of albuterol were separated on Nautilus-E and Chirobiotic TAG columns in polar-organic mode chromatography. The selectivity was higher on Chirobiotic TAG column (Rs = 1.7). The maximum resolution of enantiomers peaks (1.7) was obtained when mobile phase was methanol:acetonitrile:triethylamine:CH3COOH (90:10:0.5:0.5). The detection limit of the compound, calculated by the signal / background ratio = 3:1 was 0.2 ^ml, it correspond 0.10% S-enantiomer of total composition of drug. The content of S-albuterol is permitted at no greater than 0.2%. The determination of enantiomeric purity of the pharmaceutical substances was carried out.
Key words: macrocyclic glycopeptides, chiral selector, enantiomers, enantiomeric purity of the pharmaceutical substances.
Сведения об авторах: Шаповалова Елена Николаевна - доцент кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук (shapovalova_e_n@mail. ru); Федорова Ирина Александровна - аспирант кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Припорова Александра Александровна - дипломник кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ([email protected]); Ананьева Ирина Алексеевна - ст. науч. сотр. кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (irishan@ mail.ru); Шпигун Олег Алексеевич - зав. лабораторией хроматографии кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, чл.-корр. РАН, докт. хим. наук, профессор ([email protected]).
