CC BY
84
Клиническая онкогематология. 2017;10(2):131-40
Clinical oncohematology. 2017;10(2):131-40
ЛИМФОИДНЫЕ ОПУХОЛИ
LYMPHOID TUMORS
Эксцизионные кольца V(D)J-рекомбинации B- и ^клеток как прогностический маркер при В-клеточном хроническом лимфолейкозе
И.В. Образцов12, М.А. Гордукова3, Н.А. Северина4, Б.В. Бидерман4, С.Ю. Смирнова4, А.Б. Судариков4, Е.А. Никитин5, А.Г. Румянцев1
1 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России, ул. Саморы Машела, д. 1, Москва, Российская Федерация, 117198
2 ФГБУ «Государственный научный центр колопроктологии
им. А.Н. Рыжих» Минздрава России, ул. Саляма Адиля, д. 2, Москва, Российская Федерация,123423
3 ГБУЗ «ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского ДЗМ», Шмитовский пр-д, д. 29, Москва, Российская Федерация, 123317
4 ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, Новый Зыковский пр-д, д. 4, Москва, Российская Федерация, 125167
5 ГБУЗ «ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ», 2-й Боткинский пр-д, д. 5, Москва, Российская Федерация, 125284
V(D)J Recombination Excision Circles of B- and T-cells as Prognostic Marker in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia
IV Obraztsov12, MA Gordukova 3, NA Severina4, BV Biderman4, SYu Smirnova4, AB Sudarikov4, EA Nikitin5, AG Rumyantsev1
1 Dmitrii Rogachev Federal Scientific Clinical Centre of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology under the Ministry of Health of the Russian Federation, 1 Samory Mashela str., Moscow, Russian Federation, 117198
2 AN Ryzhikh State Scientific Center for Coloproctology under the Ministry of Health of the Russian Federation, 2 Salyama Adilya str., Moscow, Russian Federation, 123423
3 GN Speranskii Municipal Children's Hospital No. 9, 29 Shmitovskii pr-d, Moscow, Russian Federation, 123317
4 Hematology Research Center under the Ministry of Health of the Russian Federation, 4a Novyi Zykovskii pr-d, Moscow, Russian Federation, 125167
5 SP Botkin Municipal Clinical Hospital, 5 2-i Botkinskii pr-d, Moscow, Russian Federation, 125284
РЕФЕРАТ
Актуальность и цели. Эксцизионные кольца Т-кле-точного рецептора (ТРЕС*) и к-делеционного элемента (КРЕС**) представляют собой внехромосомные структуры ДНК, формирующиеся в процессе Ур)>1-рекомбинации и характеризующие разнообразие антигенного репертуара Т- и В-клеток. Цель — определить прогностическое значение эксцизионных колец при хроническом лимфолейкозе (ХЛЛ).
Методы. В работе исследовали содержание эксцизионных колец методом ПЦР в реальном времени у 109 больных ХЛЛ высокого риска и у 16 условно здоровых лиц соответствующего возраста.
Результаты. Содержание КРЕС у больных ХЛЛ значимо (р < 0,001) снижено по сравнению с контрольной группой. Уровень ТРЕС понижен в группах с немутантными генами вариабельного региона иммуноглобулинов (р < 0,05), с делецией 11я (р < 0,1). Кроме того, показано повышенное (р < 0,05) содержание КРЕС у носителей мутации ЫОТСИ1 по сравнению с пациентами без таковой. Исследование результатов терапии демонстрирует связь между высоким уровнем ТРЕС и достижением полной ремиссии. Прогностическая ценность показателя подтверждена при РОС-анализе: АиСТрЕС = 0,713 (р = 0,001).
ABSTRACT
Background & Aims. T-cell receptor excision circles (TREC) and K-deleting recombination excision circles (KREC) are extrachromosomal DNA segments generated during V(D)J recombination process that characterize the diversity of the antigen repertoire of T- and B-cells. The aim of our study is to identify the prognostic value of the excision circles in the chronic lymphocytic leukemia (CLL) setting.
Methods. The excision circles' levels were assessed by means of real time PCR in 109 patients with high-risk CLL and 16 matched healthy individuals.
Results. KREC levels were significantly (p < 0.001) lower in CLL patients vs. the reference group. TREC levels were lower in groups with unmutated status of immunoglobulin heavy chain variable region genes (p < 0.05) and 11q deletions (p < 0.1). Moreover, the KREC levels were higher in NOTCH1 mutation carriers than in noncarriers (p < 0.05). The comparison of treatment outcomes demonstrated a correlation between a high TREC level and achievement of complete remission. The prognostic value of the bio-marker was confirmed by ROC-analysis: AUCtrec = 0.713 (p = 0.001)
* TREC — T-cell Receptor Excision Circle.
** KREC — Kappa-deleting Recombination Excision Circle.
© 2017 практическая медицина
131
Заключение. Взаимосвязь между содержанием эксци-зионных колец и прогностическими клинико-лабора-торными факторами ХЛЛ, а также достижением полной ремиссии дает возможность использования теста для прогнозирования эффекта терапии.
Ключевые слова: ХЛЛ, TREC, KREC, наивные Т-лимфоциты, наивные B-лимфоциты, биомаркеры, предикторы исхода.
Получено: 10 ноября 2016 г. Принято в печать: 13 января 2017 г.
Для переписки: Игорь Владимирович Образцов, младший научный сотрудник, ул. Саморы Машела, д. 1, Москва, Российская Федерация, 117997; e-mail: ¡gor_obraztsov@bk.ru
Для цитирования: Образцов И.В., Гордукова М.А., Северина Н.А. и др. Эксцизионные кольца V(D)J-рекомбинации B- и T-клеток как прогностический маркер при В-клеточном хроническом лимфолейкозе. Клиническая онкогематология. 2017;10(2):131-40.
