Экстраокулярные мышцы mdx-мышей как мишень для клеточной терапии: гистологическая характеристика с использованием компьютерного морфометрического анализа Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

I I I I I

Ш

Экстраокулярные мышцы mdx-мышeй как мишень для клеточной терапии: гистологическая характеристика с использованием компьютерного морфометрического анализа

C.Э. Аветисов 1, А.С. Павлюк12, М.А. Стенина 2, А.А. Федоров1, Л.П. Кривов 2,

Д.С. Николаенко 1, П.Ю. Баранов 1, А.М. Суббот1, А.И. Тухватулин1

1 ГУ НИИ глазных болезней РАМН, Москва

2 Российский государственный медицинский университет, Москва

Extraocular muscles of mdx-mice as a target for cellular therapy: the histological characteristic with use computer morphometrical analysis

S.E. Avetisov1, A.S. Pavliuk 12, M.A. Stenina 2, A.A. Fedorov1, L.P. Krivov 2,

D.S. Nikolaenko 1, P.Yu Baranov1, A.M. Subbot1, A.I. Tuhvatulin 1

1 Research Institute of Eye Diseases RAMS, Moscow

2 Staat Medical University of Russia, Moscow

В исследовании методами компьютерной морфометрии и статистического анализа показано наличие процессов дегенерации и регенерации в экстраокулярных мышцах тёх-мышей, подобраны критерии сравнения степени дегенерации, на основании чего предложено использовать экстраокулярные мышцы тёх-мышей в качестве модели миодегенеративных процессов глазодвигательных мышц человека для экспериментальных разработок и оценки эффективности клеточной и генной терапии.

Ключевые слова: т^х-мыши, экстраокулярные мышцы, биологическая модель, морфометрия.

Using computer-assisted morphometrycal analysis we show degeneration and regeneration processes in mdx-mouse extraocular muscles. We've also selected statistical criteria for assessment of degeneration rate. Thus we suggest to use mdx-mouse extraocular muscles as experimental bioilogical model of myodegenerative processes in human extraocular muscles in search, development and effectiveness assessment of different ways of treatment, among them cell-based and gene therapy.

Key words: mdx-murines, extraocular muscles, bioilogical model, morphometria.

Введение

Миодегенеративные процессы в экстраокулярных мышцах [ЭОМ) довольно часто развиваются как неблагоприятный исход у лиц, перенесших офтальмогерпес, а также после токсических поражений и травм [1]. У пациентов с такой патологией наблюдаются различные виды косоглазия, трудно поддающиеся лечению. Возможно, что в этих случаях может оказаться эффективной терапия «клеточными препаратами» [2-4].

На данный момент разработка методов клеточной терапии патологии ЭОМ осложняется отсутствием адекватной экспериментальной модели, которую можно было бы использовать для доклинических исследований и оценки терапевтического эффекта. Нами выполнена попытка оценить возможность использования т^х-мышей в качестве экспериментальной модели для разработки подходов клеточной терапии миодегенеративных процессов глазодвигательного аппарата [5].

Мышечная дистрофия у т^х-мышей обусловлена точечной мутацией в 23-м экзоне гена дистрофина, расположенного в Х-хромосоме [6]. Миодистрофию у этих мышей следует расценивать как процесс, гомологичный прогрессирующей мышечной дистрофии у людей.

Существует ряд исследований, касающихся вовлечения экстраокулярных мышц т^х-мышей в миодегенеративный процесс. В одних довольно однозначно говорится о том, что ЭОМ несмотря на отсутствие в их структуре дистрофина, особым образом компенсируют этот дефект и остаются

полностью морфологически и функционально сохранными [7]. Механизм такой компенсации, однако, остается дискуссионным [8, 9]. В других исследованиях было показано, что добавочные ЭОМ и глобулярные слои всех ЭОМ mdx-мышей всё-таки вовлекаются в патологический процесс, хотя и в меньшей степени чем, например, m. quadriceps femoris тех же животных [8, 10]. Степень повреждения мышц оценивается в этих исследованиях по экспрессии маркерных белков [дистрофин, утрофин, дистрогликаны, ламинины) методами RT-PCR, иммуногистохимии. Существует и морфологическая характеристика сравниваемых групп мышц. Однако, ресурс, который имеет «классический» гистологический анализ для оценки степени повреждения мышечной ткани, остается использованным не оптимально. Это происходит, в частности, из-за незначительной разницы в оцениваемых количественных показателях, таких, как ядерноцитоплазматическое соотношение, площадь мышечных волокон и т. д., различия между которыми тяжело учесть без применения адекватного статистического анализа [8, 9]. Численные параметры используются, но, в большинстве случаев, только для описания отдельных тканей, а не для сравнения их друг с другом [7, 9].

