Научная статья на тему 'Репаративный рабдомиогистогенез у мышей, мутантных по гену DYSF'

Репаративный рабдомиогистогенез у мышей, мутантных по гену DYSF Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
174
29
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
РЕГЕНЕРАЦИЯ / МЫШЕЧНАЯ ДИСТРОФИЯ / ДИСФЕРЛИН / СКЕЛЕТНАЯ МЫШЕЧНАЯ ТКАНЬ / МОДЕЛИ ЖИВОТНЫХ / REGENERATION / MUSCLE DYSTROPHY / DYSFERLIN / SKELETAL MUSCLE / ANIMAL MODELS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Чернова О.Н., Мавликеев М.О., Зейналова А.К., Киясов А.П., Деев Р.В.

Дисферлинопатии группа наследственных миодистрофий с мутацией в гене DYSF. Дисферлин трансмембранный белок с молекулярной массой 237 кДа, который выполняет ключевую роль в репарации сарколеммы. Дисферлин, связываясь с ионами кальция C2 доменами, обеспечивает активацию слияния везикул и их доставку в место дефекта. Для изучения дисферлинопатий in vivo используют ряд нокаутных животных, одними из которых являются мыши линии Bla/J, полученные путем вставки ретротранспозона в 4 интрон гена DYSF мышей дикого типа C57Bl/6. Для установления патогенеза дисферлинопатии важно не только понимать физиологическую функцию белка дисферлина, но и знать, как его дефицит влияет на протекание репаративной регенерации скелетных мышц. Целью исследования стала оценка репаративного рабдомиогистогенеза у мышей с мутацией в гене DYSF на модели химического повреждения мышц. В работе выявлены особенности репаративной регенерации скелетных мышц после острого химического повреждения у мутантных по гену DYSF мышей, дана количественная оценка основных патоморфологических проявлений рабдомиогистогенеза: повреждения (доля некротизированных мышечных волокон), пролиферации (доля Ki-67-позитивных ядер мышечных клеток) и дифференцировки (средняя площадь поперечного сечения мышечных волокон, доля центральноядерных мышечных волокон, доля миогенин-позитивных ядер, соотношение медленных и быстрых волокон). Показано, что в мышцах животных с мутацией в гене DYSF происходят те же процессы, что и у мышей контрольной группы, однако альтерация у первых выражена значительнее, что проявляется большей долей некротизированных мышечных волокон (35,1% (29,4%; 42,9%) у Bla/J и 25,8% (17,9%; 37,4%) у C57Bl/6) на 2 сутки после повреждения, p<0,05), а пролиферация и миогенная дифференцировка происходят с меньшей интенсивностью по сравнению с контрольной группой: процент миогенин-позитивных ядер составил 3,2% (0,06%; 6,9%) на 4 сутки после повреждения у мышей линии Bla/J и 6,3% (1,3%; 15,3%) у мышей линии C57Bl/6.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Чернова О.Н., Мавликеев М.О., Зейналова А.К., Киясов А.П., Деев Р.В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

REPARATIVE RHABDOMYOGENESIS IN MICE WITH DYSF MUTATION

Dysferlinopathies are a group of muscular dystrophies with autosomal-recessive inheritance caused by mutations in DYSF gene. Dysferlin is a 237 kDa transmembrane protein responsible for reparation of the sarcolemma. It has calcium-sensitive C2 domains and after dysferlin binding with calcium ions the first one activates vesicles fusion and patch mechanism repair. There are number of knockout animal strains with dysferlin gene mutations. Bla/J mice have the ETn retrotransposon inserted in intron 4 of the DYSF gene of wild-type mice C57Bl/6. The pathogenesis ascertainment of dysferlinopathies is important not only for revealing of physiological function of dysferlin, but its deficiency influence on reparative regeneration of skeletal muscles. In this paper the description of main pathohistological processes in skeletal muscle that take place in mice with dysferlinopathy after acute myotoxic injury is present. This article reviews quantitative evaluation of main pathomorphological processes in reparative regeneration: alteration (necrotized muscle fibers ratio), proliferation (Ki-67-positive myonuclei ratio), differentiation (mean cros-sectional area, percentage of centrinucleated muscle fibers, myo-genin-positive nuclei ratio, slow/fast muscle fibers ratio). It was identified that dysferlin-deficient mice have increased alteration level with more necrotized muscle fibers (35,1% (29,4%; 42,9%) in Bla/J vs. 25,8% (17,9%; 37,4%) in C57Bl/6 on 2 day after alteration, p<0,05) and decreased proliferation index and myogenic differentiation (3,2% (0,06%; 6,9% of myogenin-positive nuclei in Bla/J vs. 6,3% (1,3%; 15,3%) in C57Bl/6 on 4 day after injection) by contrast to control group.

