2. Kieffer S. W. Sound speed in liquid-gas mixtures: water-air and water-steam // J. Geophys. Res. 1977. Vol. 82. №20. P. 2895- 2904.
3. Бабий BM. Исследование влияния сероводорода на скорость распространения звука в Черном море // Матер. конф. «Совершенствование управления развитием рекреационных систем. Севастополь. 23 - 25 окт. 1986 г. 4.2». МГИ АН УССР. Севастополь. 1987. С. 251- 258. (Рук. депонир. в ВИНИТИ 11.08.87. № 5804-В87).
4. Владимиров ЮМ., Городецкий А.Е., Кузьмин ПЛ., Карменов ВТ. Контроль загрязнений с использованием акустических резонаторов. Сб. трудов «Предотвращение загрязнений внутренних водоемов и охрана труда на речном транс». . 1987. . 89-102.
5. . .
восточной части Черного моря // Акустичний вкник. 2006. Том 9. № 1. С. 39. Серавин Георгий Николаевич
-
E-mail: mikyshin-igor@mail.ru
140180, Россия, Санкт-Петербургская обл., Жуковский, ул. Дворцовая, 2, тел.: 8(495) 3789673
Микушин Игорь Иванович E-mail: mikyshin-igor@mail.ru
Seravin Georgy Nikolaevich
The Naval Research Center of Electronics E-mail: mikyshin-igor@mail.ru
2, Dvortsovay str., St. Petersburg region, Pushkin, 140180, Russia, Ph.:+7 (495) 3789673
Mikyshin Igor Ivanovich E-mail: mikyshin-igor@mail.ru
УДК 551.501.816
В. М. Сидоренко
ЭКСПРЕССНЫЕ ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА ВОДНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ
Предложены методы экспрессного количественного определения концентрации хлорофилла и первичной продукции в водных районах на основе экспериментальных флуориметрических данных, полученных "in situ". Проведен сравнительный анализ результатов использования предложенных экспрессных методов и традиционных методов, основанных на экстракции хлорофилла из проб во.
Вода; флуоресценция; фитопланктон; первичная продукция; хлорофилл; концентрация; фотоадаптация.
B.M. Sidorenko
EXPRESS FLUOROMETRIC METHODS OF WATER ECOLOGICAL SYSTEMS MONITORING
The methods of express quantitative determination of chlorophyll concentration and primary production in water regions are offered on the basis of experimental fluo-rimetric data obtained " in situ ". The comparative analysis of results received with usage of offered express methods and traditional methods, founded on extraction of chlorophyll from assays of water is conducted.
Water; fluorescence; phytoplankton; prime production; chlorophyll; particle; concentration; photoadaptation.
Существуют различные методы, позволяющие оценить биомассу и первичную продукцию фитопланктона того или иного водоёма. Однако все они требуют длительного времени анализа проб воды в лабораторных условиях. Это приводит к низкой производительности времени проведения измерений без отбора проб и пробоподготовки. Поэтому актуальным является разработка экспрессных, в том ,
первичной продукции фитопланктона (ФП) в той или иной акватории. Наиболее перспективным в этих целях представляется использовать явление флуоресценции хлорофилла в ФП. Интенсивность флуоресценции хлорофилла, в принципе, позволяет определить его концентрацию, на основании которой возможно рассчитать биомассу ФП и первичную продукцию. Основная трудность, не позволявшая до настоящего времени реализовать флуориметрический экспрессный метод определения первичной продукции водных экосистем, заключалась в отсутствии работоспособных моделей описания взаимодействия света с клетками ФП в процессе флуоресценции содержащегося в них хлорофилла.
В последние годы был разработан общий подход к спектральному оптическому исследованию гетерогенных конденсированных систем, а также конкретные способы экспрессного определения характеристик поглощения и флуоресценции молекул веществ, входящих в их состав [1]. В связи с этим важной и актуальной задачей является создание на основе указанного подхода конкретных методов экспрессного определения экологических характеристик природных вод таких, как концентрация содержащегося в ней хлорофилла и величины первичной продук-.
В целом современные представления об устройстве фотосинтетического ап, -стик водорослей под влиянием внешних условий свидетельствует о том, что ИФХ ФП может зависеть от многих факторов столь же сильно, как и от концентрации пигментов. Это, в принципе, должно приводить к нарушению линейной связи между концентрацией хлорофилла и ИФХ ФП в акватории. Согласно результатам анализа различных факторов, влияющих на точность определения концентраций C , вклад в погрешность вносит уровень подводной освещенности, который может привести к погрешности в сотни и даже тысячи процентов [2]. Вклад этого фактора в результаты измерения ИФХ ФП требует специального рассмотрения. Исследования в этой области важны для развития методов флуориметрии фитопланктона «in situ», позволяющих оценить концентрацию его биомассы в морской воде.
