CC BY
51
УДК 547.97
Г. А. Иванова, М. А. Сысоева, К. Е. Серова
ЭКСТРАКЦИЯ ВЕЩЕСТВ ПОЛИФЕНОЛЬНОЙ ПРИРОДЫ ИЗ СЕМЯН ЛЯДВЕНЦА РОГАТОГО (LOTUS CORNICULATUS)
Ключевые слова: лядвенецрогатый, экстракция, полифенольные вещества, антиоксидантная активность.
Исследована экстракция семян Лядвенца рогатого водой и щелочными экстрагентами. Подобранные условия проведения этого процесса позволили увеличить выход экстрактивных веществ в 1,3 раза, выход полифенолов -в 22 раза по сравнению с контролем и получить экстракт с высокой антиоксидантной активностью до 53,6 мг/г.
Key words: Lotuscorniculatus, extraction, polyphenolic substances, antioxidant activity.
Water and alkali extraction of Lotus corniculatus seeds was studied in current research. Authors found conditions, in which extraction efficiency was 1,3 times higher and polyphenolic substance extraction efficiency was 22 times higher than in control sample, and extraction in these conditions resulted in obtaining an extract with high antioxidant activity value up to 53,6 mg/g.
Введение
Перспективным направлением решения проблемы расширения ассортимента эффективных лекарственных средств является создание препаратов на основе биологически активных веществ, извлекаемых из растительного сырья. Одним из примеров растительного сырья, служащего источником поли-фенольных соединений, может быть Лядвенец рогатый ^о^согтсиШш).
Лядвенецрогатый - цветковое растение семейства Бобовые, произрастающее в умеренных широтах Евразии и Северной Африке. Лядвенец — хорошее кормовое растение, одинаково подходящее как для сенокосов, так и для пастбищ. В его надземной массе содержитсядо 22 % протеина при 20-30 % клетчатки. Лядвенец — отличный медонос. Нектаропродуктив-ность одного цветка в теплые солнечные дни составляет до 0,9 мг. Его цветками раньше красили ткани в желтый цвет, а молодые бобы употребляли в пищу [1].
Растения рода Лядвенец ранее не использовались в качестве объекта многостороннего изучения, что не давало возможности их практического использования. По данным литературы в растениях рода Лядвенец обнаружены аминокислоты, витамины (С, К, В!, В2,) сахара, микроэлементы, полифенольные соединения. Основные биологически активные вещества - соединения класса флавоноидов, общее содержание которых составляет 28,52 %. Фармакологические свойства растений рода Лядвенец научно не обоснованы. Однако Лядвенец используют в народной медицине [2-4].
В настоящее время доказано, что полифенолы как антирадикальные агенты не только препятствуют инициации свободно радикального окисления, но и прерывают цепь перекисного окисления липидов. Благодаря антиоксидантному эффекту полифенолы защищают от повреждения мембраны клеток, лизо-сом, митохондрий, различных структур ядра, проявляя в целом цитозащитный эффект [5, 6].
Целью данной работы являлся подбор оптимальных условий экстракции полифенольных соединений из семян Лядвенца рогатого ^о^согтсиШш)
для получения экстракта с высокими антиоксидант-ными свойствами.
Экспериментальная часть
В работе использовали семена Лядвенца рогатого, приобретенные в торговой сети «Клуб органического земледелия».
Сырье экстрагировали водой, щелочными экс-трагентами согласно методике[7], изменяли соотношение сырье:экстрагент и время проведения процесса. Полифенолы из экстрактов выделяли осаждением 25 % соляной кислотой. Для подтверждения отнесения полученных осадков к полифенолам проведены качественные реакции с 10 % раствором перекиси водорода, с 1 % раствором перманганата калия и с 1 % раствором хлорида железа (III) [8].
Содержание экстрактивных веществ в пересчете на абсолютно сухое сырье и зольность сырьяопре-деляли по методике [7]. Определение антиоксидантной активности проводили по методике [9], титрование исследуемым раствором подкисленного пер-манганата калия (мет. А) и фосфомолибденовым методом [10] (мет. Б). Определение аминокислотного состава гидролизатов проводили методом бумажной хроматографии путем сравнения с аутентичными образцами (глицин, лизин, серин, аланин). Хроматографию осуществляли в системе растворителей изопропанол : вода (7 : 3). В качестве реагента для обнаружения аминокислот использовали 0,2 % рас-творнингидрина в ацетоне и выдерживали двое суток в сухом месте [11].
