CC BY
49
Химия РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2011. №1. С. 111-11S.
УДК 582.632+547.913.5+547.914.4
ЭКСТРАКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ПОЧЕК БЕРЕЗЫ ПОВИСЛОЙ BETULA PENDULA ROTH. (BETULACEAE). 4. СОСТАВ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫХ ДИОЛОВ, ТРИОЛОВ, ФЛАВОНОИДОВ
© Д-Н. Ведерников , В.И. Рощин
Санкт-Петербургская государственная лесотехническая академия им. С.М. Кирова, Институтский пер., 5, Санкт-Петербург, 194021 (Россия) e-mail: [email protected]
Сообщение посвящено исследованию состава углеводородного экстракта почек березы повислой Betula pendula (Betulaceae). В экстракте идентифицированы 3,5-дигидрокси-7,4'-диметоксифлавон, 5,7-дигидрокси-3,4'-диметокси-флавон, 7-метокси-4',5-дигидроксифлаванон, 4'-метокси-5,7-гидроксифлаванон, 5р,6а-дигидроксикариофилла-4(14), S^^flneH^lR^R^R^S^^-flnmflpoKcn-l 1,1 Ьдиметил^^-диметиленбициклор^^ундекан), 5р,6а-дигидроксикариофилла-3Д15)-диен ((1R,5R,6R,9S)-5,6-AHraflpoKCH-11,1 l-AHMeTrni-S-MemreHeHnnraop.l^yHfle^-eH), 6а,9Р-дигидрокси-а-
гумулен((1Е, 4E, 6R, 9S)6,9-дигидpoкcи-4,П,П-тpимeтил-S-мeтилeн-i,4-циклoyндeкaдиeн), 5p,6a,SP-TpnraflpoKCHKapHonaH; (1R,5R,6R,SR,9S)-TpHraflpoKCHKapHonaH. Определены газохроматографические индексы удерживания всех идентифицированных соединений.
Ключевые слова: Betula pendula Roth. (Betula verrucosa Ehrh.), вегетативные почки, углеводородный экстракт, сеск-витерпеновые диолы, триол, флавоноиды.
Введение
Ранее [1-3] мы сообщали о составе алканов и сесквитерпеновых углеводородов, высших жирных кислот (свободных и связанных в виде сложных эфиров), карбонильных соединений, оксидов и сложных эфиров, сесквитерпеновых спиртов, тритерпеновых кислот. В настоящем сообщении приведены результаты исследования состава минорных компонентов петролейного экстракта: спиртов, флавоноидов, тритерпеновых кислот.
Экспериментальная часть
Происхождение образцов почек березы, их характеристика, методы экстракции и разделения экстракта на фракции приведены в [1].
Для хроматографического анализа использовали хромато-масс-спектрометр с газовым хроматографом 6S50A, модели G2629A c селективным масс-спектрометрическим детектором HP5973 Network, модели G2577A фирмы «Agilent Technologies, Inc.» Энергия ионизации 70 эВ. Температура сепаратора 2S0 “С, ионного источника 230 “С. Колонка кварцевая HP-5MS 30000x0,25 мм со стационарной фазой (5% фенилметил-силоксан) толщиной 0,25 мкм. Анализ сесквитерпеноидов проводили с программированием температуры термостата от 100 до 2S0 “С со скоростью 5 “Св минуту; анализ флавоноидов - от 150 до 2S0 “С со скоростью 5 “Св минуту и 30 мин изотермы при 2S0 “С. Температура испарителя 2S0 “С. Скорость газа носителя (гелия) 1 см3/мин. Дозируемый объем
0,1 мкл. Индексы удерживания веществ определили по временам удерживания н-алканов фирмы Aldrich. Алка-ны выбрали такими, чтобы время удерживания характеризуемых соединений находилось ме^ду их временами удерживания. Индексы удерживания рассчитали после определения коэффициентов функции I=ax2+bx+c, где I -индекс удерживания, т - время удерживания. Для расчета использовали программу Advanced Grapher 2.0S. Индексы удерживания сравнили с данными для аналогичных соединений. Флавоноиды метилировали диазометаном для последующего хромато-масс-спектрометрического исследования.
Масс-спектр снимался на приборе МХ-1321, энергия ионизации 70 эВ, прямой ввод.
ЯМР-спектры регистрировали на приборе Bruker-AM 500 (500 и 125,76 МГц для спектров ЯМР 1Н и 13С соответственно). Растворитель - CDCl3, 5-шкала.
* Автор, с которым следует вести переписку.
ИК-спектры снимали на приборе ИК-Фурье спектрометр ФСМ 1201 ООО «Мониторинг» в пленке.
УФ-спектры регистрировали на приборе Shimadzu-UV-2401. Растворитель - этанол.
Удельное вращение определяли на приборе Perkin Elmer Polarimeter, Model 341. Длина волны - 589 нм, растворитель - хлороформ, длина кюветы - 1 дм.
