CC BY
83
УДК 547.91:577.115.3
ЭКСТРАКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧЕК БЕРЕЗЫ ПОВИСЛОЙ BETULA PENDULA ROTH. (BETULACEAE). 1. СОСТАВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ, УГЛЕВОДОРОДОВ И СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ
© Д.Н. Ведерников , В.И. Рощин
Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия им. С. М. Кирова, Институтский пер., 5, Санкт-Петербург, 194021 (Россия)
Е-mail: [email protected]
Это первое сообщение, посвященное исследованию состава углеводородного экстракта почек березы повислой Betula pendula (Betulaceae). В экстракте идентифицированы насыщенные, состава С16-С28 (четное количество атомов), и ненасыщенные (линолевая и линоленовая) жирные кислоты, Р-кариофиллен и a-гумулен, компоненты эпикутикулярных восков кроющих чешуек: н-алканы, состава С21-С26, сложные эфиры жирных кислот, состава С16-С28 (четное количество атомов), и жирных спиртов, состава С18-С30 (четное количество атомов).
Определены газохроматографические индексы удерживания всех идентифицированных соединений.
Ключевые слова: Betula pendula Roth. (Betula verrucosa Ehrh.), вегетативные почки, углеводородный экстракт, углеводороды, свободные и связанные кислоты, алканы и сложные эфиры эпитикулярных восков.
Введение
Березовые почки являются лекарственным сырьем, используемым в народной и традиционной медицине. Однако знание химического состава низкомолекулярных соединений почек недостаточно. известно, что количество экстрактивных веществ, большая часть которых - низкомолекулярные вещества, в почках превышает 56% [і]. Половина этого количества экстрагируется из почек петролейным эфиром. В состав экстракта входят кислоты и сложные эфиры [1]. имеются данные о составе флавоноидов [2-4] и сесквитерпе-новых соединений [5, 6]. В экстракте из почек, полученном экстрагированием диэтиловым эфиром, обнаружены триацилглицериды и кумараты сесквитерпеновых спиртов [6].
Экспериментальная часть
Почки березы повислой Betula pendula (Betulaceae) были собраны непосредственно перед распусканием в середине апреля. Почки собирали с березы, произраставшей в районе поселка рощино Ленинградской области. Вид березы определен на кафедре ботаники Санкт-Петербургской лесотехнической академии. Экстракцию 140 г сырых целых почек березы (ПБ) средней влажностью 34% проводили петролейным эфиром (40-70 °С) в течение 6 ч. После удаления петролейного эфира выпариванием при пониженном давлении экстракт (26,6 г) растворили в диэтиловом эфире и разделили известным способом [7] на нейтральные вещества (21,3 г) и высшие жирные кислоты (5,3 г).
Часть нейтральных веществ (1 г) омылили спиртовым раствором гидроксида калия и разделили на неомыляемые вещества 84% и «связанные» кислоты 14 % по известной методике [7]. Кислоты метилировали диазометаном для последующего хромато-масс-спектрометрического исследования.
Остаток нейтральных веществ хроматографировали на колонке с силикагелем АСКГ с размером зерен 100-200 меш (г. Воскресенск). В качестве элюента использовали петролейный эфир с добавкой от 3 до 8% диэтилового эфира, а затем бензол с возрастающей добавкой от 1 до 20% ацетона (табл. 2).
* Автор, с которым следует вести переписку.
Щелочной гидролиз фракции сложных эфиров (табл. 2, фракция 2; ИК-спектр: полоса поглощения 1720 см-1) проводили кипячением 50 мг вещества в 10 мл 0,5 н раствора KOH в этаноле в течение 1,5 ч. После отделения солей жирных кислот от неомыляемых веществ соли перевели в кислоты подкислением 10% H2SO4, а кислоты метилировали диазометаном для хромато-масс-спектрометрического анализа. Спирты, выделенные после гидролиза сложных эфиров, ацетилировали смесью: уксусный ангидрид - пиридин (1 : 2) и анализировали методом хромато-масс-спектрометрии. Масс-спектры углеводородов (фракция 1), спиртовых и кислотных составляющих сложных эфиров сравнили с данными масс-спектров соответствующих соединений банка данных NIST 98.