Результаты и их обсуждение
Обычно для интенсификации экстракции растительного сырья при извлечении гидрофильных биологически активных веществ в начале проведения исследования подбирают условия его экстракции водой; затем можно изменять рН экстрагента, использовать буферные системы.
Проведен процесс экстракции сырья Лядвенца рогатогокипячением с водой в течение двух часов при соотношении сырьё:экстрагент 1:100 и 1:10 (табл. 1). Стоит отметить, что выход экстрактивных веществ в зависимости от гидромодуля практически
не изменятся, однако значительно повышается зольность экстракта. Следовательно экстракт, полученный при кипячении сырьяс водой в течение двух часов при соотношении сырьё:экстрагент 1:100, можно принять за контрольный эксперимент.
Проведен подбор экстрагента для оптимального извлечения полифенольных соединений из сырья Лядвенца рогатого. По некоторым данным [8] экстракцию полифенольных веществ рекомендуется проводить с использованием растворов щелочей, что связано с их лучшей растворимостью в щелочных условиях. В связи с этим нами проведена экстракция сырья с использованием 0,1 Н раствора №ОН (рН 9) и насыщенного раствора NaHCO3 (рН 9). Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Физико-химические показатели экстрактов, полученных на основе Лядвенца рогатого
Условия получения экстракта Показатель
Экстра-гент Соотношение сырьё : экст-рагент Время С.О., % Зольность, %
Вода 1:10 2 ч 38,53±2,53 8,51±1,41
1:100 контроль 36,17±2,38 3,90±2,38
0,1Н раствор №ОН 1:10 74,39±1,26 29,13±3,01
1:100 45,53±1,99 13,04±2,44
Насыщенный раствор NaHCO3 1:10 27,51±1,31 13,18±1,11
1:50 28,11±1,57 11,57±2,47
1:100 46,70±1,85 5,07±1,86
1:200 37,60±2,97 5,70±2,29
1:100 1 ч 30,5±0,41 6,3±0,74
1:100 3 ч 43,34-2,76 15,29±2,24
Помимо экстрагентана количественный выход экстрактивных веществ может влиять и величина гидромодуля. При понижении гидромодуля до 1:10 с использованием в качестве подщелачивающего агента 0,1Н раствора №ОН выход экстрактивных веществ повышается в 1,9 раз по сравнению с водной экстракцией, при этом в 7,5 раз повышается зольность экстракта. Это может быть связано с активным солеобразованием во время процесса кипячения. При разработке на основе данных экстрактов биологически активных добавок высокая зольность экстракта нежелательна, поскольку может снижать их терапевтическую активность.
В меньшей степени процесс солеобразования может происходить во время кипячения с применением в качестве подщелачивающего агента насыщенного раствора NaHCO3. Проведение процесса кипячения с данным экстрагентом при соотношении 1:100 способствует увеличению выхода экстрактивных веществ в 1,3 раза по сравнению с водной экстракцией. При этом сохраняется зольность экстракта, близкая к контролю.
Изменение гидромодуля при применении щелочных экстрагентов не способствует увеличению выхода экстрактивных веществ, однако приводит к увеличению зольности экстракта, что является нежелательным эффектом.
Показано, что изменение продолжительности кипячения в большую и меньшую сторону от двух часов (таблица 1), не приводит к увеличению выхода экстрактивных веществ.
Таким образом, экстракция Лядвенца рогатого насыщенным раствором NaHCO3 в течение 2 ч при 100°С, с использованием соотношения сы-рье:экстрагент 1:100 позволяет получить максимальный выход экстрактивных веществ 46,7% с низкой зольностью экстракта, превышающий выход экстрактивных веществ в контроле в 1,3 раза.
