CC BY
108
2012 год. Анализы проводили при поступлении объектов в отделение и через 12 месяцев хранения.
По результатам наших исследований установлено, что в 72 % проб крови после 12 месяцев хранения этиловый спирт не обнаруживается, в то время как при первичном анализе данных проб этиловый спирт в них был обнаружен в концентрациях от 0,1 до 7,4 %%. Аналогичная картина изменения концентрации этилового спирта отмечена и при исследовании мочи.
Многочисленные публикации результатов исследований по вопросам посмертного изменения содержания этанола в трупном материале содержат весьма противоречивые данные. Известно, что концентрация этилового спирта в изолированных объектах трупа может как повышаться, так и снижаться, вплоть до полного исчезновения, что зависит от многих факторов: соблюдения правил забора биоматериала, характера микробного загрязнения (особенно грибками рода Candida), уровня глюкозы, сроков проведения анализа, условий хранения (наличия воздушной прослойки во флаконах с объектами), герметичность закрытия флаконов, наличие или отсутствие консерванта. Таким образом, сохраняемость этилового спирта в биологических объектах является процессом, на который влияют одномоментно многие факторы, и вывести простую зависимость между сроком хранения и сохраняемостью этанола практически невозможно.
ВЫВОДЫ
При оценке результатов повторного количественного определения этанола в биологических пробах необходимо учитывать все факторы, влияющие на сохраняемость этанола в каждой конкретной лаборатории. Только при таком подходе возможно достоверно оценить (подтвердить или опровергнуть) первичный результат анализа.
■ ЭКСТРАКЦИЯ, ДЕРИВАТИЗАЦИЯ И ГХ-МС АНАЛИЗ ГЛИКОЛЕЙ В ОБЪЕКТАХ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Р.Р. Краснова1, Е.П. Кириченко1, Н.В. Коблова1, Н.А. Крупина1,2
• 1Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)
• 2Кафедра судебной медицины (зав. -д.м.н., проф. В. А. Клевно) ФУВ ГБУЗ МО МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского
• Аннотация: Изучена методика анализа гликолей и их метаболитов в объектах биологического происхождения методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) с предварительной дериватизацией тримети-луксусным ангидридом (ТМУА).
• Ключевые слова: этиленгликоль, органические кислоты, дериватизация гликолей
ВВЕДЕНИЕ
Определение компонентов технических жидкостей в биологических объектах по-прежнему является распространенным видом анализа при проведении судебно-химических и химико-токсикологических исследований. Московская область не является исключением. Ежегодно встречаются случайные и суицидальные отравления техническими жидкостями, в состав которых входят глико-ли, в т.ч. этиленгликоль - основной компонент различных рецептур антифризов, гидравлических, тормозных жидкостей и жидкостей, используемых в системах отопления и автомобильных кондиционерах.
В газохроматографическом анализе полярных соединений низкой летучести для повышения чувствительности и воспроизводимости полярные функциональные группы подвергают превращению в неполярные группы дериватизацией без изменения основной структуры молекулы. Это улучшает хроматографические возможности, улучшает разделение структурно похожих соединений, повышает их летучесть и термическую стабильность, снижает потери при экстракции и в процессе анализа. За счет образования ионов с более высокими массами повышается чувствительность.
Сложность представляют также органические кислоты, являющиеся токсичными метаболитами гликолей (гликолевая, муравьиная и щавелевая кислоты), которые необходимо определять помимо гликолей в пробах биологического происхождения.
Кроме технологии с использованием метилирования с помощью диметилсульфата (ДМС), которая позволяет получить летучие эфиры непосредственно в водных пробах и исследовать парогазовую фазу при ГХ-МС анализе, была изучена и внедрена технология экстракции гликолей из биологических жидкостей и тканей внутренних органов после ферментативного разрушения и дериватизация ТМУА (пивалевым ангидридом).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Стандарты гликолей и их производных, LGC Reference Standarts. Триметилуксусный ангидрид,[(СН3)3СС0]20, CAS 1538-75-6 SIGMA-ALDRICH. Триэтиламин, (C2H5)3N, CAS 131-44-8 ACROS ORGANICS. Трипсин-фермент (Trypsin - EC 3.4.31.4 From Porcine Pancreas), тип IX-S, CAS 9003-07-7, кат. № Т 0303, 10 г/упак., Sigma Chemical Co.