Текст научной работы на тему «Репаративный рабдомиогистогенез у мышей, мутантных по гену DYSF»

DOI: 10.23868/201906016

РЕПАРАТИВНЫЙ РАБД0МИ0ГИСТ0ГЕНЕЗ У МЫШЕЙ, МУТАНТНЫХ ПО ГЕНУ DYSF

О.Н. Чернова1, М.О. Мавликеев1, А.К. Зейналова1, А.П. Киясов1, Р.В. Деев2' 3

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Рязань, Россия

3 ПАО «Институт Стволовых Клеток Человека», Москва, Россия

REPARATIVE RHABDOMYOGENESIS IN MiCE WITH DYSF MUTATION

O.N. Chernova1, M.O. Mavlikeev1, A.K. Zeynalova1, A.P. Kiyasov1, R.V. Deev2 3

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia

3 Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov, Ryazan, Russia

e-mail: olgachernova92@Yandex.ru

Дисферлинопатии — группа наследственных миодистрофий с мутацией в гене DYSF. Дисферлин — трансмембранный белок с молекулярной массой 237 кДа, который выполняет ключевую роль в репарации сарколеммы. Дисферлин, связываясь с ионами кальция C2 доменами, обеспечивает активацию слияния везикул и их доставку в место дефекта.

Для изучения дисферлинопатий in vivo используют ряд но-каутных животных, одними из которых являются мыши линии Bla/J, полученные путем вставки ретротранспозона в 4 интрон гена DYSF мышей дикого типа C57BI/6.

Для установления патогенеза дисферлинопатии важно не только понимать физиологическую функцию белка дисфер-лина, но и знать, как его дефицит влияет на протекание репара-тивной регенерации скелетных мышц.

Целью исследования стала оценка репаративного рабдо-миогистогенеза у мышей с мутацией в гене DYSF на модели химического повреждения мышц. В работе выявлены особенности репаративной регенерации скелетных мышц после острого химического повреждения у мутантных по гену DYSF мышей, дана количественная оценка основных патоморфологических проявлений рабдомиогистогенеза: повреждения (доля некро-тизированных мышечных волокон), пролиферации (доля Ki-67-позитивных ядер мышечных клеток) и дифференцировки (средняя площадь поперечного сечения мышечных волокон, доля центральноядерных мышечных волокон, доля миогенин-позитивных ядер, соотношение медленных и быстрых волокон). Показано, что в мышцах животных с мутацией в гене DYSF происходят те же процессы, что и у мышей контрольной группы, однако альтерация у первых выражена значительнее, что проявляется большей долей некротизированных мышечных волокон (35,1% (29,4%; 42,9%) у Bla/J и 25,8% (17,9%; 37,4%) у C57Bl/6) на 2 сутки после повреждения, p<0,05), а пролиферация и миогенная дифференцировка происходят с меньшей интенсивностью по сравнению с контрольной группой: процент миогенин-позитивных ядер составил 3,2% (0,06%; 6,9%) на 4 сутки после повреждения у мышей линии Bla/J и 6,3% (1,3%; 15,3%) у мышей линии C57Bl/6.

Ключевые слова: регенерация, мышечная дистрофия, дисферлин, скелетная мышечная ткань, модели животных.

Поперечнополосатая скелетная мышечная ткань (ППСМТ) подвержена действию широкого спектра экзогенных (химических, физических, биологических) и эндогенных (мутации, аутоиммунная агрессия) повреждающих факторов [1, 2]. Процесс посттравматической регенерации ППМСТ включает ряд последовательных морфогенетических фаз: гибель мышечных волокон (МВ), активация миосателлитоцитов, пролиферация миобластов, их дифференцировка и слияние с образованием миосимпласта [3]. Кроме того, выделяют три патофизиологические фазы регенерации мышц: повреждение, восстановление и ремоделирование [4]. Для каждой из перечисленных фаз характерен синтез специфичных маркеров (например, миогенные

Dysferlinopathies are a group of muscular dystrophies with au-tosomal-recessive inheritance caused by mutations in DYSF gene. Dysferlin is a 237 kDa transmembrane protein responsible for reparation of the sarcolemma. It has calcium-sensitive C2 domains and after dysferlin binding with calcium ions the first one activates vesicles fusion and patch mechanism repair.

There are number of knockout animal strains with dysferlin gene mutations. Bla/J mice have the ETn retrotransposon inserted in intron 4 of the DYSF gene of wild-type mice — C57Bl/6.