, -менении биомассы ФП, но и на изменении концентрации хлорофилла в его клетках и квантовом выходе флуоресценции ФП. Зависимость ИФХ ФП от светового режима находит наиболее яркое проявление в ее суточной изменчивости.
Известны три основных механизма суточной изменчивости ИФХ ФП. Первый из них действует через 10 мин после начала облучения и особенно проявляется непосредственно под поверхностью воды, где уровень солнечного потока велик.
, vb -
,
.
другой, фотохимический механизм тушения флуоресценции. Последний вызван его фотоадаптацией, суть которой заключается в вырабатывании хлорофилла «а» в помещенных на свет клетках хлорофилла. При этом меняется удельная ИФХ, приведенная к единице концентрации хлорофилла. Период фотоадаптации более длителен, но происходит в суточном интервале времени. Наконец, изменение концентрации хлорофилла в морской воде происходит коррелированно с изменением биомассы фитопланктона в связи с ростом его численности. Важно, что в океане при рассмотрении динамики изменения популяции фитопланктона необходимо учитывать его потребление зоопланктоном, делающим эту часть вариации хлорофилла в морской воде связанной с величиной сеточного вылова. Относительный вклад перечисленных факторов в суточный ход ИФХ оценивался на основании исследований, проведенных в северо-восточной Атлантике. Было установлено, что фотоингибиция, или нефотохимическое тушение, доминирует на глубинах 10 и 20 , - 20 60 ,
60 . -
вуют достаточно работоспособные флуориметрические методы определения кон-
«in situ», -
достаточно корректным подходом к учету влияния уровня освещенности на точность флуориметрических измерений с . Отсутствие в настоящее время таких
методов приводит к ошибкам при флуориметрическом определении , превышающим в десятки раз их истинные значения [2]. Поэтому актуальным является выяснение механизма влияния E на флуоресцентные характеристики живых клеток ФП и разработка методов учета этого влияния.
Ранее предпринимались попытки описать экспериментальные зависимости /м (E) и оптической плотностью слоя клеток ФП d(e) только изменением концентрации хлорофилла в клетках ФП. Однако экспериментально отмечена относительно малая изменчивость /от (e) по сравнению с D(E), тогда как теория предсказывала противоположное соотношение между этими зависимостями. В связи с этим высказывались предположения о возможном влиянии на спектры
.
представления о спектральных проявлениях фотоадаптации клетки ФП [1-3]. В них учтено изменение концентрации клеточных фотозащитных пигментов и использован новый метод учета реабсорбции излучения хлоропластом. При этом клетка ФП представлена в виде сферы, внутри которой находится хлоропласт, а
( . 1).
рассмотреть основные факторы спектральных проявлений фотоадаптации -изменения внутриклеточной концентрации молекул хлорофилла и их квантового
,
.
expD раз, где D - оптическая плотность слоя фотозащитных пигментов, а ослабление света клеткой в спектре поглощения определяется величиной exp2D. С учетом этого оптическое пропускание T взвеси клеток (рис. 1) в прозрачном
растворителе при концентрациях, когда их самозатенением можно пренебречь, определяется формулой
T = 1 - [1 - е-2D (1 - Qa , (1)
где Qa - фактор эффективности поглощения света частицей, N - число частиц взвеси; 5 - площадь сечения клетки; Я - площадь сечения кюветы, перпендикулярного падающему излучению.