Нашей целью было охарактеризовать гистологические особенности экстраокулярных мышц mdx-мышей и мышей линии C57BI в сравнении с m. quadriceps femoris тех же животных методами компьютерной морфометрии и статистического анализа, для:

Адрес для переписки: pavliukster@gmail.com Павлюк Александр Сергеевич

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

тттт

- выявления и оценки степени поражения этой группы мышц;

- выявления информативных показателей, характеризующих глубину и тяжесть развития дегенеративных процессов;

- оценки возможности использования ЭОМ mdx-мышей в качестве модели при разработке клеточных технологий для лечения дегенеративных процессов ЭОМ.

Нами были отобраны морфометрические критерии для оценки процессов дегенерации и регенерации в ЭОМ. Это -число ядер в мышце, число мышечных волокон в мышце, CNI - центральный ядерный индекс и CVA - гетерогенность площади поперечного сечения мышечных волокон в мышце.

Материал и методы

Исследование проведено на самцах mdx-мышей и мышах линии C57BI в возрасте 10-12 мес. Мышей содержали в стандартных условиях, в соответствии с этическими нормами и правилами обращения с лабораторными животными.

После декапитации животного глазные яблоки с ЭОМ отделяли от стенок орбиты и век и фиксировали в 10% растворе нейтрального [pH = 7,3) формалина, аналогично обрабатывали m. quadriceps femoris. Весь материал подвергали стандартной гистологической обработке и изготавливали срезы толщиной 4 мкм. Окраску проводили гематоксилином и эозином.

Морфометрические показатели оценивали методами полуавтоматического морфометрического анализа с использованием программы «Флюороденситоморфометрия» [ЗАО «МеКоС»). Выявляли:

- площадь мышцы на поперечном срезе [соединительная ткань, мышечные волокна);

- площадь соединительной ткани на поперечном срезе мышцы;

- площадь мышечных волокон на поперечном срезе мышцы;

- доля соединительной ткани в мышце [отношение площади соединительной ткани ко всей площади мышцы на поперечном срезе);

- площадь мышечного волокна на поперечном срезе мышцы;

- число мышечных волокон в мышце на поперечном срезе;

- число ядер в на поперечном срезе мышечного волокна;

- число ядер на исследуемом поперечном срезе мышцы;

- плотность ядер в мышце [количество ядер на единицу площади мышцы);

- плотность ядер в мышечных волокнах [количество ядер на единицу площади мышечных волокон в мышце);

- центральный ядерный индекс [CNI) [рассчитывается как отношение числа мышечных волокон с одним и более ядром в центре к общему числу мышечных волокон, исключая мышечные волокна без ядер в поперечном сечении), характеризующий долю регенерировавших волокон;

- гетерогенность площади поперечного сечения мышечных волокон в мышце [CVA); рассчитывается как коэффициент вариации площади поперечного сечения мышечных волокон. Этот признак используется для оценки интенсивности процессов регенерации скелетных мышц: чем больше отличаются отдельные мышечные волокна по своим размерам, тем сильнее выражены процессы восстановления [11].

Для оценки значимости различий средних значений использовали t-критерий Стьюдента [и его модификации) при уровне значимости Р = 0,01.

Результаты и обсуждение

Гистологические данные о cтpoeнии изучєнньіх мышц cтpaдaют известной скупостью и не дают существенной инфopмaции для cpaвнитeльнoгo анализа фис. ї). Без дополнительных исследований по гистологическим пpeпapa-там нельзя судить о наличии дocтoвepныx paзличий между исследуемыми фуппами. Oднaкo пpи мopфoмeтpичecкoм и последующем статистическом анализе выявлено, что для ЭOM, также как и для m.quadriceps femoris mdx-мышей ха-paктepнo статистически значимое изменение нeкoтopыx мopфoмeтpичecкиx пpизнaкoв относительно кoнтpoльнoй фуппы мышей линии C57Bl, [табл.). Так в мышцах mdx-мышей, снижаются значения таких абсолютных пpизнa-ков, как:

- площадь мышцы на пoпepeчнoм cpeзe - в 3 paзa для ЭOM и в 6 paз для m. quadriceps femoris;

- площадь соединительной ткани на пoпepeчнoм cpeзe мышцы - в 3 paзa для ЭOM и в В paз для m. quadriceps femoris;

- площадь мышечных волокон на пoпepeчнoм cpeзe мышцы - в 2 paзa для ЭOM и в 5 paз для m. quadriceps femoris;

- число ядep на исследуемом пoпepeчнoм cpeзe мышцы

- в 2 paзa для ЭOM и в 2 paзa для m. quadriceps femoris;

- число мышечных волокон в мышце - в 3 paзa для ЭOM и в 6 paз для m. quadriceps femoris.