The pathogenesis ascertainment of dysferlinopathies is important not only for revealing of physiological function of dysferlin, but its deficiency influence on reparative regeneration of skeletal muscles.

In this paper the description of main pathohistological processes in skeletal muscle that take place in mice with dysferlinopathy after acute myotoxic injury is present. This article reviews quantitative evaluation of main pathomorphological processes in reparative regeneration: alteration (necrotized muscle fibers ratio), proliferation (Ki-67-positive myonuclei ratio), differentiation (mean cros-sectional area, percentage of centrinucleated muscle fibers, myo-genin-positive nuclei ratio, slow/fast muscle fibers ratio). It was identified that dysferlin-deficient mice have increased alteration level with more necrotized muscle fibers (35,1% (29,4%; 42,9%) in Bla/J vs. 25,8% (17,9%; 37,4%) in C57Bl/6 on 2 day after alteration, p<0,05) and decreased proliferation index and myogenic differentiation (3,2% (0,06%; 6,9% of myogenin-positive nuclei in Bla/J vs. 6,3% (1,3%; 15,3%) in C57Bl/6 on 4 day after injection) by contrast to control group.

Keywords: regeneration, muscle dystrophy, dysferlin, skeletal muscle, animal models.

регуляторные факторы Myf5 и MyoD осуществляют миогенную индукцию, а миогенин и MRF4 участвуют в терминальной миогенной дифференцировке) [5]. При снижении количества или отсутствии одного из белков, участвующих в репаративной регенерации МВ, в них нарушается способность к восстановлению целостности сарколеммы, что в итоге приводит к некрозу, фиброзу, атрофии мышцы в целом и, следовательно, к потере ее функциональных возможностей. Так как в гистогенезе скелетных мышц задействованы мембранные белки (например, при слиянии миобластов), то их отсутствие или дефицит делает невозможной репарацию сарколеммы, что может негативным образом сказываться на репаративном рабдомиогистогенезе.

Описан комплекс механизмов, направленных на поддержание целостности поврежденного МВ [6]. Так, в репарации повреждений сарколеммы размером более 1 мкм (крупный дефект) участвует ряд белков, одним из которых является дисферлин. Известно, что дис-ферлин в комплексе с другими белками (аннексинами, митсугмином 53, кальпаином-3, AHNAK, тубулином, кавеолином-3) участвует в физиологической репарации сарколеммы путем образования временной «заплатки» (патча) в месте повреждения, тем самым предотвращая вход ионов кальция в клетку и выход содержимого МВ во внеклеточное пространство. Кроме того, каждый из семи C2 доменов дисферлина в разной степени способен связывать ионы кальция. Именно дисферлин участвует в активации слияния везикул и их транспортировке в область дефекта сарколеммы [7, 8].

Помимо участия в везикулярном транспорте, дис-ферлин нужен для клеточной адгезии и хемоаттракции нейтрофилов (белок связан с секрецией хемокинов и цитокинов). Дисферлин синтезируют не только МВ, но и ряд других клеток: кардиомиоциты, эндотелиоциты, клетки синцитиотрофобласта, легких, печени [7-12]. Можно предположить, что дисферлин влияет не только на репарацию сарколеммы, но и на васкуляризацию поврежденного участка скелетной мышцы. При мутациях в гене DYSF образуются малые везикулы, не способные образовать заплатку достаточного размера, чтобы закрыть дефект. Кроме того, в саркоплазме остается много несвязанного кальция, инициирующего некроз МВ [8]. С целью изучения патоморфогенеза дисфер-линопатий in vivo используют ряд нокаутных животных, одними из которых являются мыши линии Bla/J, полученные путем вставки ретротранспозона в 4 интрон гена DYSF мышей дикого типа C57BI/6.

Репаративную регенерацию скелетных мышц изучают на моделях их повреждения разными факторами: физическими, химическими и биологическими. Для эксперимента была выбрана модель химического повреждения с внутримышечным введением миотокси-ческого препарата новокаина, так как на такой модели можно обеспечить точное дозирование препарата и его равномерное распределение в пределах изучаемой мышцы. Новокаин — местный анестетик, снижающий проницаемость мембран для ионов натрия, тем самым препятствуя возникновению потенциала действия. При воздействии на МВ он приводит к разрыву пучков миофиламентов в области Z-линий, нарушению целостности митохондрий и саркоплазматического ретикулума, кариопикнозу. Было обнаружено, что через 2 сут. после повреждения клеточный дебрис фагоцитируется, остается лишь базальная мембрана с популяцией прилежащих к ней миосателлитоцитов [13].