Причем величина Qa для однородной сферической частицы определяется
параметром р' = 2Як, где Я - радиус частицы, а к - ее показатель поглощения. На основании (1) имеем:
D = 1 -1 - е -2Б (1 - Qa )]м*« . (2)
Тогда из выражения (2) для показателя поглощения кюветы со взвесью, нормированного на концентрацию хлорофилла в кювете С = ус N/7 (где V -
объем хлоропласта, V - объем кюветы, См - концентрация хлорофилла в клет-
), :
Крк Ц-е--^)/^). (3)
Запишем выражение для интенсивности флуоресценции хлорофилла в клетках С учетом оптической ПЛОТНОСТИ фотозащитных пигментов в(ку) на дли не волны возбуждения \, имея в виду, что для оптической плотности на длине волны флуоресценции А2 выполняется условие б(Х2 )<< D(1):
!рн “ПнехР[-б(1)]^/Я (4)
где Q - фактор эффективности флуоресценции частицы. Для однородной сферической частицы он зависит от параметров р[ = 2Як1 и р2 = 2Як2, где кхи к2 - показатели поглощения частицы на частотах возбуждения и флуоресценции соответственно [1,3]. Из (4) следует выражение для нормированной на величину С интенсивности флуоресценции сферических клеток радиусом Я:
!рк “ Пв ехР[- МЛ )]/((схл ). (5)
На основании формул (3), (5) были получены зависимости величин Q, Б и т| от внешней освещенности Е, к которой адаптирован фитопланктон (с использованием экспериментальных данных о показателях поглощения кр на длинах волн возбуждения и регистрации интенсивности флуоресценции !рЬ ФП, полученных для различных видов морского ФП [1]).
На основании полученных данных были рассчитаны зависимости от освещенности удельного фактора Q* = 3Q/(2р1). Последний определяет соотношение между интенсивностями флуоресценции частицы взвеси I и разбавленного раствора I , содержащих одинаковое количество флуоресцирующих молекул при неизмен-
Р
ном квантовом выходе флуоресценции молекул: ^ = Q*Ip. Его знание необходимо для флуориметрического определения количества хлорофилла, содержащегося в
хлоропластах клеток ФП. Установлен рост величины О с увеличением Е, который можно объяснить уменьшением концентрации хлорофилла в клетке фитопланктона в процессе ее фотоадаптации.
При этом уменьшается реабсорбция излучения частицей, следовательно, увеличивается эффективность наблюдаемой флуоресценции содержащегося в ней хлорофилла и интенсивность флуоресценции взвеси приближается к интенсивности флуоресценции разбавленного раствора. Получена линейная зависимость роста оптической плотности фотозащитных пигментов при увеличении Е в исследованном диапазоне освещенностей. Сам факт увеличения Б в процессе фотоадаптации клетки хорошо .
характер этой зависимости и масштаб изменения Б в диапазоне суточных вариаций освещенностей по-
Полученная зависимость Г|(Е) имеет максимум в области средних значений освещенности. Такая зависимость может быть объяснена двумя процессами. Один из них с ростом Е приводит к уменьшению г|в за счет увеличения содержания хлорофилла «а» в нефлуоресцирующей (Р81) подсистеме хлоропласта по сравнению с флуоресцирующей подсистемой (Р82). С этим процессом конкурирует процесс увеличения г|в с ростом Е за счет уменьшения квантового выхода фотосинтеза г|с ввиду соотношения: Г|в= 1 -г|с.
Проведенные исследования показывают, что в процессе фотоадаптации клетки ФП на ее спектральные характеристики влияют все рассмотренные параметры: реабсорбция света хлоропластом, изменение квантового выхода молекул хлорофилла и изменение оптической плотности фотозащитных пигментов. При этом относительно малая зависимость I ь по сравнению с крк от Е, отмечавшаяся
, , -тической плотности Б(1) , а показатель ее поглощения - от 2Б(1). Следует особо отметить, что О, Б и г|в имеют различные постоянные времени изменения при
Е .
интенсивность спектров позволяет учитывать эти различия в зависимости от динамики изменений Е (сезонные, суточные и более короткопериодные изменения).
Рассмотрим результаты применения предложенной флуориметрической модели клетки ФП к конкретным задачам мониторинга водных районов.
Экспрессное безэкстракционное определение концентрации хлорофилла Схл в акватории
При определении значения Схл на основании интенсивности флуоресценции ФП обычно пользуются градировочными зависимостями Схл = Кар1щя , экспе-
и
Рис.1. Оптическая модель клетки фитопланктона: 1 - внутриклеточная среда; 2 - слой фотозащитных пигментов с оптической плотно-
стьюБ ; К - радиус клетки
, - , .
Раздел I. Методы и средства экологического мониторинга водных районов риментально полученными в результате измерения интенсивности флуоресценции 1рхл экстрактов хлорофилла в органических растворителях, как правило, в аце-.
