CC BY
8© Коллектив авторов, 2012 УДК 618.36-091.8-078.33
ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСПОРТЕРОВ ГЛЮКОЗЫ В ВОРСИНАХ ПЛАЦЕНТЫ НА РАЗНЫХ СРОКАХ БЕРЕМЕННОСТИ
Н.В. Александрова, кандидат медицинских наук, Е.А. Дубова, кандидат медицинских наук, О.Р. Баев, доктор медицинских наук, профессор, А.И. Щеголев, доктор медицинских наук, профессор, Г.Т. Сухих, академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор
ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова Минздрава РФ, Москва E-mail: N_aleksandrova@oparina4.ru
При иммуногистохимическом исследовании ворсин плаценты установлено повышение уровня экспрессии транспортера глюкозы GLUT1 и снижение — GLUT3 в процессе развития беременности. Для неразвивающейся беременности характерны более высокие значения GLUT1 и пониженные показатели GLUT3 по сравнению с таковыми в контрольной группе, что может быть одной из причин нарушения физиологического течения беременности. Выявленные различия в уровнях экспрессии изученных GLUT в структурах ворсин плаценты при спонтанной и индуцированной беременности могут быть связаны с различной частотой акушерских осложнений.
Ключевые слова: ворсины плаценты, выкидыш, иммуногистохимия, транспортеры глюкозы (GLUT1 и GLUT3)
EXPRESSION OF GLUCOSE TRANSPORTERS ON PLACENTAL VILI THROUGH GESTATION N.V. Aleksandrova, E.A. Dubova, O.R. Baev, A.I. Shchegolev, G.T. Sukhikh
Federal State Budget Institution «Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of the Ministry of Healthcare and Social Development of the Russian Federation
Immunohystochemical examination revealed increasing of GLUT1 and decreasing of GLUT3 expression through gestation. In cases with missed abortion higher expression of GLUT1 and lower expression of GLUT3 in comparison with their expression in control group are characteristic that may indicate abnormal estation. Revealed differences in GLUT expression in cases with spontaneous pregnancy and pregnancy after assisted reproduction technologies may be associated with the various rate of obstetrics complications.
Key words:placental vili, missed abortion, immunohistochemistry, glucose transporters (GLUT1 и GLUT3)
Плацента, существующая лишь ограниченный промежуток времени, выполняет множество функций, обеспечивающих рост и развитие плода. В первую очередь она выполняет функции органов плода, еще не достигших своей зрелости (соответствующего развития). Так, у плода крайне ограничены способности синтезировать глюкозу, хотя она является важнейшим субстратом для внутриутробного роста органов и тканей [15]. В связи с этим единственным ее источником становится глюкоза, содержащаяся в крови матери, а важным компонентом деятельности плаценты является адекватный транспорт глюкозы от матери к плоду. Нарушения транспорта глюкозы в плаценте могут быть причиной развития ряда акушерских осложнений, в частности гестационного диабета, синдрома задержки развития и гипоксии плода [7].
Установлено, что в трансплацентарном транс -порте глюкозы участвуют специфические натрий-независимые транспортеры глюкозы (GLUT),
являющиеся трансмембранными белками [14]. Наибольшее значение отводится транспортерам GLUT1 и GLUT3.
Целью исследования явилось сравнительное изучение экспрессии транспортеров глюкозы (GLUT1 и GLUT3) в ворсинах плаценты на разных сроках беременности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследован материал плаценты 182 беременных. В 60 наблюдениях изучен материал соскобов из полости матки при неразвивающейся беременности при сроке гестации 6—11 нед (I триместр беременности): у 28 пациенток (средний возраст 31,7+2,3 года) была неразвивающаяся спонтанная беременность, у 32 женщин беременность наступила после применения вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Контрольную группу составили 34 женщины с прогрессирующей спонтанной беременностью, обратившиеся для проведения медицинского абор-
та. Все группы были сопоставимы по возрасту пациенток и анамнезу. В 23 наблюдениях исследованы образцы плаценты пациенток (средний возраст — 30,6±3,8 года) с поздним самопроизвольным выкидышем (18—21 нед беременности — II триместр): у 12 женщин была спонтанная беременность и у 11 использовали ВРТ. В 65 случаях плацента получена после родов при сроке 38—41 нед беременности (III триместр): у 30 пациенток (средний возраст — 29,9±4,7 года) имелась самопроизвольная беременность и 35 (средний возраст — 32,5±3,9 года) были после ВРТ.