Целью исследования стала оценка репаративного рабдомиогистогенеза у мышей с мутацией в гене DYSF на модели химического повреждения мышц.

Материал и методы

Объектом исследования были выбраны самцы мышей в возрасте 5 мес. линии Bla/J с мутацией в гене DYSF (экспериментальная группа, n=16), и линии C57BI/6 (контрольная группа, n=16). Мыши линии Bla/J были получены из лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток Института цитологии РАН (санкт-Петербург), мыши линии C57Bl/6 — из Научно-исследовательского центра биомедицинских моделей и технологий (Москва). Для моделирования химического повреждения мышц в медиальную головку правой икроножной мышцы всем животным вводили 100 мкл

0,1% раствора новокаина (Renewal®, серия № 421115, Россия) прецизионно через кожный разрез. Животных выводили из эксперимента передозировкой эфирного наркоза через 2, 4, 10 и 14 сут. (n=4 из каждой группы для каждого срока). Забор среднего поперечного сегмента голени производили после извлечения берцовых костей. Для интактного контроля использовали конечность мышей того же возраста, которым не вводили новокаин (0 сут.). Содержание и экспериментальная работа с животными соответствовала правилам, принятым в Российской Федерации, национальным законам и рекомендациям локального этического комитета [14].

Проводку фиксированных в 10% забуференном растворе формалина образцов мышц голени выполняли в гистологическом процессоре Thermo Scientific (США) и заливали в парафин. Срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, проводили иммунофлуоресцентное окрашивание антителами (АТ) к дисферлину (клон ab124684, 1:200, Abcam, Великобритания; вторые АТ Alexa Fluor 647 в разведении 1:2000, Invitrogen, США), иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание АТ к Ki-67 (клон ab16667, 1:200, Abcam, Великобритания), миогенину (клон F5D, 1:100, Dako, США), тяжелым цепям быстрого и медленного миозинов (MHC fast, клон My-32, 1:500; MHC slow, клон NOQ7.5.4D, 1:2000, Sigma, США).

На полученных гистологических препаратах изучали последовательные процессы, протекающие в поврежденной мышечной ткани: повреждение, пролиферацию, дифференцировку.

Степень повреждения мышечной ткани оценивали по количеству некротизированных МВ по всей области повреждения на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином.

Пролиферацию мышечных клеток определяли на срезах, окрашенных АТ к Ki-67: рассчитывали индекс пролиферации (ИП) — количество Ki-67-позитивных ядер мышечных клеток (МВ и миосателлитоцитов) к общему числу ядер мышечных клеток.

Дифференцировку мышечных клеток оценивали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином: проводили подсчет средней площади поперечного сечения МВ и доли центральноядерных МВ (ЦЯМВ); определяли позднюю миогенную дифференцировку путем подсчета доли миоге-нин-позитивных ядер; рассчитывали соотношение волокон, синтезирующих тяжелые цепи быстрых и медленных миозинов при ИГХ окрашивании АТ к MHC fast/slow.

Окрашенные срезы фотографировали на световом микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) и сканировали на цифровом сканере микропрепаратов Aperio CS2 (Leica Microsystems, Германия). Полученные изображения анализировали с использованием программ Aperio ImageScope (Leica Biosystems, Германия) и ImageJ (NlH, США).

Результаты морфометрического анализа выражали в виде медианы (1-й квартиль; 3-й квартиль). Статистическую достоверность различий средних величин двух линий мышей оценивали в программе Statistica 13.3 критерием Краскела-Уоллиса для нескольких независимых выборок œ значением p<0,05 в качестве уровня значимости.

Результаты и обсуждение

Синтез дисферлина. Иммунофлуоресцентное окрашивание АТ к дисферлину (рис. 1) выявило, что у мышей линии Bla/J, в отличие от мышей линии C57Bl/6, дис-ферлин не синтезируется.

В работе были исследованы три патофизиологические фазы регенерации мышц после травмы: повреждение, пролиферация и дифференцировка.