Conclusion. Association between excision circles' levels and clinical/laboratory CLL prognostic factors, as well as complete remission achievement, makes possible the implementation of the test for early prediction of the treatment outcome.
Key words: CLL, TREC, KREC, naive T-cells, naive B-cells, biomarkers, outcome predictors.
Received: November 10, 2016 Accepted: January 13, 2017
For correspondence: Igor' Vladimirovich Obraztsov, junior researcher, 1 Samory Mashela str., Moscow, Russian Federation, 117997; e-mail: igor_obraztsov@bk.ru
For citation: Obraztsov IV, Gordukova MA, Severina NA, et al. V(D)J Recombination Excision Circles of B- and T-cells as Prognostic Marker in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia. Clinical oncohematology. 2017;10(2):131-40 (In Russ).
I: 10.21320/2500-2139-2017-10-2-131-140
DOI: 10.21320/2500-2139-2017-10-2-131-140 DOI
ВВЕДЕНИЕ
Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) — самый частый лейкоз у взрослых, характеризующийся кло-нальной экспансией В-лимфоцитов с фенотипом CD5+ IgD/M+. В основе патогенеза лежат дефект апоптоза в циркулирующих клетках ХЛЛ, находящихся в фазах G0/G^ и активная пролиферация клеток ХЛЛ, происходящая в специализированных нишах микроокружения, так называемых центрах пролиферации. Развитие ХЛЛ принципиально зависит от взаимодействия с клетками микроокружения. Так, клетки ХЛЛ индуцируют диф-ференцировку моноцитов в специфические клетки-«кормилицы» (nurse-like cells), наблюдающиеся только в микроокружении ХЛЛ, и влияют на распределение и функцию Т-клеток. В свою очередь, микроокружение обеспечивает жизнеспособность лейкозных клеток, поскольку выключение этого взаимодействия приводит к их гибели. Сегодня это не только лабораторный феномен. Выключение сигнальных путей, определяющих взаимодействие клеток ХЛЛ с клетками окружения, является частью механизма действия ингибиторов пути B-клеточного рецептора (BCR), активно применяемых в клинической практике [1-3].
Влияние клеток ХЛЛ на микроокружение приводит к развитию иммунодефицита, который наблюдается у всех пациентов с ХЛЛ и имеет разную степень выраженности. Этот иммунодефицит, в частности, подтверждается по гипогаммаглобулинемии, которая обнаруживается у 85 % больных [4]. Частота и степень гипогаммаглобулинемии зависят от давности болезни. Влияние ХЛЛ на Т-клеточный компартмент (область) значительно сложнее. В крови число Т-клеток у больных ХЛЛ обычно повышено за счет увеличения клеток CD8+. Напротив, в лимфатических узлах и костном мозге повышено число клеток CD4+. Несмотря на увеличение количества Т-клеток, они характеризуются глубоким дефектом функции (слабый ответ на митогены, аберрантная экспрессия молекул адгезии и активации, осла-
бленное образование иммунных синапсов, аберрантный профиль секреции цитокинов со сдвигом в сторону Th2-ответа). Предполагается, что эти изменения помогают опухолевому клону избегать иммунного ответа [5, 6].
Одним из способов характеристики иммунодефицита может оказаться количественная оценка содержания эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (TREC, T-cell Receptor Excision Circle) и к-делеционного элемента (KREC, Kappa-deleting Recombination Excision Circle) В-клеток. TREC представляют собой внехромо-сомные кольцевые эксцизионные продукты реаранжи-ровки генов Т-клеточного рецептора (TCR) в процессе соматической рекомбинации ДНК, которая происходит по мере созревания Т-лимфоцитов в тимусе. TREC формируются в DN4-тимоцитах (двойных негативных) на этапе перестройки гена а-цепи TCR при рекомбинации элементов 5Rec и ^Ja с последующим удалением ло-куса TCR5. TREC определяются в тимоцитах и зрелых наивных Т-лимфоцитах, только что покинувших тимус (RTE, recent thymic emigrants) [7, 8]. Схематическое изображение формирования TREC представлено на рис. 1.
Аналогичен механизм формирования KREC в пре-В-лимфоцитах на этапе Уф^-рекомбинации генов легких цепей иммуноглобулинов (IGK и IGL). После реаранжи-ровки генов тяжелых цепей иммуноглобулинов запускается VJ-перестройка IGK-локуса. Если она оказывается непродуктивной, происходит рекомбинация между делеционным элементом IGK (IGKDEL) и одной из вышележащих рекомбинационных сигнальных последовательностей (RSS, recombination signal sequences), которая отключает аллель IGK и приводит к формированию эксцизионного кольца — KREC [9]. Схематическое изображение формирования KREC представлено на рис. 2.
Общая схема формирования TREC и KREC показана на рис. 3. TREC и KREC не реплицируются в процессе периферической экспансии; их относительное содержание в клеточной популяции падает по мере деления клеток. Количественное определение TREC и KREC применяется для оценки репертуара TCR и BCR
при диагностике первичных иммунодефицитов (различные формы тяжелой комбинированной иммунной недостаточности [10], агаммаглобулинемии [11]), мониторинге иммунореконституции после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток [12], а также при мониторинге эффективности антиретро-вирусной терапии у больных с ВИЧ-инфекцией [13].
Цель настоящей работы — количественное определение ТЯЕС и КЯЕС методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для оценки антигенного репертуара Т- и В-клеток у больных В-ХЛЛ с различными цитогенетическими и молекулярно-ге-нетическими аномалиями, а также для определения их прогностической значимости.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 109 пациентов с В-ХЛЛ в возрасте 56-60 лет перед началом терапии по протоколу FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб) и 16 условно здоровых лиц 59-77 лет без острых воспалительных, аутоиммунных, гематологических и онкологических заболеваний в качестве контрольной группы. Все пациенты, принявшие участие в исследовании, дали письменное согласие на участие.