Для анализа использовали хромато-масс-спектрометр с газовым хроматографом 6850А модели G2629A с селективным масс-спектрометрическим детектором HP5973 Network и модели G2577A фирмы «Agilent Technologies, Inc.». Энергия ионизации - 70 эВ. Температура сепаратора - 280 °С, ионного источника -230 °С. Колонка кварцевая HP-5MS 30000x0,25 мм со стационарной фазой (5% фенилметил-силоксан) толщиной 0,25 мкм. Температура колонки: программирование температуры от 150 до 280 °С со скоростью 5 °С в минуту и 10 мин изотермы при 280 °С При анализе сесквитерпенов - программирование температуры от 100 до 280 °С со скоростью 5 °С в минуту. Температура испарителя - 280 °С. Скорость газа носителя (гелия) - 1 см3/мин. Дозируемый объем - 0,1 мкл. Индексы удерживания веществ определили по временам удерживания н-алканов фирмы Aldrich. Алканы выбрали такими, чтобы время удерживания характеризуемых соединений находилось между их временами удерживания. Индексы удерживания рассчитали после определения коэффициентов функции I=ax2+bx+c, где I - индекс удерживания, т - время удерживания. Для расчета использовали программу Advanced Grapher 2.08. Индексы удерживания сравнили с данными для аналогичных соединений. Количественные составы фракций определяли методом внутренней нормализации.
ЯМР-спектроскопия. Прибор - Bruker-AM 500 (500 МГц). Растворитель - CDCl3 , 5 - шкала.
ИК-спектры снимались на приборе ИК-Фурье-спектрометр ФСМ 1201 ООО «Мониторинг» в таблетках KBr.
Обсуждение результатов
Групповой состав почек приведен в работе [2].
Выход веществ, растворимых в петролейном эфире, составил 28,8% от массы сухих почек. Групповой анализ углеводородного экстракта показал, что в его состав входят нейтральные соединения и кислоты, а в состав нейтральных соединений входят спирты и сложные эфиры [2]. Количество «свободных» кислот, выделенных из экстракта водным раствором щелочи, - 7,9% от массы сухих почек. Часть нейтральных веществ была омылена щелочью, что дало содержание «связанных» кислот - 14% и неомыляемых соединений - 84%. Составы кислот, определенные хромато-масс-спектрометрическим методом после метилирования, приведены в таблице 1. Основными компонентами фракции жирных кислот являются кислоты с 22 и 28 углеродными атомами. В состав кислот входят ненасыщенные кислоты, но отсутствует олеиновая кислота. Качественный состав жирных кислот, входящих в состав «связанных» кислот, аналогичен составу «свободных» кислот экстракта. Наибольшее содержание фракции составляет кислота с 22 атомами углерода. Метиловый эфир и-метоксикоричной кислоты был идентифицирован сравнением масс-спектра и индекса удерживания с прометилированной диазометаном кумаровой кислотой, выделенной из почек березы [6].
Вероятно, в составе «связанных» кислот присутствует не и-метоксикоричная кислота, а и-кумаровая кислота, входящая в состав кумаратов сесквитерпеновых спиртов [6].
Нейтральные вещества были разделены на группы соединений, отличающиеся по своей полярности хроматографией на силикагеле (табл. 2).
Первая элюированная из колонки фракция (1,5%) на тонкослойной хроматограмме не проявлялась серной кислотой, но после отгонки растворителя состояла из аморфного вещества белого цвета. В ИК-спектре фракции отсутствовали полосы, характерные для кислородсодержащих групп. Фракцию далее анализировали хро-мато-масс-спектрометрическим методом. Сравнивали времена удерживания компонентов фракции с временами удерживания известных н-алканов фирмы Aldrich. Было установлено, что в составе фракции отсутствуют разветвленные алканы. В состав алканов входят углеводороды: C2JH44 - 9,5%; С22Н46 - 0,1%; С23Н48 - 3,5%; С24Н50 - 0,3%; C25H52 - 27,3%; С26Н54 - 0,6%; преобладающий углеводород - C27H56 - 38,0%.
Вслед за предельными углеводородами из колонки элюировались сесквитерпены.