Масс-спектрометрический анализ высокого разрешения проводился на ион-циклотронном масс-спектрометре Varian 902-MS MALDI Mass Spectrometer со сверхпроводящим магнитом 9,4 Тесла. Десорбция и ионизация пробы осуществлялись с помощью третьей гармоники (355 нм) Nd : YAG лазера. Сухой образец, взятый в виде порошка, смешивался со значительно преобладающим количеством матрицы (в качестве матрицы использовалась 2,5-дигидрокси-бензойная кислота), взятой тоже в сухом виде. Смесь образца и матрицы растворялась в ацетоне (матрица растворялась частично). 0,5 мкл раствора наносилось на мишень и высушивалось на воздухе при комнатной температуре. Определение точной молекулярной массы пробы производилось методом внутренней калибровки, при которой, одновременно с регистрацией массы исследуемого образца, регистрируются массы стандартных образцов.
Хроматографию фракций проводили градиентным элюированием на колонке с силикагелем АСКГ с размером зерен 100-200 меш (г. Воскресенск). В качестве элюента использовали петролейный эфир с добавкой от 3 до 40% диэтилового эфира, а затем бензол с возрастающей добавкой от 1 до 20% ацетона.
Для препаративной ТСХ использовался силикагель фирмы Lachema с размером частиц 5/40 меш.
Физико-химические и спектральные характеристики выделенных соединений
3,5-дигидрокси-7,4'-диметоксифлавон; кемпферол-7,4'-диметиловыи эфир; пиллоин (1)
Тпл=173-175 °С (желтый порошок из бензола), литературные данные [4] 170-174 °С.
УФ-спектр: X max 252, 268, 288, 317, 366 нм.
ЯМР'Н в CDCl3 (5): 11,73 (с, 1Н, C5-OH), 8,17 (д, 2Н, J=8,8 Гц, Н2',6'), 7,03 (д, 2Н, J=8,8 Гц, Н3',5'), 6,45(д, J=1,5 Гц, Н8), 6,37 (д, J=1,5 Гц, Н6), 3,88, 3,89 (синглеты на 3Н каждый, 7 и 4' ОМе); в CD6CO: 5=12,10 (с, 1Н, С5-ОН), 8,23 (д, 2Н, J=8,2 Гц, Н2', 6'), 7,11 (д, 2Н, J=8,2 Гц, Н3', 5'), 6,68 (д, 1H, J=1,8 ГцН8), 6,31 (д, 1H, J=1,8 Гц, Н6), 3,92, 3,89 (синглеты на 3Н каждый, 7 и 4' ОМе).
ЯМР13С в CDCl3 (5C): С2 - 165,6; С3 - 137,9; С4 - 177,0; C5 - 163,2; С6 - 98,6; С7 - 164,0; С8 - 92,9; C9 -156,2; C10 - 106,2; С1' - 124,4, C2', 6' - 130,5; C3', 5' - 115,1, С4' - 158,9, OCH3: 56,0; 56,6.
Масс-спектр (m/z): 314(100), 315(25), 300(20), 299(23), 298(23), 271(12), 157(9), 135(20), 134(30), 121(22). Спектральные характеристики соответствуют 3,5-дигидрокси-7,4'-диметоксифлавону [5].
5,7-дигидрокси-3,4'-диметоксифлавон; кемпферол-3,4'-диметиловыи эфир; эрманин (2)
Тпл=228-231 °С (желтый порошок из бензола), литературные данные [6] 231-232 °С.
ЯМР'Н в CD6CO (5): 12,79 (с, 1H, C5-OH); 8,07 (д, 2H, J=8,7 Гц, H - 2',6'); 7,08 (д, 2H, J=8,7 Гц, H - 3', 5'); 6,50 (д, 1H, J=1,7 Гц, H8); 6,25 (д, 1H, J=1,7 Гц, H6); 3,89 (с, 6H, 3, 4' - OMe).
Масс-спектр (m/z): 314(100), 313(64), 299(11), 296(15), 295(11), 286(5), 285(16), 271(47), 243(2), 153(10), 135(25), 107(4).
После метилирования диазометаном соединения (1) и (2) превращаются в соединение, которому соответствуют при ГЖХ-МС-анализе индекс удерживания 2805 и масс-спектр (m/z): 329(9), 328(45), 327(42), 313(4), 309(8), 299(24), 298(100), 285(23), 269(24), 166(8), 150(9), 135(21). Масса 328 соответствует триметокси-5-гидроксифлавону.
7-метокси-4',5-дигидроксифлаеанон; сакуренетин; нарингенин-7-метиловыи эфир (6)
Тпл=149-151 °С (желтые иглы из бензола), литературные данные [4]: 149-151 °С.
УФ-спектр: Xmax=318, 284, 224 нм.
ЯМР1Н-спектр в CDCl3 (5): 12,13 (с, 1H, C5-OH); 7,38 (д, 2H, J=8,3 Гц, H - 2',6'); 6,89 (д, 2H, J=8,3 Гц, H - 3', 5'); 6,04 (д, 1H, J=1,2 Гц, H8); 6,03 (д, 1H, J=1,2 Гц, H6); 5,48 (дд, 1H, J=2,8 Гц, J=13 Гц, H2); 3,84 (с, 3H, 7-OMe); 3,18 (дд, 1H, J=13 Гц, J=15 Гц, H-3a); 2,75 (дд, 1H, J=2,8 Гц, J=15 Гц, H-3e).