Обследование пациентов с ХЛЛ включало цитогене-тические и молекулярно-генетические исследования на предмет выявления хромосомных аберраций (делеции 13q14, 11q23 и 17р, трисомии 12) и мутаций генов IGHV, TP53, NOTCH1, SF3B1. Клинически оценивали стадию заболевания по Binet и исходы лечения. Количественная оценка TREC и KREC выполнена методом ПЦР в реальном времени («БиТ-тест», Новосибирск, РФ [14]). Экстракцию ДНК из цельной крови проводили с помощью комплекта реагентов «АмплиПрайм РИБО-преп» (ООО «НекстБио»). Объем клинического материала для экстракции ДНК составлял 100 мкл, элюцию также проводили в 100 мкл РНК-буфера. Для количественной оценки молекул TREC и KREC использовали ПЦР в режиме реального времени с условиями, описанными в инструкции к набору реагентов. Программа амплификации включала стадию активации Taq-полимеразы в течение 15 мин при температуре 95° С, затем 45 циклов: 95° С — 10 с, 61° С — 30 с, 72° С — 15 с с детекцией флюоресцентного сигнала на стадии гибридизации праймеров. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (Bio-rad). Количество копий TREC (KREC) рассчитывали на 105 ядросодержащих клеток (лейкоцитов) с учетом внутреннего контроля IL17RA по формуле:
Количество TREC (KREC) = [число копий TREC (KREC) на 1 мл / число копий IL17RA х (1 - доля клеток ХЛЛ)] х 200 000.
Статистическая обработка данных проводилась с помощью программного обеспечения SPSS 19 (IBM, США). Рассчитаны медианы, межквартильные интервалы, средние значения и доверительный интервал для средних: хср ± Z х а / —n (p = 0,05). Значимость различий средних величин оценивали на основании t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони; медиан — на основании [/-критерия Манна—Уитни.
Va V61 Va ÔRec V62-D62-J61 J6 C6 VÔ3 ipJa Ja Ca
-Q-O -0-{5"-LHI<|{}<>j»fl-i>
1................
Va Vôl Va ÔRec ipJa Ja Ca
"□"О -Q--D -СКВ^М- "О" + ^ TREC
........... 1
Va Vôl Va Ca T
■a -o -OOCD--0 +
Кодирующий сегмент Va-Ja
Рис. 1. Формирование TREC (цит. по [14]). Рекомбинация ДНК происходит при объединении V-, D-, J-сегментов и осуществляется комплексом рекомбиназ. Рекомбиназы «узнают» последовательности, фланкирующие каждый из сегментов V, D, J (так называемые рекомбинационные сигнальные последовательности — RSS). Рекомбиназы расщепляют ДНК между гептамером и окончанием кодирующей последовательности нужного гена; вычленяется сигнальный сегмент (SJ) V-D и формируется функциональный экзон V(D)J. RSS, находящиеся на концах сегмента V-D, соединяются друг с другом, что приводит к формированию внехромосомного циркулярного эксцизионного продукта (TREC)
Fig. 1. The formation of TREC (adapted from [14]). DNA recombination is performed by recombinases and involves the fusion of V, D, and J gene segments. Recombinases recognize the sequences at both sides of V, D, and J gene segments (so called recombination signal sequences — RSS). Recombinases split the DNA between the heptamer and terminal gene sequences with the formation of signal segment (SJ) V-D and functional V(D)J exon. RSS at the ends of the V-D segment fuse together, which results in the extrachromosomal T-cell receptor excision circle (TREC)
Vk Vk Vk Vk Vk Jk iEk Ck 3'Ek Kde
-□-□^^^□-^ссю- -O--
I
Vk Vk Vk Jk iEk Ck 3'Ek Kde
............Г
Vk Vk Vk Jk Kde
ОСШМ +
Интрон RSS — к-делеционный элемент, кодирующий сегмент
Интрон RSS — к-делеционный элемент, сигнальный сегмент
Рис. 2. Формирование KREC (цит. по [14]). Кодирующая ДНК для вариабельной части каждой из цепей иммуноглобулина собирается из сегментов, извлекаемых из отдельных V-, D- и J-кластеров. Формирование KREC происходит после ре-аранжировки гена тяжелой цепи при неэффективной реаран-жировке генов IGK-локуса (в одном или обоих аллелях). Нефункциональный IGK-локус подвергается делеции в составе к-делеционного элемента, включающего C-, V- и J-фрагменты. к-делеционный элемент взаимодействует c рекомбинационны-ми сигнальными последовательностями (RSS) благодаря работе рекомбиназ; формируется функциональный кодирующий фрагмент (CJ) и кольцевая сигнальная (SJ) некодирующая последовательность (KREC)
Fig. 2. The formation of KREC (adapted from [14]). The coding DNA for the variable regions of each immunoglobulin chain is formed from the V-, D-, and J-clusters. The KREC results from the ineffective rearrangement of IGK-locus in the heavy-chain gene (in one or both alleles). Nonfunctional IGK-locus is deleted as part of к-deleting element, which includes C, V, and J gene fragments. Kappa-deleting element interacts with recombination signal sequences (RSS) by means of recombinase activity. This interaction results in functional coding fragment (CJ) and circular signal (SJ) non-coding sequence (KREC)
Тимус
Ранний предшественник Т-клетки
Про-Т
Пролиферация и созревание внутри тимуса
Двойные позитивные Т-клетки
Периферическая клональная экспансия Т- и В-клеток и снижение относительного содержания TREC и KREC в популяции
Костный мозг
Большая Малая Перестройка гена к-цепи ВС11 Незрелая пре-В пре-В и формирование ШС В-клетка
(синее кольцо)
Переходная В-клетка
Рис. 3. Общая схема формирования TREC и KREC
Fig. 3. General pattern of TREC and KREC formation
РЕЗУЛЬТАТЫ
В группе пациентов с ХЛЛ среднее содержание ТЯЕС составило 1533 ± 499 копий (медиана 525 копий), КЯЕС — 1684 ± 560 копий. Средний уровень ТЯЕС в контрольной группе значимо не отличался от такового у больных ХЛЛ и был равен 1503 копиям. Напротив, средний уровень КЯЕС оказался статистически значимо (р < 0,001) выше и составил 19 009 ± 9313 копий (рис. 4, табл. 1).