Для выделения полифенолов из экстрактов Ляд-венца рогатого к ним добавляли 25 % раствор соляной кислоты до рН 1-2 и наблюдали формирование мелкодисперсного осадка коричневого цвета. Его высушивали при Т 23±2 °С и атмосферном давлении, затем промывали водой до нейтральной реакции, растворяли в 0,1Н растворе гидроокиси натрия и проводили качественные реакции на полифенолы (с 10 % раствором перекиси водорода, 1 % раствором перманганата калия и 1 % раствором хлорида железа (III)), согласно которым во всех полученных осадках присутствуют поли-фенольные вещества. Значения массы осадков и их антиоксидантная активность в пересчете на кверцетин приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Антиоксидантная активность полифенолов, выделенных из экстрактов Лядвенца рогатого
Условия получения экстракта Показатель
Соотно- Выход поли-фенолов, % Антиокси-
Экстра-гент шение сырьё : экстра- Время дантная активность, мг/г
гент мет. А мет. Б
1:10 1,69 -
Вода 1:100 контроль 2,03 40,5 39,6
0,1Н 1:10 23,01 -
раствор №ОН 1:100 2 ч 15,80 36,3 38,4
Насы- 1:10 9,45
щенный 1:50 25,80
раствор 1:100 44,69 53,6 51,7
NaHCO3 1:200 35,1
1:100 1 ч 25,43
1:100 3 ч 34,00
Проведение кипячения семян с использованием воды в качестве экстрагентав соотношении 1:100 позволяет получить до 5,6 % полифенолов от массы экстрактивных веществ. Понижение гидромодуля до 1:10 не способствует увеличению выхода полифенолов.
При использовании в качестве экстрагентов 0,1Н раствора №ОН и насыщенного раствора NaHCO3 (соотношение 1:100) выход полифенольных веществ значительно повышается по сравнению с контролем. Однако, следует отметить, что, несмотря на близкие значения выхода экстрактивных веществ, выход полифенолов в первом случае составляет лишь 34,7% от массы экстрактивных веществ, в то время
как во втором случае этозначение увеличивается до 95,7%. Предположительно, выход полифенолов при использовании NaHCOз значительно увеличивается вследствие установления катионо-анионного равновесия в растворе во время экстракции, что может способствовать их выходу из сырья и стабилизации, например, за счет образования коллоидной системы.
Изменение дисперсионной среды, в случае использования в качестве экстрагента NaHCO3, при применении различных гидромодулей может приводить к формированию более устойчивых коллоидных систем (гидромодуль 1:10) и менее устойчивых (гидромодуль 1:50,1:100, 1:200) по отношению к снижению рН.
При кипячении с использованием в качестве подщелачивающего агента 0,1Н раствора №ОНс соотношением 1:10 выход полифенолов снижается до 30,9 % от массы экстрактивных веществ. Вероятно, значительное влияние оказывает на это солеоб-разование, что связано с высокой зольностью этого экстракта (табл. 1).
Изменение продолжительности кипячения в большую или меньшую сторону не способствует увеличению их выхода.
Таким образом, наибольшая масса полифенолов составляет 44,69 % от массы сырья и 95,7 % от массы экстрактивных веществ экстракта(экстрагент -насыщенный раствор NaHCO3, гидромодуль 1:100, длительность 2 часа).
Анализ литературы [12] показал, что в семенах Лядвенца рогатого содержатся различныегликозиды кверцетина. В связи с этим было проведено определение антиоксидантной активности в пересчете на кверцетин. Высокая сходимость двух примененных методик показывает, что, вероятно, в реакцию и с перманганатом калия, и с молибдатом аммония вступают подобные вещества фенольной природы.
Результаты исследования показали, что наибольшую антиоксидантную активность проявляет осадок, полученный с использованием NaHCO3 в качестве экстрагента. Данное значение (53,6 мг/г) сравнимо сантиоксидантной активностью аскорбиновой кислоты (56,1мг/г) и превышает активность ресвератрола (12,6 мг/г) почти в пять раз[9]. Сниженная антиоксидантная активность полифенолов, полученных с использованием №0^ может быть обусловлена тем, что полифенолы могут находиться в солевой форме.