морской воды необходимо установить связь между !рхл экстракта и интенсивностью флуоресценции 1вхл клеток ФП при одинаковых значениях концентрации хлорофилла См . Общее соотношение между величинами 1рхл и !вхл при одинаковой концентрации хлорофилла См в соответствии с формулой (5) имеет вид
^рхл = Л Л р°* ехР[- Б](0отн , (6)
где г|р и т|в - соответственно квантовые выходы флуоресценции хлорофилла в растворе и в хлоропласте клетки фитопланктона; Б - оптическая плотность фотозащитных пигментов; 0ОТН = (пх,г2 + 2)4/(па 2 + 2)4 - фактор, учитывающий зависимость ИФ молекулы хлорофилла от показателя преломления конденсированной среды, в которой она находится [1,3] (для ацетона па = 1,359, для хлоропласта пх, = 1,41).
, (6), . , -, р , -планктона меняется в зависимости от уровня освещенности до двух раз. Значение
О * при изменении радиуса клеток в диапазоне К = 5-50 мкм и концентрации содержащегося в них хлорофилла меняется в 10 раз, а влияние фотозащитных пигментов - в 1,5 раза. Таким образом, при постоянном значении См соотношение
1вхл/1рхл может варьировать в десятки раз, что соответствует указанным выше возможным ошибкам при флуориметрическом определении концентрации кле-
. (6)
зависимости входящих в него параметров от Е имеем:
Схл =
_______Лр^вхл (Е)_________
Лв(Е )д*(Е )ехр [-(Б (Е)] (7)
Исследование изложенного экспрессного безэкстракционного метода определения концентрации хлорофилла проводилось на основании результатов экспери-
,
.
хлорофилла в составе взвеси фитопланктона от глубины 1вхл (н), полученная в результате усреднения 5-ти вертикальных разрезов, измеренных с помощью по, . 2. -на для периода времени с максимальной солнечной освещенностью (1200...1600). Для такого распределения 1вхл(н) на основании предложенного
- (7)
зависимость изменения концентрации содержащегося в фитопланктоне хлорофилла с глубиной (см. рис.2). При этом величина О* находилась с использованием усредненного за 2 часа значения Е . Причем значение фактора О* определя-
лось при R = 10 мкм, который отвечает диатомовым, характерным для летне, . на изменение E концентрации фотозащитных пигментов и квантового выхода флуоресценции составляют менее нескольких десятков минут, и они определялись с использованием текущего значения E . Полученная на основании использования формулы (7) расчетная зависимость См (H) заметно отличается от /вхл (H).
В отличие от /вхл (H) величина С^ отн (H) имеет максимум на глубине в районе H = 30 м. Параллельно определялись значения Схл в пробах с глубин 0, 10, 20, 30 и 40 м с помощью известного экстракционного метода Джеффри - Хам фри. Из приведенных данных видно, что результаты определения концентрации хлорофилла с использованием предложенной методики «in situ» и экстракционным методом совпадают в пределах 30 - 40 %. можно считать вполне удовлетвори, -делах разброса результатов, даваемых разными экстракционными методами. ,
распределение зависимости Схл (H) отвечает часто встречающейся в Черном море ситуации, когда в оптимальной для обитания фитопланк-, , -ность, а с другой - достаточно высокая концентрация биогенных элементов, диффундирующих через слой скачка плотности из глубинных слоев [2]. Существенно, что на основании предложенного метода удается также описать резкую суточную зависимость интенсивности флуоресценции хлорофилла в приповерхностной зоне Черного моря, которую трудно объяснить столь быстрым ростом продукции фитопланктона. Согласно полученным результатам, основной причиной этого явления является изменение под действием солнечной освещенности концентрации хлорофилла в хлоропластах клеток фитопланктона, приводящее к изменению величины фактора Q*TH. Что касается фотозащитных пигментов и квантового выхода интенсивности флуоресценции, то при существовавших освещенностях их влияние на / (H) имеет про-
тивоположный характер и взаимоскомпенсированно.
Экспрессное определение первичной продукции
Оценим величину сезонного изменения скорости фотосинтеза первичной продукции dQ c/dt , учитывая, что она пропорциональна количеству поглощенной в единицу времени фотосинтетической световой энергии и квантовому выходу фотосинтеза г|с:
Рис. 2 Распределение по глубине концентрации хлорофилла Сш , и интенсивности флуоресценции /в (н) в
гг 1 00 1 /г00
Черн ом море в 12 ...16 :
1 - /вхл (н); 2 - теоретическое распределение Схл ^); х- экспериментальные значения Сш ^), определенные экстракционным методом
-------------------- (8)
где Е - поток солнечного излучения; /хл - интенсивность флуоресценции хлорофилла; Л; - оптическая плотность фотозащитных пигментов в клетке на длине волны ^ ; Qa - фактор эффективности поглощения частицы; N - число клеток; S - площадь сечения клетки.