Таблица 1. Состав «свободных» и «связанных» высших жирных кислот петролейного экстракта
Кислота Количественное содержание, % Газохроматографический индекс удерживания метилового эфира (I) индекс удерживания по литературным данным
«свободные» * кислоты «связанные»** * кислоты
3-(4-метоксифенил)-2-пропеновая - 11,8 1792
и-метоксикоричная
Гексадекановая кислота 4,8 3,7 1926 1923 [8]
Пальмитиновая
Линолевая 6,7 1,9 2107 2097 [9]
Цис, цис-октадекадиен-9,12-овая
Линоленовая цис, цис, цис- 8,5 0,9 2113 2098 [9]
октадекатриен-9,12,15-овая
Октадекановая 1,5 0,7 2137 2121 [8]
Стеариновая
Эйкозановая 7,9 16,2 2335 2324 [8]
Арахиновая
Докозановая 19,6 45,4 2538 2524 [8]
Бегеновая
Тетракозановая 15,2 13,5 2740 2725 [8]
Лигноцериновая
Гексакозановая 15,2 3,6 2943 2918 [8]
Октакозановая 20,6 2,2 3144 3112 [8]
Количественное содержание от суммы кислот.
Под «связанными» кислотами понимаются кислоты, остатки которых входят в состав сложных эфиров, образующиеся при их щелочном гидролизе и растворяющиеся в водной щелочи.
Таблица 2. Результаты хроматографии нейтральных веществ
№ Элюент Класс соединений % от нейтральных веществ Метод отнесения
1 ПЭ Насыщенные углеводороды 1,5 ик
1А ПЭ Ненасыщенные углеводороды 0,5 ТСХ (метчик - сквален)
2 ПЭ:ДЭ (3%) Сложные эфиры 12,0 ик
3 ПЭ: ДЭ (5-6%) Карбонильные соединения и оксиды 9,9 ик
4 ПЭ : ДЭ (7-8%) Сложные эфиры 25,7 ик
5 Бензол Кислоты 9,2 ик, ТСХ (бром)
6 Бензол : ацетон (1%) Флавоноиды 5,8 ЯМР
7 Бензол : ацетон (3%) Спирты 14,4 ик
8 Бензол : ацетон (5%) Сложные эфиры 2,3 ик
9 Бензол : ацетон (7%) Флавоноиды 1,5 ЯМР
10 Бензол : ацетон (8%) Спирты 1,6 ик
11 Бензол : ацетон (10%) Спирты 2,8 ик
12 Бензол : ацетон (11%) Флавоноиды 1,0 ЯМР
12 Бензол : ацетон (15%) Кислоты 1,5 ик, ТСХ (бром)
13 Бензол : ацетон (20%) Спирты 1,0 ик
14 * Полиоксисоединения 9,2 Не идентифицированы
Фракция сесквитерпенов была повторно разделена на колонке, и первое элюированное из колонки соединение сравнением спектра ЯМР 1 Н и масс-спектра с соответствующими спектрами, опубликованными в [10] и приведенными в банке спектров NIST 98, идентифицировано как р-кариофиллен I (0,5% от экстракта). Отнесение сигналов на спектре а-гумулена II (<0,1%) было сделано сравнением с имеющимися в литературе спектрами гумуленолов [11-13]. На спектре гумулена, в отличие от спектра кариофиллена, отсутствуют сигналы экзометилено-вых протонов, но присутствуют сигналы от четырех протонов при атомах углерода двойной связи, сигналы двух из четырех метильных групп сдвинуты в область слабого поля, и имеются характерные для производных гумулена сигналы протонов при і и 2-м атомах углерода. В литературе нами не обнаружены данные ЯМР1Н спектра гумулена, поэтому мы приводим их в таблице 3. идентификация гумулена также подтверждена сравнением масс-спектра с банком данных NIST-98.