Спектральные характеристики соответствуют [7].
4'-метокси-5,7-дигидроксифлаеанон; изосакуренетин; нарингенин-4'-метиловыи эфир (7)
Тпл=193-195 °С (желтые иглы из бензола).
УФ-спектр: Xmax=317, 287.
Масс-спектр (m/z): 286(45); 285(22);269(4);79(12);153(7),152(10);134(100);124(10);121(55).
ЯМР'Н в CDCl3 (5): 12,03 (c, 1H, C5-OH); 7,33 (д, 2H, J=8,3 Гц, H - 2', 6'); 6,87 (д, 2H, J=8,2 Гц, H - 3', 5'); 5,99 (д, 1H, J=1,9 Гц, H8); 5,97 (д, 1H, J=1,9 Гц, H6); 5,33 (дд, 1H, J=2,9 Гц, J=12,9 Гц, H2); 3,82 (с, 3H, 4'-OMe); 3,06 (дд, 1H, J=12,9 Гц, J=17,2 Гц, H-3a); 2,77 (дд, 1H, J=2,9 Гц, J=17,2 Гц, H-3e)
Спектральные характеристики соответствуют изосакуранетину [7, 8].
5Д 6а-дигидроксикариофилла-4(14),8(15)-диен; (1Я, 5Я, 6Я,9Б)-5, б-дигидрокси-11,11 -диметил-4,8-диметилен-
бицикло[7.2.0]ундекан
Масс-спектр (ш^): 236(<1), 221(1), 203(7), 191(5), 189(5), 175(15), 161(15), 152(73), 133(30), 121(35), 107(46), 95(66), 93(64), 79(61), 71(63), 69(82), 55(47), 41(100), 29(17).
ИК-спектр (V, см-1): 3378, 2951, 1710, 1640, 1452, 1368, 1187, 1063, 1039, 890.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (МАЬБ1): 259,1674 (М+№) (100); 260,1708 (16,4); 261,1742
(1.3). Расчет массы: 259,1674 (М+№) (100); 260,1708 (16,2); 261,1741 (1,2). С 69,47; Н 9,33; № 8,86; О 12,34. [а]с20 +27,8° (с 1,90; СНС13)
5Д 6а-дигидроксикариофилла-3,8(15)-диен((1Я, 5Я,6Я,98)-5,6-дигидрокси-11,11-диметил-8-метиленби-цикло[7.2.0]ундец-3-ен)
ИК-спектр (V, см-1): 3396, 2952, 2928, 2859, 1964, 1717, 1631, 1451, 1438, 1380, 1367, 1256, 1189, 1065,1041, 887.
Масс-спектр (ш^): 236(2), 218(6), 203(15), 189(21), 175(25),161(13), 151(26), 138(28), 123(40), 109(53), 95(83), 93(61), 85(77), 71(100), 55(51), 41(87), 29(19).
Масс-спектрометрия высокого разрешения (МАЬБ1): М+№ 259,1677 (100); 260,1709 (16,4); 261,1744 (1,1). Расчет массы: 259,1674 (М+№) (100); 260,1708 (16,2); 261,1741 (1,2). С 69,47; Н 9,33; № 8,86; О 12,34. [а]с20 +83,0° (с 2,00; СНС13)
6а,9а-дигидрокси-а-гумулен; (1Е,4Е,6Я,9£>)6,9-дигидрокси-4,11,11-триметил-8-метилен-1,4-циклоундекадиен Масс-спектр (ш^): 236(1), 218(7), 203 (15), 193(4), 185(14), 175(18), 157(17), 151(56), 147 (25), 135 (38), 133(37), 123(68), 121(50), 107(66), 95(76), 91(79), 81(83), 69(83), 55(58), 41(100), 29(18).
ИК-спектр (V, см-1): 3390, 1715, 1446, 1385, 1362, 1095, 1006, 890.
Масс-спектрометрия высокого разрешения (МАЬБ1): 259,1677 (М+№) (100); 260,1712 (16,1); 261,1743
(1.3). Расчет массы: 259,1674 (М+№) (100); 260,1708 (16,2); 261,1741 (1,2). С 69,47; Н 9,33; № 8,86; О 12,34. 5Д 6а, 8^-тригидроксикариолан; (1Я, 5Я, 6Я, 8Я, 9£>)-тригидроксикариолан-(1Я 4Б, 5Я, 6Я, 8Я, 9Б)-5,6,8-тригидрокси-
4,11,11-триметилтрицикло[6.3.14-8.01'9]ундекан
Кристаллы из смеси гексан : ацетон - 1 : 1, ^=177-178 °С.
ИК-спектр (V, см-1): 3345; 2928, 2867, 1460, 1365, 1323, 1110, 1049.