Мутационный статус генов ЮИУ определен у 77 пациентов. У 28 (33,8 %) человек диагностирован вариант с мутациями ЮИУ-генов, у 51 (66,2 %) — вариант без мутаций ЮИУ-генов. У больных с мутациями среднее содержание ТЯЕС составило 1824 ± 792 копии, что статистически значимо (р < 0,05 для £>критерия и р < 0,1 для [/-критерия) выше по сравнению с группой пациентов без мутаций (1427 ± 613 копий) (рис. 5).
Делеция 13q14 выявлена у 53 (48,6 %) из 109 обследованных больных; из них в сочетании с делецией 1^23 — у 8 (15,1 %), с трисомией 12 — у 1 (1,9 %), с делецией 17р — у 4 (7,5 %). Кроме того, del(13q14) сочеталась с мутациями БР3Б1 и ЫОТСИ1 в 7 (13,2 %) случаях каждая, с мутацией ТР53 — в 6 (11,3 %). Среднее содержание ТЯЕС и КЯЕС у больных с del(13q14) составило 1440 ± 627 и 1457 ± 682 копии соответственно и статистически значимо не отличалось от такового у пациентов без аномалии (1225 ± 462 копии ТЯЕС и 2003 ± 505 копий КЯЕС). Доля клеток ХЛЛ с делецией составила 80,5 ± 5,4 %. Следует отметить, что выявлена статистически значимая (р < 0,05) слабая обратная взаимосвязь (п = -0,21) между долей клеток с del(13q14) и количеством ТЯЕС. Это свидетельствует о сокращении антигенного репертуара ТСЯ при увеличении количества клеток с del(13q14). Корреляции между количеством КЯЕС и содержанием del(13q14) не выявлено.
50000 -
40000
30000 -
20000 -
10000
0
Контрольная группа, n = 16
n = 109
Рис. 4. Содержание KREC у больных ХЛЛ и в контрольной группе Fig. 4. KREC levels in CLL patients and healthy controls
Таблица 1. Уровень TREC и KREC у больных ХЛЛ и в контрольной группе
Больные ХЛЛ, Контрольная группа,
n = 109 n = 16
TREC KREC TREC KREC
1-й квартиль 15 0 46 8338
Медиана 525 390 630 15 019
3-й квартиль 2034 1871 871 28 001
Межквартильный 2019 1871 826 19 664
интервал
Среднее 1565 1475 1503 19 009
Доверительный 1021-2107 943-2008 0-3995 8052-29 966
интервал ф = 0,05)
8000-
6000-
" 4000-
2000-
р = 0,026
Немутантный, n = 51
Мутантный, n = 28
10000-
8000-
6000-
4000-
2000
р = 0,066
Del11q23 n = 76
Del11q23 (+), n = 20
Рис. 5. Содержание TREC у больных ХЛЛ с мутациями и без них Рис. 6. Содержание TREC у пациентов с делециеи 11q23 и без нее
Fig. 5. TREC levels in patients with mutated and unmutated CLL
Fig. 6. TREC levels in patients with and without 11q23 deletion
к
»
»
0
0
У 20 (18,3 %) пациентов обнаружена делеция 1^23. В одном наблюдении del(11q23) сочеталась с трисо-мией 12. Из тестируемых молекулярно-генетических нарушений в этой группе выявлено 2 (10 %) случая мутации БР3Б1 и 3 (15 %) — мутации ЫОТСИ1. Мутации ТР53 не определялись. Средний уровень ТЯЕС в группе с del(11q23) составил 550 ± 380 копий, что статистически значимо (р = 0,066) ниже, чем в общей группе (рис. 6). Количество КЯЕС в общих группах с del(11q23) и без нее значимо не различалось и составило 2705 ± 1765 и 1522 ± 615 копий соответственно. Доля клеток с del(11q23) составила 76,3 ± 10,6 %, корреляции между количеством ТЯЕС и КЯЕС не выявлены. Таким образом, можно сделать вывод о том, что наличие del(11q23) связано с угнетением продукции наивных Т-клеток тимусом, однако увеличение количества аберраций в клетках ХЛЛ не приводит к усилению данного эффекта.
Трисомия 12 выявлена в 13 случаях (11,9 % общей выборки), 5 (38,5 %) из которых сопровождались мутацией ЫОТСИ1. Уровень ТЯЕС в группе пациентов с трисомией 12 составляет в среднем 2038 ± 1292 копии, что превосходит значение показателя в группе без три-сомии 12 (1216 ± 412 копий), однако это различие статистически незначимо. Количество КЯЕС в указанных группах составляет 1377 ± 1238 и 1785 ± 670 копий соответственно. Содержание клеток с трисомией 12 в исследуемой группе составило 69,5 ± 11,7 %. Как и в случае с делецией 1^23, корреляции между содержанием клеток с трисомией 12 и количеством эксцизионных колец не обнаружены.