Для обнаружения биологически активных веществ других классов, способных придать дополнительные виды активности экстракту, полученному с использованием насыщенного раствора NaHC03, с гидромодулем 1:100 и продолжительностью экстракции в 2 часа, в нем определен состав свободных аминокислот. Для этого проведена бумажная хроматография экстракта. На хроматограмме обнаружено одно пятно светло-сиреневогоцвета с Rfl=0,39,что
соответствует нанесенному стандарту - аминокислоте глицин (Rf=0,40)[11]. В народной медицине Ляд-венец рогатый используется в качестве седативного средства, что, возможно, связано с наличием в экстракте свободного глицина.
Выводы
1. Найдены оптимальные условия экстракции семян Лядвенца рогатого с максимальным извлечением полифенольных веществ с выходом 44,7 %.
2. Установлено, что применение в качестве экстрагента насыщенного раствора NaHCO3 при одинаковых значениях рН, равных 9, позволяет получить в 2,8 раза больше полифенольных веществ по сравнению с использованием 0,1 Н раствора NaOH.
3. Полученный экстракт, обладающий антиокси-дантной активностью, превышающей почти в пять раз активностьресвератрола, исодержащий глицин, можно рекомендовать для создания на его основе биологически активных добавок, обладающих анти-оксидантным и седативным действием.
Литература
1. Луговые травянистые растения. Биология и охрана: Справочник/ под ред. Губанова И.А., Киселевой К.В., Новикова В.С., Тихомирова В.Н. - М.: Агропромиздат, 1990. - 183 с.
2. Яковлев Г.П. Бобовые земного шара. / Г.П. Яковлев // - Л. : Наука, 1991. - 144 с.
3. Галузинская Л. В. Экспериментальное изучение противовоспалительной активности Полифенольного экстракта надземной части Лядвенца рогатого: дис. ... кандидата фарм. наук / Л. В. Галузинская. - Харьков, 2008. - 157 с.
4. Серебрина Л.А. Немедикаментозное лечение в клинике внутренних болезней / Л.А. Серебрина, Н.Н. Середюк, Л.Е. Михно. - 1995. - 528 с.
5. Singab A.N., Hepatoprotective effect of flavonolglycosides rich fraction from Egyptian ViciacalcarataDesf. against CCl4-induced liverdamage in rats / A.N. Singab, D.T. Youssef, Е. Noaman // Arch Pharm Res. - 2005. - № 7. - Р. 791-798.
6. Чекман1.С. Флавонощи - кшшко-фармаколопчний аспект / 1.С. Чекман // ФиотерашявУкршш. - 2000. - № 2. - С. 3-5.
7. Государственная фармакопея Российской федерации XII . Ч. 1. - М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007. - 704 с.
8. Носов А.И. Состав и физико-химические свойства экстрактов трутовых грибов : диссертация ... кандидата химических наук / А.И. Носов. - Казань, 2013. - 174 с.
9. Фадеева Д.А. Определение антиоксидантной активности некоторых веществ аминокислотной, пептидной и полифе-нольной природы invitro / Д. А.Фадеева и др.// Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2011. - 4(99). - С. 178-181.
10.Tusevski O. Phenolic production and antioxidant properties of some Macedonian medicinal plants/ O. Tusevski, A. Iloska, L. Trajkovska, S. GadzovskaSimic // Cent. Eur. J. Biol. - 2014. -9(9). - P. 888-900.
11. Мугинова С.В. Методические указания к курсу аналитической химии для студентов I-го курса факультета фундаментальной медицины МГУ / С. В. Мугинова // - М.: МГУ, 2007. - 81 с.
12. Reynaud J. The flavonoids of Lotus corniculatus / J. Reynaud, M. Lussignol // Lotus Newletters. - 2005. - 35(1). - P. 75-82.
© Г. А. Иванова - канд. хим. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, guzeladgamovna@gmail.com; М. А. Сысоева - д-р хим.наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, Maska_M@kstu.ru, К. Е. Серова - студент каф. пищевой биотехнологии КНИТУ.
© G. A. Ivanova - Ph.D, associate professor of Food Biotechnology Department, KNRTU, guzeladgamovna@gmail.com; M. A. Sysoeva - Doctor of Chemistry, Professor, Head of Food Biotechnology Department, KNRTU, Maska_M@kstu.ru, K. E. Serova - student of Food Biotechnology Department, KNRTU.