Как было показано в исследовании, посвященном изучению пpoцeccoв дeгeнepaции и peгeнepaции пoпepeчнo-полосатой мycкyлaтypы, такое уменьшение площади мышцы, площади отдельных волокон и дp. свидетельствуют о дeгeнepaтивныx пpoцeccax в ткани [її]. Таким oбpaзoм, нами показано наличие пpoцeccoв дeгeнepaции в ЭOM, также как и в m. quadriceps femoris mdx-мышей.

В ЭOM mdx-мышей увеличиваются такие относительные пpизнaки как:

- цeнтpaльный ядepный индекс [CNI);

- коэффициент вapиaции площади пoпepeчнoгo сечения мышечных волокон [CVA).

Такие изменения по данным тех же автс^ов [її] гoвopят о наличии пpoцeccoв peгeнepaции. Поскольку в исследованных ЭOM mdx-мышей эти изменения пpиcyтcтвyют, следует кoнcтaтиpoвaть пpoтeкaниe в них и пpoцeccoв peгeнepaции.

Для m. quadriceps femoris mdx-мышей также статистически значимо увеличивается cpeднee количество ядep в мышечном волокне, плотность ядep в мышце и мышечных волокнах и значимо уменьшается доля соединительной ткани в мышцах относительно кoнтpoльнoй фуппы мышей линии C57Bl, что позволяет oпpeдeлить дeгeнepaтивныe и peгeнepaтopныe пpoцeccы в мышечной ткани m. quadriceps femoris mdx-мышей. Для ЭOM дocтoвepныx изменений этих пpизнaкoв не выявлено.

^и анализе pacпpeдeлeния величин пoпepeчнoгo сечения мышечных волокон выявлено увеличение доли волокон с большой площадью в мышцах [m. quadriceps femoris и эк-cтaoкyляpныx мышц) у mdx-мышей по cpaвнeнию с линией C57Bl ^ис. 2, 3).

Пpeдcтaвляeтcя цeлecooбpaзным пpeдпoлoжить, что увеличение количества мышечных волокон с большой площадью является одним из компенса^^ных механизмов.

Mb считаем, что абсолютные пpизнaки, такие, как площадь мышцы, площадь соединительной ткани в мышце, площадь мышечных волокон в мышце, нaпpямyю зависят от фактс^ов, raTOpbie тpyднo учесть ^овень и нaпpaвлe-ние cpeзa, pacпoлoжeниe мышцы), а потому все эти пpи-знаки следует исключить из кpитepиeв для оценки степени диcтpoфии.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

4- i ■■ тгл

Оригинальные исследования

A

A

Гистоморфометрическая характеристика экстраокулярных мышц и m. quadriceps femoris mdx-мышей

Параметр, размерность Экстраокулярные мышцы m. quadriceps femoris

C57BI mdx C57Bl mdx

Площадь мышцы (на поперечном срезе) 39311±25998 14138±4666* 299631±63524 53561±40453*

Площадь соед. ткани 17269±12853 5597±2500* 117135±21908 13894±13115*

Площадь мыш. волокон в мышце (на поперечном срезе) 22042 ±14307 8542±2511* 182496±21908 39667±28699*

Число ядер в мышце 81±42 36±13* 146±35 90±62*

Число мыш. волокон в мышце 69±44 21±8* 90±20 16±13*

Площадь мыш. волокна (на поперечном срезе) 293 ±133 450±188 1574±652 2200±1119

Ср. кол-во ядер на мыш. волокно 1,3±0,3 1,7±0,6 2±0,5 5,5±1,4

Доля соединительной ткани в мышце, % 42,8±9,1 38,6±7,2 39,1±7,3 23,1±9,7

Плотность ядер в мышце 2316±715 2570±373 489±115 1866±767

Плотность ядер в мыш. волокнах 4143±1465 4276±976 798±131 2374±693

CNI, % 1,45 4,51* 5,33 87,75*

CVA 0,52 0,58* 0,44 0,64*

Примечание: * - различия статистически значимы.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