А Б

В Г

Рис. 1. Срезы икроножной мышцы мышей линий С57В1/6 (А, В) и В!а/и (Б, Г), ИГХ реакции с антителами к дисферлину (красный цвет); В, Г — контроль без АТ. Докраска ядер — РАР!. Ув.: х200

Повреждение. При оценке тяжести повреждения мышечной ткани было обнаружено, что количество некротизированных МВ в обеих группах животных было максимальным на 2 сут. после введения новокаина (35,1% (29,4%; 42,9%) у В!а/и и 25,8% (17,9%; 37,4%) у С57В1/6, р<0,05, рис. 2). Вероятно, более высокое значение показателя на 2 сут. у мышей линии В!а/и по сравнению с мышами линии С57В1/6 напрямую связано с нарушением регенерации МВ из-за дефицита дисферлина. Однако снижение доли некротизированных МВ к 10 сут. свидетельствует о том, что репарация сарколеммы, хотя и с меньшей интенсивностью, но возможна и в условиях отсутствия синтеза дисферлина. Интересна динамика изменения доли некротизирован-ных МВ у дисферлин-дефицитных мышей: после снижения в интервале между 2 и 10 сут. к 14 сут. показатель возрос с 4,8% (1,6%; 8,7%) до 7,4% (5,4%; 9,9%), тогда

как в контрольной группе значения показателя равномерно снижались от 2 до 14 сут. (2,5% (1,5%; 3,1%). Вероятно, это может быть связано со второй волной гибели МВ в результате воспалительного процесса. При мутациях в гене ОУБГ наблюдется сниженная секреция МВ цитокинов и хемокинов, что, в свою очередь, замедляет рекрутинг лейкоцитов и приводит к более позднему воспалительному ответу [15, 16]. Предполагают, что у мышей в условиях отсутствия дисферлина нарушен процесс переключения макрофагов с провоспалитель-ных на антивоспалительные, что приводит к длительному воспалительному ответу и отсутствию реституции скелетных мышц [17]. Заплатка, образующаяся при крупных повреждениях сарколеммы, в течение нескольких минут фагоцитируется макрофагами и замещается участком нормальной сарколеммы. Сигнал «съешь меня» макрофагам посылают молекулы фосфатидилсерина

<

/

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 В

А

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 В

г*- . ■

Доля некротизированных МВ

• ;

' V ч '

л

* • *

Б

I

О С57В1/6

■ -

¥

4

Сутки

10

14

Рис. 2. Некротизированные мышечные волокна (стрелки) на срезах икроножной мышцы мышей линий В!а/и (А) и С57В1/6 (Б), 4 сут. после введения новокаина; В — доля некротизированных МВ на разных сроках эксперимента; * — р<0,05. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: х400

/

Б

Доля К1-67 позитивных мышечных клеток * *

□ С57В1/6 П В1а/и

Ш

I

4

Сутки

10

14

Рис. 3. Ю-67-позитивные мышечные клетки (стрелки) на срезах икроножной мышцы мышей линий В!а/и (А) и С57В!/6 (Б), 4 сут. после введения новокаина, ИГХ-реакции с антителами к К1-67; В — индекс пролиферации мышечных клеток на различных сроках эксперимента, * — р<0,05. Докраска: гематоксилин. Ув.: х400

0

2

0

2

*" - * 4 "Ч

л. *

. 'I. - - *

„ %

-г »\»• ♦

л

> -

*1

V ■ у.- '

*

.V' - V Д.*."

( Г ■ Ч

л*-

■'.^Гг',

У

-

* * А

0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

В

.. • ... .

• \ -л • ' ■ -

л ;

* 1 > ■■ -

. ■ /;Л чг V

Г. , ' * ф , Г '

» V

Ф ' '

•V -. •

■ •у . — г

\

X • ■■> %

'■? Д У-' > * *

щ ' :

>

•л— *

* ' ч ,

Доля миогенин-позитивных ядер

.: -*.. *

' £ О - „

Й • , V'. " : . V.

■ Ч - .

"V

/ *

А

1.1 ч

I

□ С57В1/6

□ В\а/Л

П

4

Сутки

10

14

Рис. 4. Миогенин-позитивные ядра (стрелки) на срезах икроножной мышцы мышей линий В!а/и (А) и С57В1/6 (Б), 2 сут. после введения новокаина, ИГХ-реакции с антителами к миогенину, В — доля миогенин-позитивных ядер на различных сроках экспермента, * — р<0,05. Докраска: гематоксилин. Ув.: х400

*

ч -у

V

ч

г

N

У

■ У '

' V Шм - Ь - ....