Подготовка проб
Экстракция этиленгликоля и других гликолей из крови, мочи, внутриглазной жидкости, содержимого желудка и дериватизация ТМУА. Пробу жидкостей биологического происхождения (300 мкл) смешать в пробирке с 40 мкл водного раствора пропандиола-1,3 (1,3-пропиленгликоль) (6 г/л) в качестве внутреннего стандарта. Для осаждения белка и экстракции аналита к пробе добавить 1 мл ацетона, встряхивать и центрифугировать. Надосадочную жидкость перенести в виалу и выпарить при 70 °C. Остаток растворить в 40 мкл смеси ТМУА - триэтиламина -метанола (30:1:1) и нагреть при 70 °C в течение 15 минут. Охлажденный раствор смешать с 300 мкл метанола.
Ферментативное разрушение ткани печени (почки). В колбу Эрленмейера емкостью 100 мл поместить через пластмассовую воронку 5 г пробы печени (почки) (средняя проба), нарезанной кусочками. Добавить 8 мл фосфатного буфера (рН 7,5), 1 мл свежеприготовленного раствора трипсина (5 мг/мл) в фосфатном буфере и стеклянные бусинки, закрыть пластмассовой пробкой, поместить в водяную баню со встряхиванием при температуре 57 °C на 3 часа. Оставить на ночь в холодильнике. Профильтровать через нейлоновую сетку. Водную фазу довести фосфатным буфером (рН 7,5) до 10 мл. 300 мкл водной фазы (аликвота 0,1 г ткани) исследовать, как биожидкости.
ГХ-МС анализ: Газовый хроматограф серии АТ МАЭСТРО 7830 c масс-селективным детектором АТ 5975 (Agilent Technologies). Тип ионизации: электронный удар (70 эВ). Диапазон масс 40-500 а.е.м. Колонка капиллярная Agilent 19091 S-433 HP-5MS 0,35 мм х 30 м х 0,35 мкм. Температурный режим колонки: начальная температура колонки 100 °C, время выдержки - 3 минуты, скорость подъема температуры в диапазоне 100-300 °C - 10 °Смин, время выдержки при 300 °C - 10 минут. Скорость газа-носителя (гелий) - 1 мл/мин. Температура испарителя 370 °C,
масс-селективного источника и квадруполя 230 и 150 °C соответственно. Объем вводимой жидкой пробы 0,5 мкл в режиме без сброса. Гликоли сначала идентифицировали сравнением полного масс-спектра со спектром стандарта и затем определяли количественно в режиме мониторинга индивидуальных ионов. Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций от 0,01 до 2 г/л.
В 2015 году этиленгликоль обнаружен при исследовании биопроб в 13 случаях, из них в 11 - в аутопсийном биоматериале, в 2 случаях в биожидкостях от живых лиц.
ВЫВОДЫ
1. Показана возможность использования в качестве внутреннего стандарта 1,2-пропандиола.
2. Представленный метод позволяет быстро и надежно идентифицировать и количественно определить трудно хроматографируемые и мало летучие гликоли, что имеет важное значение при постановке диагноза отравления гликолями для назначения адекватной терапии.
3. В судебно-химическом отделе ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» внедрены две методики исследований на гликоли и их токсичные метаболиты (органические кислоты) на двух системах газовых хроматографов с масс-селектив-ными детекторами с разными технологиями подготовки проб и анализа.