(I)
(II)
Таблица 3. ЯМР1Н спектральные данные а-гумулена Фракция 2 (табл. 2), элюированная из колонки
после терпеновых углеводородов, при упаривании растворителя содержала белое аморфное вещество. В ИК-спектре присутствовала полоса 1730 см1, характерная для сложных эфиров. В ЯМР 1Н спектре вещества имеется триплет при 4,04 м.д., 2Н (I = 7,25 Гц), характерный для фрагмента -СН-О-. Триплет при 2,27 м.д., 2Н (I = 8,0 Гц) относят к метиленовым протонам у атома углерода фрагмента -О-С(О)-СН2-. Дальнейший анализ фракции проводили после ее омыления и разделения на спирты и кислоты. Кислоты в виде метиловых эфиров и спирты далее анализировали методом хромато-масс-спектрометрии. Компоненты фракций идентифицировали сравнением индексов удерживания и масс-спектров со спектрами банка данных (табл. 4). В литературе для некоторых спиртов не приведены индексы удерживания, но даны для их ацетатов, поэтому были синтезированы ацетаты и сравнены данные удерживания.
Кислотная составляющая фракции 2 сложных эфиров (табл. 2) отличается по составу соединений от фракций «свободных и связанных» высших жирных кислот (табл. 1). В первую очередь это связано с отсутствием ненасыщенных С18 кислот. Возможно, что соединения этой фракции сложных эфиров были извлечены из оболочки почки и входят в состав так называемых эпикутикулярных восков. В такие воски кроме сложных эфиров аналогичного состава входят и алканы [17].
№ углеродного атома 5 (і, Гц) для II
1 1Н 5,15 д (15,8)
2 1Н 5,58 дт (15,8;7,3)
3 2Н 2,50 шир. д (7,3)
5 1Н 4,94 дт (1=6,9; 6,3; 1,2)
6 2Н 2,10 м
7 2Н 2,08 м
9 4,89 дт (1=7,5; 7,6; 0,9)
10 1,90 шир. д (1=7,5)
12 1,05 с
13 1,05 с
14 1,63 д (1=1,2)
15 1,42 д (1=0,9)
Таблица 4. Состав и индексы удерживания терпенов, кислотных и спиртовых составляющих сложных эфиров
Соединение Количественное содержание, % Газохроматографический индекс удерживания I Индекс удерживания из литературных данных
Терпеновые углеводороды:
Р-кариофиллен 0,5* 1451 1420 [14]1)
а-гумулен <0,1* 1488 1452 [15]1)
Сложные эфиры (фракция 2 табл. 3):
Спиртовая составляющая:
1-октадеканол 0,4 2086 2084 [16]2)
Ацетат октадеканола - 2211 2205 [8]1)
Эйкозанол 31,6 2290 2282 [16]2)
Ацетат эйкозанола - 2413 2406 [8]
1-доказанол 50,0 2493 2498 [16]2)
Ацетат доказанола - 2617 2604 [8]1)
1-тетракозанол 7,4 2697
Ацетат тетракозанола - 2816 2804 [8]1)
1-гексакозанол 2,8 2900
Ацетат гексакозанола - 3019 2996 [8]1)
1-октакозанол 1,2 3120
Ацетат октакозанола - 3219 3190 [8]1)
1-триаконтанол 0,4 3306
Ацетат триаконтанола - 3420
Кислотная составляющая: **
Гексадекановая кислота 7,1 1926 1923 [8]1)
Октадекановая кислота 6,5 2137 2121[8]1)
Эйкозановая кислота 18,7 2335 2324[8]1)
Докозановая кислота 22,7 2538 2524 [8]1)
Тетракозановая кислота 7,5 2740 2725 [8]1)
Гексакозановая кислота 5,5 2943 2918[8]1)
Октакозановая кислота —ЯГ— 1 5,6 3144 3112[8]1)
Количественное содержание от нейтральных веществ.
Количественное содержание компонентов от суммы соответствующей составляющей сложных эфиров. '-1 Для фазы НР-5 по ссылке [10].
2) Для фазы 5% фенилметил-силоксан, как в настоящей работе.
Выводы
В составе петролейного экстракта березовых почек идентифицированы насыщенные, состава С16-С28 (четное количество атомов), и ненасыщенные (линолевая и линоленовая) жирные кислоты, p-кариофиллен и а-гумулен, н-алканы, состава С21-С26, сложные эфиры жирных кислот, состава С16-С28 (четное количество атомов), и жирных спиртов, состава С18-С30 (четное количество атомов). Определены газохроматографические индексы удерживания всех идентифицированных соединений. Алканы и сложные эфиры являются, вероятно, компонентами эпикутикулярных восков.