Делеция 17р выявлена у 9 (8,3 %) из 109 больных. Медиана содержания ТЯЕС и КЯЕС в группе пациентов с del(17р) равна 613 и 0 копий соответственно. Содержание клеток с делецией составило 67,7 ± 22,6 %, причем выявлена отрицательная корреляция средней степени между числом клеток с делецией и уровнем ТЯЕС (п = -0,38; р < 0,1). Это говорит о подавлении продукции наивных Т-клеток в тимусе и сокращении антигенного репертуара ТСЯ при увеличении количества клеток с del(17р) при ХЛЛ. Мутации ТР53 обнаружены у 8 (88,9 %) из 9 больных с del(17р). В 1 (11,1 %) наблюдении del(17р) сочеталась с мутацией ЫОТСИ1.
20 000
о 15000'
10000-
5000-
NOTCH1 n = 71
NOTCH1 (+), n = 17
Рис. 7. Содержание KREC у пациентов с мутациями NOTCH1 и без них
Fig. 7. KREC levels in patients with and without NOTCH1 mutations
Мутации БР3Б1 выявлены у 14 (12,8 %) из 109 пациентов. В группе с мутациями медиана количества эксцизионных колец составляет 340 копий ТЯЕС и 348 копий КЯЕС, что статистически значимо не отличается от показателя в общей группе без мутаций (439 копий ТЯЕС и 328 копий КЯЕС). Это свидетельствует об отсутствии влияния мутации БР3Б1 в лей-козных клетках на продукцию наивных Т- и В-клеток тимусом и костным мозгом. В 1 (7,1 %) наблюдении мутация БР3Б1 сопровождалась мутацией ЫОТСИ1. Мутации ТР53 в группе с БР3Б1 не зарегистрированы.
Из 109 обследованных больных мутации ЫОТСИ1 выявлены в 17 (15,6 %) случаях. Медиана уровней ТЯЕС и КЯЕС в этой группе составила 92 и 116 копий соответственно. Среднее содержание КЯЕС значимо (р < 0,05 для £:-критерия) выше по сравнению с группой пациентов без мутаций ЫОТСИ1 (рис. 7). В 1 (5,9 %) наблюдении мутация ЫОТСИ1 сопровождалась мутацией ТР53.
0
10 000 -
■г 8000
6000
4000 -
2000
Стадия A, n = 11
Стадия B, n = 76
Стадия C, n = 22
20 000
2 15 000
S 10000
5000
р = 0,182 ■
р = 0,i
р = 0,(
Стадия A, n = 11
Стадия B, n = 76
Стадия C, n = 22
Рис. 8. Содержание TREC и KREC у больных с различными стадиями ХЛЛ по Binet
Fig. 8. TREC and KREC levels in patients with different Binet stages of CLL
Мутации ТР53 выявлены у 11 (10 %) больных. Средний уровень ТЯЕС и КЯЕС в этой группе пациентов значимо не отличался от такового в общей группе без мутаций ТР53 и составил 1025 и 3244 копии соответственно. Сводные данные по цитогенетическим и молекулярным аномалиям представлены в табл. 2.
При клинической оценке активности ХЛЛ (рис. 8) стадия А установлена у 11 (10 %) больных, стадия В — у 76 (69,7 %) и С—у 22 (20,3 %). Медианы содержания экс-цизионных колец составили 613 копий ТЯЕС и 52 копии КЯЕС при стадии А, 580 копий ТЯЕС и 547 копий КЯЕС при стадии В и 176 копий ТЯЕС и 3 копии КЯЕС при стадии С, причем снижение содержания ТЯЕС и КЯЕС, сопровождающее стадию С, оказалось статистически значимым (р < 0,1 для ¿-критерия и [/-критерия).
Мы также оценили содержание эксцизионных колец при различных клинических исходах после проведения специфического лечения (рис. 9). Все пациенты получили в среднем 5 циклов по протоколу РСЯ. При этом отсутствие ответа наблюдалось в 16 случаях. Медиана содержания ТЯЕС и КЯЕС в группе с отсутствием ответа оказаласьравна259 и 0 копий соответственно. Частичная ремиссия достигнута у 29 больных. Еще у 11 пациентов констатирована частичная ремиссия с минимальной остаточной болезнью (МОБ). Медиана содержания ТЯЕС в этих группах составила соответственно 219 и 335 копий; КЯЕС — 380 и 433 копии. Полная ремиссия, наблюдавшаяся у 36 больных, сопровождалась наиболее высоким уровнем ТЯЕС (среднее значение 2089 ± 768 копий, медиана 1242 копии), что статистически значимо выше по сравнению с показателем в группах с отсутствием ответа (р < 0,01 для ¿-критерия и р < 0,1 для ^-критерия) и с частичной ремиссией (р < 0,05 для ¿-критерия и р < 0,01 для [/-критерия). Наличие МОБ на фоне полной ремиссии, зарегистрированное у 4 пациентов, также коррелировало со значимым (р < 0,001 для ¿-критерия и р < 0,05 для [/-критерия) снижением числа ТЯЕС (медиана 53 копии). Медианы КЯЕС в группах полной ремиссии с МОБ и без нее составили 619 и 824 копии соответственно. До начала специфической терапии от пневмонии умерло 2 пациента; у одного из них эксцизи-
10000-
8000-
6000-
4000-
р < 0,001
2000- --
ЛХшМ
нет ответа, ЧР, ЧР + МОБ, ПР ПР + МОБ, ранняя смерть, n = 16 n = 29 n = 11 n = 36 n = 4 n = 2
Рис. 9. Содержание TREC у больных ХЛЛ с различным исходом МОБ — минимальная остаточная болезнь; ПР — полная ремиссия; ЧР — частичная ремиссия.
Fig. 9. TREC levels in CLL patients with different clinical outcomes МОБ — minimal residual disease; ПР — complete remission; ЧР — partial remission.
онные кольца отсутствовали вовсе, у другого — уровень ТЯЕС составил 17 копий, КЯЕС — 219 копий. Содержание эксцизионных колец в группах с различными клиническими характеристиками представлено в табл. 3.