Масс-спектр (ш^): 254(<1), 236(5), 218(8), 203(10), 200(8), 193(6), 182(55), 179(50), 161(44), 143(68), 134(39), 125(62), 123(80), 109(61), 97(61), 95(70), 81(74), 69(72), 55(100), 43(82), 41(87), 29(24).
Масс-спектрометрия высокого разрешения (МАЬБ1): 277,1810 (М+№) (100); 278,1826 (16,5); 279,1852
(1.3). Расчет массы: 277,1789 (М+№) (100); 278,1813 (16,2); 279,1847 (1,2). С 64,96; Н 9,45; № 8,29; О 17,31. [а]с20 -3,7° (с 1,53;СНС13)
Обсуждениерезультатов
Фракции 9, 10, 11, 13 петролейного экстракта почек березы [1] (6,6% от петролейного экстракта) были объединены для повторной хроматографии на колонке с силикагелем (табл. 1). Состав фракции 12, которая содержит тритерпеновые кислоты, будет обсужден в следующем сообщении.
Разделение веществ (1) и (2) проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе бензол - метилцеллозольв (4 : 0,2).
Вещества (1) и (2) обладают одинаковой молекулярной массой, равной 314. В ЯМР 1Н-спектрах обоих соединений в слабом поле имеется сигнал - синглет интенсивностью на 1Н при 12,10 м.д. (для соединения (1)) и 12,79 м.д. - для соединения (2), характерный для протона ОН-группы у пятого атома углерода флаво-ноида. Также имеются сигналы, характерные для пара-замещения кольца В: 8,23 и 7,11 м.д.- для соединения (1); 8,07 и 7,08 м.д.- для соединения (2). Кроме этого, в спектрах обоих соединений видны сигналы протонов кольца А - два дублета на 1Н каждый с центрами 6,68 (1=1,8 Гц) и 6,31 (1=1,8 Гц) для вещества (1); 6,50 (1=1,7 Гц) и 6,25 м.д. (1=1,7 Гц) для вещества (2). Также в ЯМР 1Н спектрах обоих соединений в сильном поле имеются по два синглета 3,92 и 3,89 м.д. для соединения (1) и 3,89 и 3,89 м.д. для соединения (2) на 3Н каждый - сигналы протонов двух метоксильных групп. Отсутствие сигналов протонов кольца С и молекулярная масса 314 свидетельствуют о том, что данные вещества являются флавонолами. Сходство спектров соединений (1) и (2) указывает на то, что эти вещества - изомеры. Анализ простых, одномерных ЯМР 1Н-спектров соединений не позволяет сделать вывод о положении групп ОСН3 и ОН-групп в ароматических кольцах флавоноидов. Для установления строения был использован метод масс-спектрометрического анали-
за [9]. Результаты масс-спектрометрии совместно с данными ЯМР 'Н-спектров выделенных соединений позволяют определить положение функциональных групп в структуре молекулы. На рисунке 1 представлена схема основных путей распада флавонолов при электронном ударе. При электронном ударе молекула фла-вонола распадается на два основных фрагмента «а» и «Ь» (рис. 1). Наличие фрагмента «а» с массой 167 или 153 указывает на присутствие в кольце А флавонола метоксила или гидроксила соответственно. Существование метоксильной или гидроксильной группы в кольце В устанавливается по фрагменту «Ь». Массовый пик 135 на спектре указывает на наличие в структуре кольца В флавоноида метоксильной группы, а пик 121 - гидроксильной. Пик 151 свидетельствует о присутствии в кольце В метоксильной и гидроксильной групп одновременно в положениях 3' и 4'. Помимо 7, 3', 4' положений, метоксильная группа может находиться при С-3 кольца С. Известно [9], что в масс-спектре флавонолов с двумя гидроксильными группами при С-3 и С-5 сигналы иона «&> имеют низкую интенсивность, а введение метоксильной группы в положение С-3 приводит к резкому возрастанию интенсивности пика рассматриваемого иона.
Для соединения (1) масса фрагмента «а» составила 167, а масса фрагмента «Ь» - 153, в то время как интенсивность пика иона «&> с молекулярным числом 271 - всего лишь 18%. Для соединения (2) масса фрагмента «а» - 153, а масса фрагмента «Ь» - 135, тогда как интенсивность пика иона «&> - 47%. Таким образом, соединение (1) соответствует структуре 7,4'-диметилового эфира кемпферола, а соединение (2) - структуре эрманина. Спектральные характеристики выделенных соединений соответствуют литературным данным [7, 10]. Данные вещества находили как в почках березы повислой [11], так и в почках других видов берез. Эр-манин впервые был выделен из почек БвШ1а егшат [4].