Список литературы
1. Ведерников Д.Н., Галашкина Н.Г., Карачкина Н.Г., Рощин В.И. Групповой состав компонентов почек Betula pendula Roth. // Растительные ресурсы. 2004. Вып. 2. С. 83-89.
2. Галашкина Н.Г., ВедерниковД.Н., Рощин В.И. Флавоноиды почек Betula Pendula Roth. // Растительные ресурсы. 2004. Вып. 1. С. 62-68.
3. Кононенко Г.П., Поправко С.А., Вульфсон И.С. Флавоноидные агликоны почек березы бородавчатой (Betula verrucosa) // Биоорганическая химия. 1975. Т. 1. №4. С. 506-511.
4. Поправко С.А., Кононенко Г.П., Тихомирова В.И., Вульфсон И.С. Вторичные метаболиты березы. IV. Идентификация группы флавоноидных агликонов в почках березы бородавчатой (Betula verrucosa) // Биоорганическая химия. 1979. Т. 5. №11. С. 1662-1667.
5. Максютина Н.П. Растительные лекарственные средства. Киев, 1985. 279 с.
6. Ведерников Д.Н., Галашкина Н.Г., Рощин В.И. Сложные эфиры почек Betula pendula (Betulaceae) // Растительные ресурсы. 2007. Вып. 3. С. 84-92.
7. Рощин В.И., Баранова Р.А., Белозерских О.А., Соловьев В.А. Состав экстрактивных веществ хвои и побегов ели европейской // Химия древесины. 1983. №4. С. 56-61.
8. Jimenez J.J., Bernal J.L., Aumente S., Toribio L., Bernal J.Jr. Quality assurance of commercial beeswax. II. Gas chromatography-electron impact ionization mass spectormetry of alcohols and acids // J. of Chromatogr. A. 2003. V. 1007. P. 101-116.
9. Senatore F., Rigano D., de Fusco R., Bruno M. Composition of the essential oil from flowerheads of Chrysanthemum coronarium L. (Asteraceae) growing wild in Southern Italy // Flavour Fragr. J. 2004. V. 19. P. 149-152.
10. Barrero A.F., Molina J., Oltra J.E., Altarejos J., Barragan A., Lara A., Segura M. Stereochemistry of 14-hydroxy-P-caryophyllene and related compounds // Tetrahedron. 1995. V. 51. №13. P. 3813-3822.
11. Barrero A.F., Enrique Oltra J. Minor Components in the Essential oil of Juniperus oxycedrus L. Wood // Flav. and Fragr. J. 1993. V. 8. P. 185-189.
12. Damodaran N.P., Dev S. Studies in sesquiterpenes-XXXIX. Structure of Humulenols // Tetrahedron. 1968. V. 24. P. 4133-4142.
13. Barrero A.F., Herrador M.M., Arteaga P. Sesquiterpenes and phenylpropanoids from Seseli Vayredanum // Phytochemistry. 1992. V. 31. №1. P. 203-207.
14. Celik S., Gokturk R.S., Flamini G., Cioni P.L., Morelli I. Essential oils of Phlomis leucophracta, Phlomis chimerae and Phlomis grandiflora var. grandiflora from Turkey // Biochem. Syst. Ecol. 2005. V. 33. P. 617-623.
15. Stashenko E.E., Jaramillo B.E., Martinez, J.R. Comparison of different extraction methods for the analysis of volatile secondary metabolites of Lippia alba (Mill.) N.E. Brown, grown in Colombia, and evaluation of its in vitro antioxidant activity // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1025. P. 93-103.
16. Li J., Xu H., Shi J., Li C., Bao C. Studies of the major degradation products of a higher alkyl poly acrylate using pyrolysis gas chromatography-mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 1999. №402. P. 311-318.
17. Misra S., Ghosh A. Analysis of epicuticular waxes // Modern methods of plant analysis, New series. Berlin. 1996. V. 17. P. 277-283.
Поступило в редакцию 6 июля 2008 г.