ЯОС-анализ (рис. 10) подтвердил прогностическую значимость ТЯЕС в контексте возможности достижения полной ремиссии без МОБ: площадь под кривой для ТЯЕС составила 0,713 (р = 0,001), для КЯЕС — 0,556 (р = 0,376).
ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе мы исследовали содержание ТЯЕС и КЯЕС в группе первичных больных ХЛЛ, имеющих показания к началу терапии. Мы показываем, что по
0
0
Таблица 2. Уровни ТРЕС и КРЕС в группах с различными цитогенетическими и молекулярными аномалиями
ТРЕО КРЕО ТРЕО КРЕО
ХЛЛ с мутациями, п = 28 ХЛЛ без мутаций, п = 58
1-й квартиль 134 0 0 0
Медиана 640 595 219 259
3-й квартиль 2577 1809 929 788
Межквартильный интервал 2443 1809 929 788
Среднее 1824 974 1427 1940
Доверительный интервал (р = 0,05) 1032-2616 585-1363 814-2040 1206-2674
Ое! ^14 (-), П = 51 Ое! ^14 (+), п = 53
1-й квартиль Медиана 0 449 0 142 0 252 0 540
3-й квартиль 1520 1120 1164 1522
Межквартильный интервал 1520 1120 1164 1522
Среднее 1225 2003 1440 1457
Доверительный интервал (р = 0,05) 763-1687 1498-2508 813-2067 775-2139
Ое! 1^23 (-), П = 85 Ое! 11q23 (+), п = 20
1-й квартиль 8 0 0 0
Медиана 457 378 112 322
3-й квартиль 1577 1176 879 2128
Межквартильный интервал 1569 1176 879 2128
Среднее 1754 1522 550 2705
Доверительный интервал (р = 0,05) 1128-2380 907-2137 170-930 940-4470
ТГ1Б 12 (-), п = 92 ТИБ 12 (+), п = 11
1-й квартиль 0 0 132 0
Медиана 274 377 542 381
3-й квартиль 1227 1577 2113 833
Межквартильный интервал 1227 1577 1982 833
Среднее 1216 1785 2038 1377
Доверительный интервал (р = 0,05) 804-1628 1115-2455 746-3330 139-2615
Ое! 17р (-), п = 100 Ое! 17р (+), п ■ = 9
1-й квартиль 16 0 0 0
Медиана 516 433 613 0
3-й квартиль 2012 2019 2413 784
Межквартильный интервал 1996 2019 2413 784
Среднее 1534 1585 1517 2966
Доверительный интервал (р = 0,05) 978-2090 1008-2162 289-2745 0-6548
SF3B1 (-), П = 81 SF3B1 (+), п = 14
1-й квартиль 13 0 8 2
Медиана 439 328 340 348
3-й квартиль 1598 1248 1257 2387
Межквартильный интервал 1585 1248 1250 2386
Среднее 1494 1794 1005 1047
Доверительный интервал (р = 0,05) 1004-1984 1053-2535 176-1834 305-1789
NOTCH1 (-), П ■ = 77 NOTCH1 (+), П = 17
1-й квартиль 49 0 0 0
Медиана 457 380 92 116
3-й квартиль 1645 1577 618 828
Межквартильный интервал 1596 1577 618 828
Среднее 1643 1425 922 3128
Доверительный интервал (р = 0,05) 1041-2245 835-2015 131-1713 951-5305
TP53 (-), П = ; 84 TP53 (+), п = 11
1-й квартиль 16 0 0 0
Медиана 437 378 661 0
3-й квартиль 1308 1600 2279 1119
Межквартильный интервал 1291 1600 2279 1119
Среднее 1566 1545 1025 3244
Доверительный интервал (р = 0,05) 1008-2124 988-2102 327-1723 132-6356
Таблица 3. Уровни TREC и KREC в группах больных ХЛЛ с различными клиническими характеристиками
TREC_KREC_TREC_KREC_TREC_KREC
Стадия А, n = 11 Стадия B, n = 76 Стадия C, n = 22
1-й квартиль 183 0 41 0 0 0
Медиана 613 52 580 547 176 3
3-й квартиль 2291 2443 2423 1928 1614 1023
Межквартильный интервал 2108 2443 2382 1928 1614 1023
Среднее 1163 2306 1580 1861 1713 605
Доверительный интервал (р = 0,05) 272-2054 0-6172 1047-2113 991-2168 0-3502 121-1089
Нет ответа, n = 16 Частичная ремиссия, n = 29 Частичная ремиссия + МОБ, n = 11
1-й квартиль 44 0 0 16 15 3
Медиана 259 0 219 380 335 433
3-й квартиль 1140 210 902 2420 2681 2247
Межквартильный интервал 1096 210 902 2404 2666 2244
Среднее 583 546 843 1346 1271 1134
Доверительный интервал (р = 0,05) 0-1226 0-1745_304-1382_531-2161_0-2558_139-2128
_Полная ремиссия, п = 36 Полная ремиссия + МОБ, п = 4 Ранняя смерть, п = 2_
1-й квартиль 424 0 0 0 0 0
Медиана 1242 619 53 824 9 109
3-й квартиль 2677 1545 596 2350 Нет данных Нет данных
Межквартильный интервал 2253 1545 596 2350 Нет данных Нет данных
Среднее 2089 1599 216 1058 9 109
Доверительный интервал (p = 0,05) 1271-2906 668-2529_0-798_0-3095_0-120_0-3095
1,0
0,8л
I-
и
о s •а
5 0,6-
Is ей
I-
и
ей ^
0,4-
0,2
0
Рис. 10. ROC-кривые. В качестве положительного события выбрано достижение полной ремиссии без МОБ AUC — площадь под кривой.
Fig. 10. ROC curves. Achievement of complete remission without MRD was chosen as a positive event AUC — area under curve.