Таблица 1. Результаты хроматографии фракций 9, 10, 11, 13 [1]
№ фракции Элюэнт Содержание, в % от массы ПЭ-экстракта Соединение Индекс удерживания
1 30% ДЭ в Сумма флавоноидов Пиллоин (1) - 55% и 2805
ПЭ - 1,4 эрманин (2) - 45% от суммы фракции После метилирования
2 40% ДЭ в Сумма кариофиллен- 5р,6а-дигидроксикариофилла-3,8(15)-диен (3) - 44% 1811
ПЭ диолов - 4,0 и 5р,6а-дигидроксикариофилла-4(14), 8(15)-диен (4) -56% от суммы кариофиллендиолов 1802
3 40% ДЭ в ПЭ 0,5 6а,9а-дигидрокси-а-гумуленол (5) 1822
4 11% ацетона Сумма флавоноидов Сакуранетин (6) - 70% 2705
в бензоле 1,4 и изосакуранетин (7) - 30% от суммы фракции После метилирования
5 20% ацетона в бензоле 0,2 5р,6а,8Р-тригидроксикариолан (8) 1990
3' 2>";ЧТ /ОСИэ 4' /^/ОСНз /Ч/ОН
9"о\,-1\.^5' но\у*;*:г\ I2 6' 1
6\5І0^'''3'''-он |Г^ОСНз 1(1
он о (1) он О ОН О (2) (6)
сн
14
он
4 он/
3ДЧ
5
он/
он
он
12
(3)
(4)
(5)
(8)
(7)
н
н
Фракции 2 и 3 разделили на соединения (3), (4), (5) многократной жидкостной хроматографией на силикагеле с использованием градиентного элюирования системой ПЭ-ДЭ. Молекулярный ион соединения (3) имел массу 236, на спектре ЯМР13С (табл. 2) проявлялись сигналы 15 углеродных атомов, в том числе и два сигнала углерода, 73,9 и 71,0 м.д. от вторичных углеродов, связанных с кислородом. В слабом поле спектра имелись 4 сигнала углерода (126,90; 136,77; 148,07; 115,40), что свидетельствовало о наличии в соединении двух двойных связей и, суммарно, что соединение является сесквитерпеновым диолом. Наличие в спектре ЯМР1Н (табл. 3) сигналов протонов, относящихся к экзометиленовой группе, сигналов двух метильных групп (0,95 и 0,98 м.д.) и характерных сигналов от протонов при 1 и 9 атомах углерода (2,07 дд и 2,35 дд), позволило предположить, что соединение является кариофиллендиолом. Один из двух протонов, связанных с углеродом вторичных спиртовых групп на протонном спектре, проявлялся в виде дублета, что означало, со стороны одной из спиртовой группы находится полностью замещенный углерод. Методом двойного резонанса установили, что спиртовые группировки являются соседними.
Для определения последовательностей расположения атомов водорода в молекуле был снят спектр ЯМР1Н COSY H-H. Для отнесения атомов углерода - спектр 1H- 13C-HETCOR. Для установления пространственного строения - NOESY.
Близость времен удерживания и значений Rf на пластинах для ТСХ соединений (3) и (4) указывала на сходство их строения. Действительно, масса вещества (4) была 236. В спектре ЯМР13С (табл. 2) наблюдались сигналы 15 атомов углерода, сигналы двух углеродов, связанных с кислородом, имели соответствующие сигналы на спектрах ЯМР1Н (табл. 3): 3,87 д и 3,68 ддд. В спектре ЯМР1Н соединения (4) отсутствовали синглет от протонов метальной группы и триплет от протона, связанные с ненасыщенными углеродами, проявляющимися в спектре соединения (3), но присутствовали сигналы от протонов экзометиленовой группы 5,11 и 5,20 м.д. - широкие синглеты на 1 Н каждый. Поэтому для выделенного соединения была предложена структура (4), подтвержденная анализом двумерных спектров ЯМР. Пространственная структура молекулы установлена на основании эксперимента NOESY (рис. 3).
Образование (3) и (4) могло произойти в результате ферментативного протонирования эпоксида 6-гидрокси-р-кариофиллена (рис. 7). О выделении эпоксида из петролейного экстракта почек сообщалось в [3].
В ЯМР1Н-спектре (табл. 3) соединения (5) присутствовали сигналы протонов у атомов углерода двойных связей С1-С2 и С3-С4: дублет от протона при С1 с центром 5,37 м.д. и J=16,2 Гц, характерный мультиплет с центром 5,71 м.д. от протона при С2, сигнал протонов метальной группы, связанной с ненасыщенным углеродом - 1,71 м.д., сигналы протонов двух ангулярных метальных групп, аналогичные сигналам таких связей в гумулене [1].
Сигнал еще одного протона при ненасыщенном атоме углерода имел такой же характер - дублет и химический сдвиг как в спектре 6-гидрокси-а-гумулена [2], указывая на наличие группировки атомов: -С(СН3)=СН-СН(ОН)- с соответствующими сигналами на спектре ЯМР13С от углерода, связанного с кислородом - 70,58 м.д. (табл. 2), полностью замещенного ненасыщенного углерода - 142,69 м.д. Сдвиг сигнала протона при углероде спиртовой группировки в слабое поле - 4,45 м.д., в результате влияния соседства двойной связи, подтверждал этот вывод. Так как сигнал имеет сложный характер, т.е. существуют другие соседние протоны, с которыми взаимодействует этот протон, то единственное место расположения протона с сигналом 4,45 м.д. - при С6. В отличие от других выделенных гумуленолов вместо сигнала протонов четвертой метальной группы на протонном спектре присутствовали сигналы от протонов экзометиленовой группы: 5,15 и 4,96 м.д. и сигналы протона при 3,88 м.д. и соответствующего углерода - 70,58 м.д. на ЯМР13С-спектре, относящиеся к еще одной спиртовой группировке атомов.