А

1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

В

Доля ЦЯМВ

й

1 □

_

I"

4

Сутки

10

14

1= С57В1/6 П В!а/и

рис. 5. Центральноядерные мышечные волокна (стрелки) на срезах икроножной мышцы мышей линий В!а/и (А) и С57В1/6 (Б), 2 сут. после введения новокаина; В — доля центральноядерных МВ на различных сроках эксперимента, * — р<0,05. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: х400

0

2

0

2

А

8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

В

9< * >

« » - ;

■ ж « |> V

Средняя площадь поперечного сечения МВ, мкм2 _ * * * *

П I I I I г~

? г

ii U I А

□ C57BI/6

□ Bla/J

4

Сутки

10

14

у i

Yf'

Ш; m

J

1 ' ' • 4 * % c А

0,9 0,! 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 В

, ь

/

/

.4 * -*.

f 0 ft

W

6 \

. \ л

\

Sri »'

■ V о

Рис. 6. Мышечные волокна (стрелки) в срезах икроножной мышцы мышей линий В!а^ (А) и С57В1/6 (Б), 4 сут. после введения новокаина; В — средняя площадь поперечного сечения МВ на различных сроках эксперимента, * — р<0,05. Окраска: гематоксилин и эозин. Ув.: х400

И

' Л V

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Ж

N

• ■

в

ж

у, о

I *

-* 4

И

Отношение MHC slow/fast * *

И I 1

т Т ■. т . т

J C57BI/6 Bla/J

4

Сутки

10

14

Рис. 7. Мышечные волокна, синтезирующие тяжелые цепи медленных миозинов (стрелки) на срезах икроножной мышцы мышей линий Bla/J (А) и C57BI/6 (Б), 14 сут. после введения новокаина; ИГХ-реакции с антителами к MHC slow; В — соотношение медленных и быстрых МВ на разных сроках эксперимента, * — p<0,05. Докраска: гематоксилин. Ув.: х400

0

2

Б

2

на поверхности МВ. Однако в отсутствие дисферлина снижается и содержание фосфатидилсерина, что препятствует фагоцитозу и последующему восстановлению МВ [18]. Снижение эффективности фагоцитоза при дефиците дисферлина также приводит к персистирова-нию некротизированных МВ и увеличению их количества у мышей линии В!а/и [16].

Пролиферация. При анализе пролиферации мышечных клеток было выявлено, что доля Ю-67-позитивных ядер в МВ снижалась в обеих группах в интервале от 2 до 14 сут., однако на всех сроках, кроме 10 сут., этот показатель оказался выше у мышей линии С57В!/б (рис. 3), что указывает на сниженную пролиферативную активность при отсутствии дисферлина. К 14 сут. показатель в обеих группах не превышал 1%, таким образом, пролиферация мышечных клеток у мышей обеих линий была завершена к концу 2 недели после травмы. Нужно отметить, что динамика снижения этого показателя отличалась у мышей разных линий: у мышей линии В!а/и показатель быстрее снижался в интервале между 2 и 4 сут. (примерно на 8-9%, в контроле — на 3-4%), а у мышей линии С57В!/6 наиболее активное снижение показателя пришлось на 4 и 10 сут. (приблизительно на 14%, у В!а/и «0-2%). Полученный результат свидетельствует о менее интенсивном и более позднем завершении пролиферации у мышей линии В!а/,_1. Вероятно, это может быть связано с истощенным пулом миоса-теллитоцитов, которые постоянно активируются при естественном течении миодистрофии [19].

Дифференцировка. Позднюю миогенную диф-ференцировку, как показатель успешности регенерации, оценивали по доле миогенин-позитивных ядер. Максимум у мышей обеих линий пришелся на 4 сут., постепенное снижение — к 10 сут. (рис. 4). Показатели у мышей линии С57В!/6 были выше на всех сроках наблюдения. тенденция к снижению показателя у мышей линии В!а/и говорит о нарушенной миоген-ной дифференцировке при отсутствии дисферлина. Наблюдалась обратная корреляция между числом миогенин-позитивных ядер и долей некротизирован-ных МВ в поврежденной мышце у мутантных животных. Следовательно, можно заключить, что миогенная дифференцировка в отсутствии дисферлина активируется, но остается незавершенной. также нельзя исключить, что у мышей линии В!а/ регенеративный потенциал может быть снижен вследствие того, что в их онтогенезе и так непрерывно происходит репарация поврежденных МВ [7].

Расположение ядра в МВ отражает процессы его регенерации: после повреждения ядра с периферии волокна смещаются к центру. Нужно отметить, что во вновь формирующихся МВ ядра расположены в центре [20], однако центральное расположение ядер в МВ снижает сократительную способность мышц, поэтому после слияния миобластов ядра мигрируют на периферию [21]. Показатель доли ЦЯМВ был минимальным для обеих групп на 2 сут. после введения новокаина. У мышей линии В!а/и этот показатель был ниже по сравнению с контролем до 10 сут. включительно, что позволяет сделать вывод о более позднем начале и меньшей интенсивности репаративных процессов в условиях отсутствия дисферлина (рис. 5). К 14 сут. у мышей линии С57В!/6 дифференцировка завершалась, в то время как у мышей линии В!а/и на этом сроке показатель доли ЦЯМВ был максимальным (48,9% (33,3%; 54,3%) у В!а/и и 46,1% (34,3%; 58,5%) у С57В!/6, р=0,45). Полученный результат следует трактовать скорее как замедленный рабдомиогенез

в условиях отсутствия дисферлина, а не проявление миодистрофии, так как доля ЦЯМВ к 14 сут. после повреждения была значительно выше по сравнению с исходным уровнем у мышей линии Bla/J. Меньшее количество ЦЯМВ у мышей линии Bla/J в ответ на повреждение также может быть связано со снижением количества миобластов как результат истощения пула миосателлитоцитов [19].