■ КОНЦЕНТРАЦИЯ КАРБОКСИГЕМОГЛОБИНА В КОСТНОМ МОЗГЕ ИЗ ГРУДИНЫ ПРИ СМЕРТЕЛЬНЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ ОКИСЫОУГЛЕРООА
д.м.н., проф. Е.О. Данченко1, к.м.н., доц. А.М. Тетюев2, А.М. Доброриз3
• Управление Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь по Витебской области, отдел судебно-химических экспертиз(нач. управления -подполковник юстиции Ю. А. Щетько)
• 2Витебский государственный медицинский университет, кафедра судебной медицины (зав. - к.м.н., доцент А. М. Тетюев)
• 3Управление Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь по Брестской области, управление лабораторных исследований вещественных доказательств биологического характера (нач. управления - полковник юстиции
В. О. Лагуновский)
• Аннотация: Цель данного исследования -сопоставить результаты количественного определения карбоксигемоглобина (COHb)
в костном мозге из грудины и в крови при смертельных отравлениях окисью углерода. Исследовались образцы крови и красного костного мозга из грудины от 35 трупов. Концентрация COHb в крови и костном мозге определялась спектрофотометрически. Установлено, что при отсутствии COHb в крови он не обнаруживается и в костном мозге. При концентрации COHb в крови от 51 до 93 % его концентрация в костном мозге составила от 27 до 81 %о. Статистически значимой корреляции между уровнем COHb в крови и костном мозге не установлено. В целом концентрация COHb в костном мозге была на 23 %о ниже, чем в крови.
• Ключевые слова: окись углерода, карбок-сигемоглобин, костный мозг, кровь, отравление
ВВЕДЕНИЕ
Смертельные отравления окисью углерода (СО) в Республике Беларусь занимают второе место в структуре смертельных отравлений (15-20 % всех отравлений) и составляют примерно 5 % от всех причин насильственной смерти.
Судебно-медицинский диагноз отравления СО основывается прежде всего на результатах определения концентрации карбоксигемоглобина (СОНЬ) в крови погибших.
Бывают случаи, когда взять для исследования жидкую кровь невозможно, например при значительном обескровливании или обугливании трупа, обнаружении частей трупа. Это обусловило интерес ряда исследователей к определению СОНЬ в сухой крови, во внутренних органах, карбоксимиоглобина в мышце. Бабаханян Р. В. и Бусова Н. С. (1986) провели количественное спектрофотометрическое определение СОНЬ в пятнах высохшей крови и установили, что при содержании СОНЬ в жидкой крови от 46 до 87 % его содержание в пятнах сухой крови составляло 28-66 %. Агеева Н. М. и соавт. (1980) определяли концентрацию СОНЬ во внутренних органах трупов и мышце. Содержание СОНЬ при смертельных отравлениях составило 16-75,8 %. Бабаханян Р. В. и соавт. (1987) предприняли попытку изучить возможность количественного определения СОНЬ в костном мозге. Авторами установлено, что концентрация СОНЬ в образцах костного мозга составляла 10-67 %, в параллельных образцах крови -29-88 %. Цель нашей работы - сопоставить результаты количественного определения СОНЬ в красном костном мозге из грудины и в крови при смертельных отравлениях окисью углерода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследовали образцы крови и красного костного мозга из грудины от 35 трупов. Концентрацию СОНЬ в крови определяли спектрофотометрически. К навеске костного мозга (3 г) добавляли хлороформ в объемном соотношении 1:3. Смесь встряхивали в течение 2 мин, затем центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, отбирали хлороформную фазу, к осадку добавляли 3 мл хлороформа, встряхивали 2 мин, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Обезжиренный костный мозг доводили дистиллированной водой до объема 25 мл. СОНЬ экстрагировали в темноте в течение 1 ч при периодическом перемешивании. Раствор фильтровали. Добавляли аммиак до конечной концентрации 0,1 %, затем исследовали согласно утвержденной методике определения СОНЬ в крови (Доброриз А. М. и соавт., 2008).
Данные представлены в виде абсолютных значений. По ходу изложения для некоторых результатов представлены медиана и диапазон. Корреляцию между концентрацией СОНЬ в костном мозге и параллельных образцах крови, а также между концентрацией СОНЬ в крови и наблюдаемой разницей с концентрацией СОНЬ в костном мозге, оценивали по непараметрическому коэффициенту ранговой корреляции Спирмена.
В крови 5 трупов лиц, обнаруженных на пожаре, СОНЬ в крови не обнаружен. В костном мозге от этих трупов СОНЬ также не обнаружен. Таким образом, не исключено, что отсутствие СОНЬ в костном мозге позволяет исключить отравление СО в случае невозможности исследовать жидкую кровь.
В 27 случаях концентрация СОНЬ в крови составила более 50 % (медиана 65 %, диапазон 51-93 %). В параллельных образцах костного мозга концентрация СОНЬ