Рис. 1. Основные пути распада молекулярных ионов флавонолов при электронном ударе
Таблица 2. Данные спектров ЯМР С выделенных производных кариофиллена и гумулена (5 С, м.д.)
Таблица 3. Данные спектров ЯМР выделенных производных кариофиллена и гумулена (5 Н, м.д.)
№ атома С (3) (4) (5) (8) № атома С (3) (4) (5) (8)
1 49,26 д 52,93 д 141,39 д 46,74 д 1 2,07 дд, 1,75 дд 5,37 д 1,77 дд
2 28,71 т 29,78 т 128,66 д 26,37 т 2 a1,94 ддд a 1,49 м 5,71 ддд a 1,48 м
3 126,9 д 30,30 т 39,49 т 40,10 т b 2,30 ддд b 1,64 м b 1,46 м
4 136,77 с 148,83 с 142,69 с 37,12 с 3 5,52 т a 2,06 a 2,71 дд a 1,85 м
5 73,9 д 79,3 д 128,60 д 73,10 д b 2,03 b 2,39 дд b 1,07 м
6 71,01 д 74,02 д 70,58 д 69,56 д 5 4,33 д 3,87 д 5,105 дд 3,81 д
7 37,91 т 38,14 т 43,81 т 49,59 т 6 3,73 м 3,68 ддд 4,45 ддд 3,85 м
8 148,07 с 150,04 с 148,81 с 69,11 с 7 a 2,66 дд a 2,18 дд a 2,20 дд a 2,11 м
9 42,83 д 44,34 д 72,57 д 50,13 д b 2,34 дд b 2,37 дд b 2,70 дд b 1,62 м
10 40,31 т 41,06 т 50,05 т 36,14 т 9 2,35 дд 2,43 дд 3,88 т 2,05 дд
11 33,11 с 33,61 с 35,50 с 34,03 с 10 a 1,54 дд a 1,70 дд a 1,91 дд a 1,70 дд
12 29,80 кв 29,87 кв 29,30 кв 30,56 кв b 1,60 дд b 1,65 дд b 1,45 дд b 1,55 дд
13 22,39 кв 22,27 кв 24,49 кв 21,83 кв 12 0,95 c 0,96 c 1,05 с 0,97 с
14 16,95 кв 116,8 т 19,57 кв 27,02 кв 13 0,98 c 0,96 c 1,13 с 1,00 с
15 115,40 т 111,59 т 113,44 т 49,52 т 14 1,66 c 5,11 c; 1,71 д 0,88 с
Примечание. Спектры веществ (3-5) сняты в дейтерохло-роформе, а спектр (8) в дейтероацетоне Таким образом, молекулярная масса 236 и нали- 15 C5HOH 4,87 с 4,76 с 5,20 c a 4,88 c b 4,76 c a 5,15 с b 4,96 с a 1,70 b 1,53 3,56 д
чие двух атомов углерода, связанных с кислородом, C6HOH 3,59 д
6 атомов углерода в слабом поле на спектре C8OH 3,24 шир.с.
Примечание. Спектры веществ (3-5) сняты в дейтерохло-роформе, а спектр (8) в дейтероацетоне.
/[Щ: для (3) 1-9а=9,0; 1-2а=7,7; 1-2Ь=7,6; 2Ь-2а= -16,2; 2а-3=7,7; 2Ь-3=7,7; 6-5=9,5; 6-7а=7,0; 6-7Ь=8,5; 7Ь-7а=-8,0; 9-10а=6,5; 9-10Ь=8,0; 10Ь-10а=-10,0; для (4): 1-9а=9,0, 1-2а=11,8, 1-2Ь=3,9; 2а-3а=4,2; 2а-3Ь=8,5; 2а-2Ь=-13,7; 2Ь-3а=8,8; 2Ь-3Ь=3,8; 3Ь-3а=-13,3; 5-6=9,5; 7а-6=5,7; 7Ь-6=5,5; 7а-7Ь=-14,1; 9-10а=8,0; 9-10Ь=8,0; 10Ь-10а=—10,0;
для (5): 1,2=16,2; 2,3а=8,5; 2,3Ь=5,7; 5,14=0,9; 5,6=9,5; 6,7а=4,8; 6,7Ь=9,5; 7а,7Ь=-12,8; 9,10а=3,9; 9,10Ь=3,7; 10а,10Ь=-14,1; для (8): 1-9=11,3; 1-2а=2,8; 1-2Ь=12,3; 2а-3а=2,4; 2а-3Ь=5,5; 2а-2Ь=-13,6; 2Ь-3Ь=5,4; 2Ь-3а=12,5; 3а-3Ь=-13,8;
9-10а=10,2; 9-10Ь=8,3; 10а-10Ь=-10,2; 5-6 = 10,6; 5-ОН=3,8; 6,7а=9,5, 6,7Ь=7,2; 6-ОН=3,6; 7а,7Ь=-13,1; 15а,15Ь=-13,2.