Во всех наблюдениях имелась одноплодная беременность. Пациенток, у которых одноплодная беременность стала результатом редукции одного плода из двойни, исключали из исследования. Характерным было отсутствие у беременных исследуемых групп тяжелой экстрагенитальной патологии. При неразвивающейся беременности обследованных с хромосомной аномалией эмбриона исключали из исследования. У пациенток с доношенной беременностью масса плода была от 2900 до 4000 г (в среднем 3487+536,5 г при самопроизвольной беременности и 3398,6+478,4 г — после ВРТ). Во всех наблюдениях отсутствовали признаки врожденных аномалий плода.
У женщин с беременностью после ВРТ чаще регистрировалась соматическая патология: артериальная гипертензия (в 3,2 раза), сахарный диабет (в 1,7 раза), патология щитовидной железы (в 1,5 раза), нарушения обмена веществ (в 2,6 раза). Отмечался также более отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, характеризовавшийся большей частотой миомы матки (в 2,4 раза), воспалительных заболеваний придатков матки (2,3 раза), наружного генитального эндометриоза (4,0 раза), синдрома поликистозных яичников (1,6 раза), хронического эндометрита (1,4 раза), инфекций, предаваемых половым путем (в 1,2 раза), а также вну-триматочной патологии (в 2,7 раза). Что касается исходов предыдущих беременностей, то частота срочных родов у пациенток с индуцированной беременностью была в 2,3 раза ниже, чем у женщин со спонтанной беременностью, а частота неблагоприятных исходов (внематочной беременности, невынашивания беременности) была, наоборот, выше. Анализ течения беременности показал, что при индуцированной беременности акушерские осложнения регистрировались чаще: истмико-цервикальная недостаточность — в 1,8 раза, фетоплацентарная недостаточность — в 1,5, синдром задержки роста плода — в 1,7 раза, преэклампсия — в 1,7 раза, ге-стационный диабет — в 1,8 раза, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты — в 1,3 раза.
Макро- и микроскопическое исследование последа проводили по ранее описанной методике [1].
На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, оценивали степень зрелости ворсинчатого дерева и соответствие его сроку гестации, определяли ширину межворсинчатого пространства, наличие и характер компенсаторно-приспособительных процессов и патологических изменений.
Иммуногистохимическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 3—4 мкм с использованием моноклональных мышиных антител к транспортерам глюкозы: GLUT1 (разведение 1:100) и поликлональных кроличьих антител к GLUT3 (разведение 1:50) производства фирмы Abcam (Великобритания). Предварительную демаскировку антигенов осуществляли путем высокотемпературной обработки образцов в растворе цитратного буфера с pH 6,0 в программируемой барокамере «Pascal» (Dako, Дания). Активность эндогенной пероксидазы блокировали, обрабатывая срезы 0,3% раствора перекиси водорода в течение 15 мин. Инкубацию с антителами производили при температуре 4 С в течение 24 ч. Использовали систему детекции Dako REAL EnVision (Dako, Дания). В качестве фонового красителя использовали гематоксилин Гарриса. Количественно содержание GLUT оценивали по уровню оптической плотности в синцитиотрофобласте и эндотелиальных клетках ворсин плаценты с помощью системы анализа изображения на базе микроскопа «Nicon Eclipse 80i» с использованием программы «Nis Elements 3.2». Статистическую оценку количественных данных проводили с использованием программного пакета «Statistica 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При гистологическом изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, в группах контроля и неразвивающейся беременности отмечались однотипные изменения. Наблюдающиеся ворсины хориона, а также фрагменты эндометрия с участками децидуальной ткани и наличием сосудов, инфильтрированных клетками трофобласта и большим количеством фибриноида, свидетельствовали о внутриматочной беременности. Ворсинчатое дерево было представлено в основном мезенхимальными (эмбриональными) ворсинами. В единичных наблюдениях определялись элементы тканей эмбриона. Следует отметить, что во всех наблюдениях контрольной группы отмечена полноценная гестационная перестройка спиральных артерий матки. Для замершей беременности были характерны диффузный фиброз стромы и облитерация сосудов ворсин, небольшие депозиты кальция в области базальной мембраны трофобласта и строме ворсин, а также периворсин-чатые отложения фибриноида. В децидуальной ткани встречались участки некроза и кровоизлияний, а также небольшие скопления лимфоцитов и плазматических клеток.
В наблюдениях поздних самопроизвольных выкидышей при индуцированной и спонтанной беременности гистологическая картина была сходной. В ткани плаценты преобладали промежуточные незрелые ворсины, терминальные ворсины отсутствовали, что соответствовало сроку гестации. Отмечались умеренно выраженные отложения пе-риворсинчатого фибриноида. Основные патогисто-логические изменения наблюдались в области экстраплацентарных оболочек в виде воспалительной инфильтрации (хориоамнионит) различной степени выраженности, что, на наш взгляд, и явилось причиной выкидыша.