Другим показателем, отражающим состояние МВ, является средняя площадь поперечного сечения МВ. Этот параметр на всех сроках был выше у мышей линии Bla/J (рис. 6), что можно интерпретировать как компенсаторную гипертрофию сохранивших жизнеспособность МВ на фоне их постоянной гибели. У мышей контрольной группы изучаемый показатель снижался к 4 сут. и составил 255,6 мкм2 (165,3 мкм2; 650,7 мкм2), что обусловлено появлением большего количества миотуб по сравнению с количеством мио-туб у мышей экспериментальной группы. Ранее было обнаружено, что миобласты мутантных по гену DYSF мышей линий SJL/J и A/J при слиянии in vitro формируют тонкие МВ, содержащие всего несколько ядер, и характеризуются сниженной экспрессией мышечно-специфичных генов (Myf5, Myod, Myog, Myhl и Ttn). При этом в изучаемых культурах клеток было выявлено повышение синтеза ряда провоспалительных факторов, преимущественно семейства NF-kB, что косвенно подтверждает обратную корреляцию между степенью воспаления и активностью миогенеза [22].

У мышей линии Bla/J содержание медленных МВ было выше на всех сроках (рис. 7). По-видимому, это связано с преимущественной гибелью волокон, синтезирующих MHC fast, за которой следует образование медленных МВ, более устойчивых к повреждению в условиях дефицита дисферлина. Ранее было описано уменьшение количества MHC fast-позитивных волокон у мышей SJL с мутацией в гене DYSF [12], а также преимущественная потеря быстрых МВ у пациентов с дис-ферлинопатиями [23]. Вероятно, большая сохранность MHC slow-позитивных волокон обусловлена наличием в них большего числа митохондрий, которые выступают буфером для ионов кальция [24]. Обнаруженное у пациентов с дисферлинопатиями наличие липидных капель в этих волокнах может быть результатом нарушения метаболизма жирных кислот в митохондриях [23].

Заключение

В работе впервые описано влияние миотоксичного агента на мышечную ткань мышей линии Bla/J с мутацией в гене DYSF и дано патогистологическое заключение по ключевым стадиям восстановления мышцы. Полученные результаты показали, что репаративный гистогенез в условиях отсутствия дисферлина проходит те же стадии, что и в нормальной мышечной ткани, но с некоторыми отличиями: альтерация протекает интенсивнее с большей долей некроза, регенерация замедленна, пролиферативная активность снижена, дифференцировка отсрочена. Такие различия могут быть обусловлены не только отсутствием дисферлина, но еще и тем, что при прогрессировании дисферлинопатии создаются неблагоприятные условия для восстановления скелетных мышц после острого повреждения. также следует принимать во внимание, что синтез дисферлина при дисферлинопатии отсутствует не только в МВ, но и в других компонентах мышцы: эндотелии сосудов, макрофагах, что, вероятно, способствует более длительному по сравнению с контролем воспалительному ответу в ответ на острое повреждение.

Понимание процессов, протекающих в скелетной мышечной ткани при наследственной мышечной патологии, крайне важно как с точки зрения изучения патогенеза, так и для разработки таргетной терапии.

Благодарности

Авторы выражают благодарность проф., чл.-корр. РАН Томилину Алексею Николаевичу за предоставленных

ЛИТЕРАТУРА:

1. Toumi H., Best T. The inflammatory response: friend or enemy for muscle injury? Br. J. Sports Med. 2003; 37(4): 284-6.

2. Чернова О.Н., Корсаков И.Н., Самчук Д.П. и др. Экспериментальные модели для изучения регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани. Гены и Клетки 2015; 4: 127-40. [Chernova O.N., Korsakov I.N., Samchuk D.P. et al. Experimental models for studying of skeletal muscles regeneration. Genes and Cells 2015; 4: 127-140].