Рис. 1. Попереные срезы исследованных мышц:

А - экстаокулярная мышца мыши линии С57В1; Б - экстраокулярная мышца mdx-мыши; В - m. quadriceps femoris мыши линии С57В1; Г - m. quadriceps femoris mdx-мыши. Окраска: гематоксилин и эозин. А, Б - х250; В, Г - х250

49

■■■ I I и и

тттт

I ■ I

ш

Рис. 2. Гистограмма площади поперечного сечения мышечных волокон в экстрао^лярных мышцах мышей линии C57Bl и mdx-мышей

2702,4 4372,0

| q-mdx

I q-c

Рис. 3. Гистограмма площади поперечного сечения мышечных волокон в m. quadriceps femoris мышей линии C57Bl и mdx-мышей

Таким oбpaзoм, на основании статистически пoдтвep-жденных paзличий между показателями, измepeнными у кoнтpoльныx C57Bl и mdx-мышей, для оценки миoдиcтpo-фии из всех пpeдлoжeнныx показателей можно выдать следующие:

- число ядep на исследуемом пoпepeчнoм cpeзe мышцы;

- число мышечных волокон на пoпepeчнoм cpeзe мышцы;

- CNI — цeнтpaльный ядepный индекс;

- CVA — коэффициент вapиaции площади пoпepeчнoгo сечения мышечных волокон.

По этим пpизнaкaм oбнapyжeны значимые paзличия между гpyппoй mdx-мышей и мышей C57Bl как в экcтpao-кyляpныx мышцах, так и в m. quadriceps femoris.

Анализ гистологических препаратов, проведенный с использованием методов объективной морфометрии и статистики, свидетельствует о том, что в экстраокулярных мышцах mdx-мышей имеют место процессы дегенерации и регенерации меньшей степени выраженности, чем в m. quadriceps femoris, что, в целом, согласуется с существующими литературными данными о том, что ткани ЭОМ являются структурно дефектными, но имеют механизмы компенсации [7, 8, 10].

Таким образом, нами установлено, что экстраокулярные мышцы mdx-мышей можно использовать в качестве экспериментальной модели миодистрофических процессов глазодвигательных мышц, в частности, для разработки методов клеточной и генной терапии миодистрофий в офтальмологии.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Каспаров А.А. Офтальмогерпес. М.: Медицина; 1994.

2. Ярыгин В.Н., Сухих Г.Т., Ситников В.Ф. и др. Ксенотрансплантация эмбриональных предшественников миогенеза человека для коррекции дистрофинопатии у мышей с наследственной миодистрофией. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003; 136 [7): 100-2.

3. Ярыгин В.Н., Стенина М.А., Булякова Н.В. и др. Восстановление икроножной мышцы мышей mdx разного возраста после травмы и при имплантации ксеногенной мышечной ткани. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2006; 142 [8): 216-8.

4. Сукач А.М. Перспективы использования генной и клеточной терапий для лечения мышечных дистрофий. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 2 [4): 44-50.

5. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 1998; 279: 1528-30.

6. Bulfield G., Siller W.G. et al. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. PNAS USA 1984; 81: 1189-92.

7. Khurana T.S., Prendergast R.A., Alameddine H.S. et al. Absence of Extraocular Muscle Pathology in Duchenne's Muscular Dystrophy: Role for Calcium Homeostasis in Extraocular Muscle Sparing. J. Exp. Med. 1995; 182: 467-75.

8. Porter J.D., Rafael J.A., Ragusa R.J. et al. The sparing of extraocular muscle in dystrophinopathy is lost in mice lacking utrophin and dystrophin. J. Cell Science 1998; 111: 1801-11.

9. Porter J.D., Merriam A.P., Sangeeta K. et al. Constitutive properties, not molecular adaptations, mediate extraocular muscle sparing in dystrophic mdx mice. FASEB J. 2003; 17: 893-5.

10. Budak M.T., Bogdanovich S., Wiesen-Martin H.J. et al. Layerspecific differences of gene expression in extraocular muscles identified by laser-capture microscopy. Physiol. Genomics 2004; 20: 55-65.

11. Chambers R.L., McDennott J.C. Molecular basis of skeletal muscle regeneration. Can. J. Appl. Physiol. 1996; 21 (3): 155-84.

Поступила 17.06.2008

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

А