Гистологическое строение образцов плаценты, полученных после родов, в целом соответствовало сроку гестации. Ворсинчатое дерево плаценты было представлено в основном терминальными и в меньшей степени — зрелыми промежуточными ворсинами. Наличие умеренно выраженных син-цитиальных узелков и синцитиокапиллярных мембран свидетельствовало о развитии компенсаторно-приспособительных процессов. Вокруг стволовых ворсин отмечались отложения фибриноида, а в области базальной пластинки — мелкие фокусы кальци-ноза. В большинстве случаев в плаценте у женщин с индуцированной беременностью степень созревания ворсинчатого дерева соответствовала сроку геста-ции. Однако в 20 наблюдениях установлено отставание созревания на 2—3 нед от гестационного срока. Кроме того, в 14 плацентах после ВРТ выявлены нарушения маточно-плацентарного кровотока в виде множественных мелких инфарктов ворсин и мелких тромбов межворсинчатого пространства, которые локализовались преимущественно в парацентральной и краевой зонах. В 15% случаев отмечалось повышенное количество отложений периворсинчатого и межворсинчатого фибриноида.
При иммуногистохимическом анализе нами выявлены различные уровни экспрессии транспортеров глюкозы в структурах ворсин плаценты на разных сроках беременности и способах ее развития (рис. 1).
На всех изученных препаратах плаценты в синци-тиотрофобласте установлен более высокий уровень экспрессии GLUT1, чем в эндотелиальных клетках капилляров ворсин. Так, в ворсинах плаценты после артифициального аборта уровень реакции в эндоте-лиоцитах меньше показателей синцитиотрофобласта на 14,8% (р<0,05). Максимальная разница (20%) отмечается в ткани плаценты при доношенной физиологической беременности. Показатели экспрессии GLUT3 также имеют большие значения в синци-тиотрофобласте за исключением наблюдений неразвивающейся беременности ранних сроков, где его активность преобладает в эндотелиальных клетках. Действительно, при неразвивающейся беременности ранних сроков уровень реакции GLUT3 в эндоте-лиоцитах капилляров выше показателей синцитио-трофобласта на 8,1—9,2% (р<0,05), а во всех других изученных группах — меньше показателей в синци-тиотрофобласте на 2,6—19,0%.
Характеризуя иммуногистохимические препараты ткани плаценты при неразвивающейся беременности в I триместре, следует отметить повышение экспрессии GLUT1 и, наоборот, снижение уровня GLUT3 по сравнению с показателями в контрольной группе. При этом при физиологической беременности показатели GLUT1 превышают контрольные значения соответственно на 3,3% (р>0,05) и 9,6% (р<0,05) в синцитиотрофобласте и эндотелиоцитах. При неразвивающейся беременности после экстракорпорального оплодотворения показатели GLUT1 выше контрольных значений соответственно на 12,4 и 23,9% (р<0,05). Показатели же GLUT3 в ткани пла-
И
.70
I 65 у 60
! 55
£50 к
45
Й40
« 35
о
К НБС НБВ ПВС ПВВ ДБС ДБВ
К НБС НБВ ПВС ПВВ ДБС ДБВ
Рис. 1. Уровень экспрессии GLUTI (а), GLUT3 (б) в синцитиотрофобласте (светлые столбцы) и эндотелиоцитах капилляров (темные столбцы) ворсин плаценты на разных сроках беременности: К — контрольная группа, НБС — неразвивающаяся спонтанная беременность, НБВ — неразвивающаяся беременность после ВРТ, ПВС — поздний выкидыш при спонтанной беременности, ПВВ — поздний выкидыш при беременности после ВРТ, ДБС — доношенная спонтанная беременность, ДБВ — доношенная беременность после ВРТ
центы практически не различаются в группах неразвивающейся спонтанной и индуцированной беременности, при этом отмечена пониженная по сравнению с контролем выраженность реакции на 18,0—18,2% в синцитиотрофобласте и на 8,1—9,3% — в эндотели-альных клетках капилляров ворсин (р<0,05).
При изучении плаценты, полученной после поздних выкидышей (18—21-я неделя беременности), нами выявлено еще большее повышение уровня экспрессии GLUT1. Следует отметить, что степень отклонения показателя от контрольного уровня практически не отличается в эндотели-альных клетках и синцитиотрофобласте ворсин: на 14,0—14,8% (р<0,05) при физиологической и на 25,3—25,4% (р<0,05) — при индуцированной беременности. Показатели же GLUT3, напротив, понижены в еще большей степени по сравнению со значениями в контрольной группе: при спонтанной беременности — соответственно на 21,7 и 25,1% (р<0,05) в синцитиотрофобласте и эндотелиальных клетках, при беременности после ВРТ — на 27,1 и 36,9% (р<0,05).