3. Данилов Р.К., Одинцова И.А. Мышечная система. В: Данилов Р.К., редактор. Руководство по гистологии. 2-е изд. СПб: СпецЛит Россия; 2011, Т.1. с. 425-90. [Danilov R.K., Odintsova I.A. Muscle system. In: Danilov R.K., editor. Guideline for histology. 2nd ed. SPb: SpecialLit Russia; 2011, 1: 425-90].

4. Fernandes T.L., Pedrinelli A., Hernandez A.H. Muscle injury — phys-iopathology, diagnosis, treatment and clinical presentation. Rev. Bras. Ortop. 2011; 46(3): 247-55.

5. Asfour H.A., Allouh M.Z., Said R.S. Myogenic regulatory factors: The orchestrators of myogenesis after 30 years of discovery. Exp. Biol. Med. (Maywood) 2018; 243(2): 118-28.

6. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М.: Медицина; 1979. [Sarkisov D.S. Regeneration and its clinical significance. M.: Medicine; 1979].

7. Campbell K.P., Han R. Dysferlin and muscle membrane repair. Curr. Opin. Cell Biol. 2007; 19(4): 409-16.

8. Cooper S.T., McNeil P.L. Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology. Physiol. Rev. 2015; 95(4): 1205-40.

9. Huang Y., Laval S.H., van Remoortere A. et al. AHNAK, a novel component of the dysferlin protein complex, redistributes to the cytoplasm with dysferlin during skeletal muscle regeneration. FASEB 2007; 21: 732-42.

10. Huang Y., de Morree A., van Remoortere A. et al. Calpain 3 is a modulator of the dysferlin protein complex in skeletal muscle. Hum. Mol. Genet. 2008; 17: 1855-66.

11. Sharma A., Yu C., Leung C. et al. A new role for muscle repair protein Dysferlin in Endothelial Cell Adhesion and Angiogenesis — R2. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2010; 30(11): 2196-204.

12. Kobayashi K., Izawa T., Kuwamura M. et al. Dysferlin and Animal Models for Dysferlinopathy. J. Toxicol. Pathol. 2012; 25(2): 135-47.

линейных мышей. Работа выполнена при поддержке программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и субсидий, выделенных Казанским (Приволжским) федеральным университетом по государственному заданию в сфере научной деятельности.

конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

13. Foster A.H., Carlson B.M. Myotoxicity of local anesthetics and regeneration of the damaged muscle fibers. Anesth. Analg. 1980; 59(10): 727-36.

14. Генин А.М., Ильин А.Е., Капланский А.С. и др. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине. Авиакосмическая и экологическая медицина 2001; 4: 14-20. [Genin A.M., Ilyin A.E., Kaplansky A.S. et al. Bioethic rules of research with humans and animals in aviation, space and marine medicine. Aviacosm. Ecolog. Med. 2001; 4: 14-20].

15. de Morree A., Flix B., Bagaric I. et al. Dysferlin Regulates Cell Adhesion in Human Monocytes. J. Biol. Chem. 2013; 288(20): 14147-57.

16. Chiu Y.H., Hornsey M.A., Klinge L. et al. Attenuated muscle regeneration is a key factor in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 2009; 18(11): 1976-89.

17. Baek J.H., Many G.M., Evesson F.J. et al. Dysferlinopathy Promotes an Intramuscle Expansion of Macrophages with a Cyto-Destructive Pheno-type. Am. J. Pathol. 2017; 187(6): 1245-57.

18. Middel V., Zhou L., Takamiya M. et al. Dysferlin-mediated phospha-tidylserine sorting engages macrophages in sarcolemma repair. Nat. Commun. 2016; 7: 12875.

19. Schultz E., Lipton B.H. Skeletal muscle satellite cells: Changes in proliferation potential as a function of age. Mech. Ageing Dev. 1983; 20: 377-83.

20. Roman W., Gomess E.R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Semin. Cell Dev. Biol. 2018; 82: 51-6.

21. Cadot B., Gache V., Vasyutina E. et al. Nuclear movement during myotube formation is microtubule and dynein dependent and is regulated by Cdc42, Par6 and Par3. EMBO Rep. 2012; 13(8): 741-4.

22. Cohen T.V., Cohen J.E., Partridge T. Myogenesis in dysferlin-deficient myoblasts is inhibited by an intrinsic inflammatory response. Neuromuscul. Disord. 2012; 22(7): 648-58.

23. Grounds M.D., Terrill J.R., Radley-Crabb H.G. et al. Lipid accumulation in dysferlin-deficient muscles. Am. J. Pathol. 2014; 184(6): 1668-76.

24. Santo-Domingo J., Demaurex N. Calcium uptake mechanisms of mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 2010; 1797(6): 907-12.

Поступила: 10.05.19

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.