ЯМР С от ненасыщенных атомов углерода предполагали, что выделенное вещество является гуму-лендиолом. Химический сдвиг протона при углероде второй спиртовой группировки - 3,88 м.д. указывал, что углерод также соседствует с двойной связью, а значит гидроксильная группа связана с С9. Все вышесказанное подтвердилось при отнесении сигналов после использования двумерной спектроскопии (эксперименты COSY, COLOC).
Стереохимия молекулы гумулендиола
((1Е,4Е,6К^)-6,9-дигидрокси-4,11,11-триметил-8-метиленциклоундека-1,4-диен) устанавливалась на основании NOESY - эксперимента ЯМР-спектроскопии (рис. 4).
Соединение (8) являлось сесквитерпеновым триолом: масса - 254, наличие широких сигналов от протонов гидроксильных групп на спектре ЯМР1Н (табл. 3), а также соответствующих сигналов углеродов, связанных с кислородом: 73,10, 69,56 и 69,11 м.д. (табл. 2). Две спиртовые группы были вторичными, а одна третичная (DEPT ЯМР13С и расщепление сигналов протонов ОН- групп на протонном спектре). Молекулярная масса сесквитерпе-ноида, отсутствие сигналов ненасыщенных углеродов и присутствие сигналов 3 полностью замещенных углеродов предполагали наличие в молекуле 3-х циклов. Для определения структуры были определены последовательности взаимодействующих протонов с использованием эксперимента COSY двумерной спектроскопии.
Отнесение сигналов углеродов и протонов было сделано с использованием эксперимента JH- 13C-HETCOR, а пространственная структура - экспериментов NOESY и COLOC (рис. 5, 6). 5R,6R,8R-Tpn-гидроксикариолан (8) оказался соединением, которое последним элюировалось из колонки с силикагелем при разделении петролейного экстракта почек березы. Наличие трех гидроксильных групп в молекуле позволяет обнаруживать это соединение в ощутимых количествах в водном экстракте при экстракции горячей водой - 0,07% от почек.
Соединение (8) может быть образовано внутримолекулярной атакой карбкатионом, образующемся из эпоксида 6-гидрокси-р-кариофиллена, двойной связи с последующим гидроксилированием (рис. 7). Хорошо известно, что оксид кариофиллена превращается в кариоланол с минеральными кислотами [12, 13] и эфиры кариоланола при алкоголизе [14].
Рис. 2. Избранные NOE корреля- Рис. 3. Избранные NOE корреляции для (3) ции для (4)
Рис. 4. Наблюдаемые NOE - взаимодействия в эксперименте соединения (5)
Рис. 5. Избранные NOE корреляции, наблюдаемые Рис. 6. Избранные COLOC корреляции, наблюдае-для (8) мые для (8)
OH
OH
- H
OH
( 3)
■( 4)
Ранее [14] эфир 5а,8-кариолан-диола получали как один из продуктов расщепления ка-риофиллен-оксида. Природный кариолантриол не обнаруживали.
Разделение веществ (6) и (7) фракции 4 проводили методом препаративной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе бензол-метилцеллозольв (4 : 0,3).
Масс-спектр соединения (6) (табл. 1) показал наличие осколка с максимальной массой 286. В ЯМР1Н-спектре вещества, в слабом поле имеется синглет интенсивностью на 1Н с центром 12,13 м.д., характерный для протона ОН-группы у пятого атома углерода флавоноидов с карбонилом у С4 [15]. В спектре соединения наблюдали симметричные дублеты с центрами в 7,38 и 6,89 м.д. и одинаковой константой взаимодействия 1=8,3 Гц, которые относят к сигналам протонов у атомов углерода бензольного ядра с па -ра-замещением кольца В. Дублеты с центрами 6,04 и 6,03 м.д. (1=1,2 Гц) интенсивностью на 1Н каждый соответствовали сигналам протонов при восьмом и шестом атомах углерода кольца А флавоноида. Сигналы в более сильном поле спектра принадлежат трем протонам у атомов углерода кольца С. Дублет дублетов с центром 5,48 м.д. на 1Н (1(2-3э)=2,8; 1(2-3а)=13,0 Гц) можно отнести на счет сигнала протона у атома углерода С-2 кольца С, связанного с ароматическим кольцом и атомом кислорода. Дублеты дублетов при 3,18 м.д. (1(3а-2)=13,0; 1(3а-3э)=15,0Гц) и при 2,75 м.д. (1(3э-2)=2,8; 1(3э-3а)=15,0Гц) на 1Н каждый принадлежат протонам кольца С у С-3 флаванона. Синглет на 3Н при 3,79 м.д. относится к протонам метоксильной группы.