При доношенной беременности установлена самая высокая экспрессия GLUT1 в ворсинах плаценты, при этом она практически не различалась в группах физиологической и индуцированной беременности, превышая контрольные показатели на 63,6—63,9% в синцитиотрофобласте и 53,7—57,3% в эндотелиоцитах ворсин (р<0,05). В свою очередь, значения GLUT3 при спонтанной беременности меньше контрольного уровня на 21,0% (р<0,05) в
синцитиотрофобласте и 25,9% (р<0,05) — в эндо-телиоцитах, а при индуцированной беременности — меньше соответственно на 13,6 и 28,2% (р<0,05). Значение GLUT3 в ворсинах плаценты при доношенной беременности несколько превышало соответствующий показатель в случае позднего выкидыша. Наиболее значимая разница (19,6%) отмечается в синцитиотрофобласте ворсин при индуцированной беременности.
Следовательно, по мере увеличения срока ге-стации наблюдается повышение уровня экспрессии GLUT1. Действительно, по данным литературы [11, 17], максимальная экспрессия GLUT1 отмечается в плаценте в конце беременности. Подобная закономерность, видимо, обусловлена прогрессирующим увеличением процессов захвата и потребления глюкозы, необходимой для роста и развития плода [13].
Следует также отметить, что концентрация GLUT1 в области микроворсинок, т.е. со стороны материнской крови, в 3 раза выше, чем в базальной части клеток [3]. Есть мнение [12], что разница в экспрессии GLUT1 может достигать 15—20 раз. Такая асимметричная экспрессия обеспечивает максимальный градиент глюкозы, необходимый для ее транспорта через базальные отделы и для дальнейшего поступления к плоду [18].
При этом именно базальная мембрана является отграничивающим этапом в транспорте глюкозы [4]. В экспериментах in vitro показано, что экспрессия GLUT на базальной мембране обратно пропорциональна концентрации глюкозы в окружающей меж-
Рис. 2. Экспрессия GLUTI (а, в, д) и GLUT3 (б, г, е) в плаценте при спонтанной (а, б, в, е) и индуцированной (г, д) беременности: а, б — контрольная группа (медицинский аборт); в, г — неразвивающаяся беременность; д — поздний выкидыш; е — доношенная беременность. Иммунопероксидазный метод, х400
ворсинчатой крови. В процессе перехода GLUT1 с мембраны клетки в цитоплазму происходит его инактивация [10]. Следует отметить, что захват глюкозы остается неизменным, пока ее концентрация не превышает 15 ммоль/л, при более высоких ее уровнях (20 и 25 ммоль/л) отмечается снижение активности GLUT1 [9].
Данные литературы об изменениях GLUT3 с увеличением гестационного срока не столь однозначны [5]. Первоначально авторы указывали на экспрессию GLUT3 в цито- и синцитиотрофобласте только в I триместре беременности [8]. Дальнейшее совершенствование методик и реактивов позволило выявить GLUT3 в синцитиотрофобласте и эндотелии сосудов ворсин в III триместре беременности [11]. Нам также удалось выявить положительную реакцию GLUT3 во всех наблюдениях, включая срок 39—40 нед гестации. Несмотря на то, что наиболее высокое содержание отмечено на ранних сроках гестации, в целом уровень GLUT1 обратно коррелирует с экспрессией GLUT3 [4].
Согласно данным [16], GLUT3 имеет большее сродство к глюкозе по сравнению с другими изо-формами траспортеров глюкозы, включая GLUT1, что указывает на его исключительную роль в транспорте глюкозы в тканях, где она является основным метаболическим субстратом (в частности, в головном мозге). Так, при высоких потребностях глюкозы и/ или гипогликемии повышение экспрессии GLUT3 в головном мозге обеспечивает нужную концентрацию глюкозы в нейронах даже при низкой ее концентрации в кровотоке.
ЛИТЕРАТУРА
На ранних сроках беременности, на этапе инвазии трофобласта в децидуальные сосуды, элементы плаценты, включая межворсинчатый кровоток, окончательно еще не сформированы [6], в связи с чем питательные вещества, в том числе и глюкоза, поступают в плаценту в условиях лимитированного кровотока вплоть до установления полноценного фето-материнского кровотока. В результате на ранних сроках отмечается более высокая концентрация GLUT3, обладающего высокой аффинностью к глюкозе [16, 2].