сравнению с контрольной группой лиц, не страдающих онкогематологическими и аутоиммунными заболеваниями, у больных ХЛЛ наблюдается существенное снижение числа эксцизионных колец, образующихся во время У(0)]-рекомбинации IGHV. Эти данные подтверждают наблюдение M. Motta и соавт. [15] о снижении интенсивности продукции наивных В-клеток у пациентов с ХЛЛ.
Резюмируя полученные данные, можно выделить две группы факторов, связанных с количеством эксцизионных колец TCR и BCR как индикаторов их
антигенного репертуара. Эти факторы характеризуют функциональную активность тимуса и костного мозга, с одной стороны, и воздействие лейкозных клеток — с другой. Со стороны клеток ХЛЛ к таким факторам, согласно нашим данным, относится мутационный статус ЮИУ, делеции 1^23, а также мутации ЫОТСИ1. При этом немутантные гены ЮИУ и del(11q23), ассоциированные с менее благоприятным клиническим прогнозом, связаны с угнетением процесса У(Э)]-рекомбинации в созревающих наивных Т-клетках. Вариант ХЛЛ с мутациями ЮИУ-генов, напротив, характеризуется более высоким уровнем ТЯЕС, что свидетельствует о меньшей степени дисфункции Т-клеток и большем антигенном репертуаре ТСЯ при прогностически более благоприятном варианте ХЛЛ. Полученные данные доказывают роль дисфункции Т-клеточного звена в патогенетическом эффекте обозначенных внутриклеточных событий при ХЛЛ. Эта дисфункция может быть обусловлена формированием патологических клонов Т-клеток [16].
Вторая группа факторов, воздействующих на функциональную активность тимуса, включает возраст и сопутствующие заболевания. Пожилой возраст сам по себе является неблагоприятным прогностическим фактором ХЛЛ. Пожилые пациенты обычно страдают большим количеством сопутствующих заболеваний, препятствующих проведению интенсивного лечения [17]. Доказано снижение числа ТЯЕС, сопровождающее уменьшение разнообразия репертуара Т-клеток, по мере увеличения возраста здоровых лиц, включенных в исследование [18]. В обследованной нами общей выборке больных ХЛЛ подтверждена обратная взаимосвязь между содержанием ТЯЕС и возрастом пациентов (п = -0,35; р < 0,01), которая оказалась еще сильнее в однородной группе пациентов со стадией В (п = -0,41; р < 0,01). В связи с этим правомерно утверждать, что со-
1-специфичность
Хемокины
Рис. 11. Концептуальная схема взаимодействия ХЛЛ и центральных иммунных органов Н-ХЛЛ — немутантный ХЛЛ.
Fig. 11. Conceptual scheme of interactions between CLL and central immune organs Н-ХЛЛ — unmutated CLL.
краш,ение широты репертуара ТСЯ с возрастом служит одним из неблагоприятных факторов у больных ХЛЛ.
Полученные результаты позволяют предложить концептуальную схему патологического взаимодействия лейкозного клона с Т- и В-клетками организма-хозяина (рис. 11). Так, выживание и пролиферация клеток ХЛЛ реализуются клетками ниши, обменивающимися с опухолевой клеткой сигналами в форме ци-токинов и хемокинов. Контроль над заболеванием и достижение стойкой ремиссии обеспечиваются благодаря уничтожению клеток ХЛЛ Т-цитотоксическими лимфоцитами и подавлению протективного влияния клеток ниши Т-хелперами. При этом эффективная работа Т-клеточного звена возможна только при наличии широкого антигенного репертуара ТСЯ. Сужение антигенного репертуара происходит как из-за дефицита функции тимуса, обусловленного возрастом, так и вследствие формирования патологических функционально неполноценных Т-клеточных клонов за счет воздействия лейкозных клеток, несущих нему-тантные гены ЮИУ или делеции 1^23. В результате происходит ослабление противоопухолевого иммунного надзора и, как следствие, уход лейкозного клона от иммунного ответа, проявляющийся в виде полной или частичной рефрактерности к лечению либо пер-систирования МОБ. Подавление созревания полноценных наивных В-клеток в костном мозге вносит дополнительный вклад в развитие инфекционных осложнений у больных ХЛЛ, также способствующих сокращению антигенного репертуара ТСЯ.
Таким образом, антигенный репертуар Т-клеток представляет интерес как прогностический фактор при ХЛЛ, поскольку является комплексным индикатором воздействия лейкозных клеток и факторов пациента. Это подтверждается нашими данными о повышенном содержании ТЯЕС у больных, достигших полной ремиссии после лечения по схеме РСЯ, а также результатами ЯОС-анализа.
Возможность прогностического использования КЯЕС пока находится под вопросом. Не выявлено взаимосвязи ни с клиническими данными, ни с большинством лабораторных показателей. Отмеченное расширение репертуара ВСЯ при наличии мутаций ЫОТСИ1 требует
дальнейшего исследования. Однако обнаружено значительное сужение репертуара В-клеток у больных ХЛЛ в общей группе, что может быть следствием как подавления продукции нормальных В-клеток, так и их клональной периферической пролиферации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные результаты демонстрируют взаимосвязь между содержанием эксцизионных колец и прогностическими клинико-лабораторными факторами ХЛЛ. Неблагоприятные факторы прогноза, включающие мутантный статус ЮИУ-генов, наличие делеции 1^23, а также увеличение содержания клеток ХЛЛ с деле-циями 13q14 и 17р, связаны с уменьшением количества ТЯЕС. Кроме того, стадия С по Вте1; сопровождается статистически значимым сокращением содержания как ТЯЕС, так и КЯЕС. Выявленная ассоциация между содержанием ТЯЕС и достижением полной ремиссии дает возможность использовать предлагаемый анализ для раннего прогнозирования эффекта терапии.