OH
Рис. 7. Предполагаемая схема образования (8)
Место расположения метоксильной группы определили по масс-спектру. Как и для флавонолов, для фла-ванонов наличие в масс-спектре фрагмента с массой 167 свидетельствует о расположении метоксила в молекуле флавонона при 7 атоме углерода [9]. Суммируя данные ЯМР 1Н и масс-спектров, соединению (6) можно приписать структуру 4',5-дигидрокси-7-метоксифлаванона, имеющую тривиальное название сакура-нетин. Сакуранетин также ранее был выделен из почек различных видов берез [4, 6, 11, 16].
В ЯМР1Н-спектре соединения (7) дублируются сигналы протонов сакуранетина, но с небольшим смещением химсдвигов в область сильного поля, из чего следует, что данное соединение также является флаваноном с 5,7,4'-типом замещения, и соединение (7) - изомер соединения (6). В таком случае метоксил в соединении (7) должен располагаться в 4'-положении кольца В. Следовательно, данное вещество - изосакуранетин (7). Спектральные данные соединения (7) совпадают с таковыми, описанными для изосакуранетина [8].
Выводы
Углеводородный экстракт из березовых почек Betula pendula Roth. в группе соединений с двумя и тремя гидроксильными группами содержит диметоксидигидроксифлавоны, метоксигидроксифлаваноны, 5р,6а-дигидроксикариофилла-4(14), 8(15)-диен, 5р,6а-дигидроксикариофилла-З,8(15)-диен, 6а,9р-дигидрокси-а-гумулен, 5р,6а,8р-тригидроксикариолан.
Идентифицированные сесквитерпеновые диолы и триол впервые выделены из природных источников.
Определены газохроматографические индексы удерживания всех идентифицированных соединений.
Список литературы
1. Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Экстрактивные вещества почек березы повислой Betula pendula Roth. (Betulaceae). 1. Состав жирных кислот, углеводородов и сложных эфиров // Химия растительного сырья. 2009. №3. С. 69-73.
2. Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Экстрактивные вещества почек березы повислой Betula pendula Roth. (Betulaceae). 2. Карбонильные соединения и оксиды. Сложные эфиры // Химия растительного сырья. 2009. №3. С. 75-83.
3. Ведерников Д.Н., Рощин В.И. Экстрактивные вещества почек березы повислой Betula pendula Roth. (Betulaceae). 3. Состав тритерпеновых кислот, флавоноидов, спиртов и эфиров // Химия растительного сырья. 2010. №4. С. 67-75.
4. Wollenweber E., Egger K. Flavonoid-aglikone im Knospen-Exkret von Betula ermani // Z. Pflanzenphysiol. 1971. Bd. 65. S. 427-431.
5. Kamaya R., Ageta H. Fern constituents: cheilanthenetriol and cheilanthenediol. Sesterterpenoids isolated from the leaves of Aluritopteris khunii // Chem. Pharm. Bull. 1990. V. 38, N2. Pp. 342-346.
6. Wollenweber E. Flavonoidmuster im Knospenexkret der Betulaceen // Biochemica. Systematics and Ecology. 1975. V. 3. Pp. 47-52.
7. Liu Y.-L., Ho D. K., Cassady J. M. Isolation of potential cancer chemopreventive agents from Eriodictyon californi-cum // J. of Natural Products. 1992. V. 55. N3. Pp. 357-363.
8. Степанова T.A., Шейченко В.И., Смирнова Л.П., Глызин В.И. Флаваноны Tanacetum sibiricum // Химия природных соединений. 1981. №6. C. 721-728.
9. Поправко С.А., Кононенко Г.П., Родионов Б.В. Изучение масс-спектрометрического поведения природных флавоноидных агликонов и продуктов их исчерпывающего метилирования и тридейтерометилирования // Био-органическая химия. 1980. T. 6. №2. C. 267-279.
10. Поправко С.А., Гуревич А.И., Колосов М.Н. Флавоноидные компоненты прополиса // Химия природных соединений. 1969. №6. С. 476-482.
11. Кононенко Г.П. Изучение химической природы ростингибирующего комплекса почек березы бородавчатой: автореф. дис. ... канд. хим. наук. М., 1976. 16 с.
12. Arata K., Hayano K., Shirahama H. Isomerisation of caryophyllene oxide catalazed by solid acids and bases // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1993. V. 66. Pp. 218-223.
13. Нисневич Г.А., Корчагина Д.В., Макальский В.И., Дубовенко Ж.В., Бархаш В.А. Молекулярные перегруппировки 4,5-эпоксидов кариофиллена и изокариофиллена в суперкислых средах // Журнал органической химии. 1993. Т. 29, №3. С. 524-541.
14. Collado I.G., Hanson J.R., Sanchez M. The cleavage of caryophyllene oxide catalysed by tetracyanoethylene // Tetrahedron. 1996. V. 52, N23. Pp. 7961-7972.
15. Batterham T.J., Highet R.J. Nuclear magnetic resonance spektra of flavonoids // Aust. J. Chem. 1964. V. 17. Pp. 428-439.
16. Кононенко Г.Н., Поправко C.A., Вульфсон H.C. Флавоноидные агликоны почек березы бородавчатой (Betula Verrucosa) // Биоорганическая химия. 1975. Т. 1, №4. С. 506-511.
Поступило в редакцию 25 ноября 2009 г.