По данным M. Baumann и соавт. [4], GLUT3 локализуется в эндотелиоцитах только артериальных сосудов плаценты. Поскольку по артериям происходит отток крови с малым содержанием глюкозы от плода, наличие GLUT3 позволяет извлекать ее даже при низкой концентрации глюкозы в кровотоке за счет повышения трансплацентарного градиента.
Таким образом, при иммуногистохимическом исследовании ворсин плаценты установлено повышение уровня экспрессии GLUT1 и снижение GLUT3 в процессе развития беременности. Для неразвивающейся беременности характерны более высокие значения GLUT1 и пониженный по сравнению с группой контроля уровень GLUT3, что и может быть одной из причин нарушения физиологического течения беременности. Выявленные различия в уровнях экспрессии изученных GLUT в структурах ворсин плаценты при спонтанной и индуцированной беременности могут быть связаны с различной частотой акушерских осложнений.
sion and activity in the human placenta // Placenta. - 1998; 19 (7): 517-24.
13. Jansson T., Wennergren M., Illsley N. Glucose transporter protein expression in human placenta throughout gestation and in intrauterine growth retardation // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1993; 77: 1554-62.
14. Joost H., Thorens B. The extended GLUT-family of sugar/polyol transport facilitators: nomenclature, sequence characteristics, and potential function of its novel members (review) // Mol. Membr. Biol. - 2001; 18 (4): 247-56.
15. Kalhan S., Parimi P. Gluconeogenesis in the fetus and neonate // Semin. Perinatol. -2000; 24: 94-106.
16. Maher F., Davies-Hill T., Simpson I. Substrate specificity and kinetic parameters of GLUT3 in rat cerebellar granule neurons // Biochem. J. - 1996; 315: 827-31.
17. Sakata M., Kurachi H., Imai T. et al. Increase in human placental glucose transporter-1 during pregnancy // Eur. J. Endocrinol. -1995; 132 (2): 206-12.
18. Vardhana P., Illsley N. Transepithelial glucose transport and metabolism in BeWo choriocarcinoma cells // Placenta. - 2002; 23: 653-60.
1. Дубова Е.А., Павлов К.А., Боровкова Е.И. и др. Фактор роста эндотелия сосудов и его рецепторы в плаценте беременных с ожирением // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2011; 153 (2): 218-23.
2. Arbuckle M., Kane S., Porter L. et al. Structure-function analysis of liver-type (GLUT2) and brain-type (GLUT3) glucose transporters: expression of chimeric transporters in Xenopus oocytes suggests an important role for putative transmembrane helix 7 in determining substrate selectivity // Biochemistry. - 1996; 35 (51): 16519-27.
3. Barros L., Yudilevich D., Jarvis S. et al. Quantitation and immunolocalization of glucose transporters in the human placenta // Placenta. - 1995; 16 (7): 623-33.
4. Baumann M., Deborde S., Illsley N. Placental Glucose Transfer and Fetal Growth // Endocrine. - 2002; 19 (1): 13-22.
5. Brown K., Heller D., Zamudio S. et al. Glucose transporter 3 (GLUT3) protein expression in human placenta across gestation // Placenta. - 2011; 32: 1041-9.
6. Burton G., Jaunaiux E. Maternal vasculari-sation of the human placenta: does the embryo develop in a hypoxic environ-
ment? // Gynecol. Obstet. Fertil. - 2001; 29 (7-8): 503-8.
7. Desoye G., Gauster M., Wadsack C. Placental transport in pregnancy pathologies // Am. J. Clin. Nutr. - 2011; 94 (6): 18961902.
8. Haber R., Weinstein S., O'Boyle E. Tissue distribution of the human GLUT3 glucose transporter // Endocrinology. - 1993; 132: 2538-43.
9. Hahn T., Barth S., Weiss U. et al. Sustained hyperglycemia in vitro down-regulates the GLUT1 glucose transport system of cultured human term placental trophoblast: a mechanism to protect fetal development? // FASEB J. - 1998; 12 (12): 1221-31.
10. Hahn T., Hahn D., Blaschitz A. et al. Hyperg-lycaemia-induced subcellular redistribution of GLUT1 glucose transporters in cultured human term placental trophoblast cells // Diabetologia. - 2000; 43 (2): 173-80.
11. Hauguel-de Mouzon S., Leturque A., Alsat E. et al. Developmental expression of Glut1 glucose transporter and c-fos genes in human placental cells // Placenta. - 1994; 15 (1): 35-46.
12. Illsley N., Sellers M., Wright R. Glycaemic regulation of glucose transporter expres-