КОНФЛИКТЫ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ
Исследование не имело спонсорской поддержки.
ВКЛАД АВТОРОВ
Концепция и дизайн: И.В. Образцов. Сбор и обработка данных: И.В. Образцов, М.А. Горду-кова, Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, С.Ю. Смирнова. Предоставление материалов исследования: И.В. Образцов, М.А. Гордукова, Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, С.Ю. Смирнова, Е.А. Никитин.
Анализ и интерпретация данных: И.В. Образцов, Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, С.Ю. Смирнова. Подготовка рукописи: И.В. Образцов, А.Б. Судариков, Е.А. Никитин.
Окончательное одобрение рукописи: А. Б. Судариков, Е.А. Никитин.
Административная поддержка: А.Г. Румянцев.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают искреннюю признательность академику РАН, д-ру мед. наук, профессору А.Г. Румянцеву за неоценимую помощь в проведении исследования и подготовке статьи.
flMTEPATyPA/REFERENCES
1. Rai KR, Jain P. Chronic lymphocytic leukemia (CLL)-Then and now. Am J Hematol. 2016;91(3):330-40. doi: 10.1002/ajh.24282.
2. Nicholas NS, Apollonio B, Ramsay AG. Tumor microenvironment (TME)-driven immune suppression in B cell malignancy. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(3):471-82. doi: 10.1016/j.bbamcr.2015.11.003.
3. Ohshima K. Molecular Pathology of Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma. Oncology. 2015;89(Suppl 1):7-15. doi: 10.1159/000431058.
4. Best OG, Crassini K, Freeman JA, Mulligan SP; CLL Australian Research Consortium. The clinical significance of hypogammaglobulinaemia and serum immunoglobulin G subclass deficiency in patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Scand J Infect Dis. 2013;45(9):729. doi: 10.3109/00365548.2013.809477.
5. Riches JC, Gribben JG. Understanding the immunodeficiency in chronic lymphocytic leukemia: potential clinical implications. Hematol Oncol Clin North Am. 2013;27(2):207-35. doi: 10.1016/j.hoc.2013.01.003.
6. Davis JE, Ritchie DS. The passive-aggressive relationship between CLL-B cells and T cell immunity. Leuk Res. 2014;38(10):1160-1. doi: 10.1016/j. leukres.2014.08.005.
7. Toubert A, Glauzy S, Douay C, et al. Thymus and immune reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in humans: never say never again. Tissue Antigens. 2012;79(2):83-9. doi: 10.1111/j.1399-0039.2011.01820.x.
8. Pai S-Y. The Immune Response. In: Nathan and Oski's Hematology of Infancy and Childhood. Philadelphia: Elsevier; 2009. pp. 1221-53.
9. Mensen A, Ochs C, Stroux A, et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Transl Med. 2013;11(1):188. doi: 10.1186/1479-5876-11-188.
10. Ravkov E, Slev P, Heikal N. Thymic output: Assessment of CD4+ Recent Thymic Emigrants and T-Cell Receptor Excision Circles in Infants. Cytometry B Clin Cytom. 2015. doi: 10.1002/cyto.b.21341. [Epub ahead of print]
11. de Felipe B, Olbrich P, Lucenas JM, et al. Prospective neonatal screening for severe T- and B-lymphocyte deficiencies in Seville. Pediatr Allergy Immunol. 2016;27(1):70-7. doi: 10.1111/pai.12501.
12. Politikos I, Kim HT, Nikiforow S, et al. IL-7 and SCF Levels Inversely Correlate with T Cell Reconstitution and Clinical Outcomes after Cord Blood Transplantation in Adults. PLoS One. 2015;10(7):e0132564. doi: 10.1371/journal.pone.0132564.
13. Drylewicz J, Vrisekoop N, Mugwagwa T, et al. Reconciling Longitudinal Naive T-Cell and TREC Dynamics during HIV-1 Infection. PLoS One. 2016;11(3):e0152513. doi: 10.1371/journal.pone.0152513.
14. Гордукова М.А., Оскорбин И.П., Мишукова О.В. и др. Разработка набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени. Медицинская иммунология. 2015;17(5):467-78. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478.
[Gordukova MA, Oskorbin IP, Mishukova OV, et al. Development of real-time multiplex PCR for the quantitative determination of TREC's and KREC's in whole blood and in dried blood spots. Medical Immunology (Russia). 2015;17(5):467-78. doi: 10.15789/1563-0625-2015-5-467-478. (In Russ)]
15. Motta M, Chiarini M, Ghidini C, et al. Quantification of newly produced B and T lymphocytes in untreated chronic lymphocytic leukemia patients. J Transl Med. 2010;8(1):111. doi: 10.1186/1479-5876-8-111.
16. Holler C, Zaborsky N, Pinon-Hofbauer J, et al. Diversity of T-Cell Repertoire Predicts Disease Progression in Chronic Lymphocytic Leukaemia. Clin Lymph Myel Leuk. 2011;11(Suppl 2):S212. doi: 10.1016/j.clml.2011.09.111.
17. Никитин Е.А. Особенности пациентов с хроническим лимфолейкозом в России — данные Российского регистра больных онкогематологическими заболеваниями. Материалы XII Российской конференции с международным участием «Злокачественные лимфомы». М., 2015. С. 20.
[Nikitin EA. Characteristics of patients with chronic lymphocytic leukemia in Russia: data from the Russian register for patients with oncohematological diseases. Proceedings of 12th Russian Conference with International Participation 'Malignant lymphomas'. Moscow; 2015. pр. 20. (In Russ)]
18. Zubakov D, Liu F, van Zelm MC, et al. Estimating human age from T-cell DNA rearrangements. Curr Biol. 2010;20(22):R970-1. doi: 10.1016/j.cub.2010.10.022.