Тогда на основании (4) и (8) получим соотношение величин dQc/dt в различные месяцы «1» и «2»:
[Ос^ ]1 = -Гхл 1&Д^ ) Л в 2Лс1Е1 („)
[^сМ ]2 ПлПс2 Е2'
Учтем в (9) изменение квантового выхода флуоресценции хлорофилла г'в и квантового выхода фотосинтеза при изменении освещенности. Связь между ^с и имеет вид ^с =1 , где вызвано температурными и другими потеря-
.
стресса, характерного для стационарного состояния численности клеток ФП. Имеем в виду, что основной вклад в неё вносит приповерхностный слой морской воды при высокой освещенности. В этих условиях концентрация хлорофилла в клетках
низка и О примерно равно О(), а зависимость г|в(Е) в пределах погрешности 30% можно не рассматривать. Кроме того, учтём, что относительное изменение г|с за счёт нитратного стресса примерно в 3 раза больше, чем измерение г|в. Имеем в виду, что при концентрации нитратов СN = 0 квантовый выход фотосинтеза г|с = 0. Тогда, полагая зависимость г|с (СN) в области малых СN линейной, на основании формулы (9) получим соотношение между интегральными по глубине Н величинами \Ос / dt!],:
Но
I-хл (Н Е (Н См(Н )н
\с 1 dt]1,
о
\Ос 1 Чит Н° ( ) ( ) ( ) (10)
I-хл (Н )Е2 (Н ^ 2 (Н )Н
0
где интегрирование проводится в пределах фотической зоны, нижняя граница которой Н0.
(10), , -ценции хлорофилла и концентрации питательных веществ в водоеме определить величину первичной продукции. При этом необходимо иметь в виду что интенсивность флуоресценции хлорофилла может быть определена дистанционно с помощью флуориметрических лидаров. Что касается концентрации растворенных , ,
том числе дистанционных методов их определения. Один из способов дистанционного определения соотношения концентраций биогенных элементов Ст(Н)/СN 2(Н), входящего в (10), заключается в непосредственном измерении интенсивности флуоресценции растворенного органического вещества (РОВ)
I(Н) ввиду выполнения соотношения Ст(Н)/См2(Н) «11(Н)/12(Н), обусловленного корреляцией между См (Н) и I (Н) [2]. На рис.3 приведены усредненные экспериментальные данные о сезонной зависимости первичной продукции dQc/dt [4]. Там же представлена сезонная зависимость интенсивности флуоресценции хлорофилла I .
Рис 3. Сезонная зависимость первичной продукции и интенсивность флуоресценции хлорофилла в восточной части Черного моря:
1 - усредненные экспериментальные данные [4]; 2 - теоретические данные полученные, на основании (10); 3 - интенсивность флуоресценции хлорофилла 1вхл в фитопланктоне
Из сравнения приведенных данных видно, что наблюдается значительное расхождение зависимостей dQc/dt и ^. Особенно оно заметно в осенне-зимний период. Эти зависимости согласуются (при нормировании их по максимуму) при уровне значимости всего 35%. Кривая 2 на рис.3 представляет сезонный ход первичной продукции, полученный на основании (10). Видно, что эта зависимость близка к экспериментальным данным и они согласуются при
10%.
, -
зволяют сделать вывод о плодотворности использования предложенной оптической модели клетки фитопланктона при решении задач разработки экспрессных безэкстрак-ционных флуориметрических методов количественного определения экологических
.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Сидоренко В.М. Молекулярная спектроскопия биологических сред. - М.: Выс-
шая школа, 2004. - 190 с.
2. КарабашевГС. Флюоресценция в океане. - Л.: Гидрометеоиздат, 1987. - 200 с.
3. Сидоренко В. М. Применение оптических спектральных методов исследования в медицине, биологии и экологии. - СПб.: СПбГЭТУ, 2001. - 80 с.
4. Ведерников В. И., Демидов А. Б. Первичная продукция и хлорофилл в глубоководных районах черного моря. Океанология. - 1993. - №2. - С. 229-235.
Сидоренко Владимир Михайлович
-
«ЛЭТИ»
E-mail: vmsidorenko @mail. ru
197376, Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д.5 Телефон:(812) 234-90-71
Sidorenko Vladimir Mihailovich
St.-Petersburg University of Electrical Engineering "LETI"
E-mail: vmsidorenko @mail. ru
5, Professor Popov st., 197376, St.-Petersburg, Russian
Ph.: (812)272-25-22