CC BY
22
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2016. Т. 11. № 4
medical news of north caucasus
2016. Vоl. 11. Iss. 4
Литература
1. Берштейн, Л. М. Рак щитовидной железы: эпидемиология, эндокринология, факторы и механизмы канцерогенеза / Л. М. Берштейн // Практическая онкология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 1-8.
2. Валдина, Е. А. Заболевания щитовидной железы / Е. А. Валдина. - СПб. : Питер, 2005. - 368 с.
3. Заривчацкий, М. Ф. Основы хирургической эндокринологии : руководство для врачей / М. Ф. Заривчацкий, О. П. Богатырев, С. А. Блинов [и др.]. - Пермь : ГБОУ ВПО «ПГМУ им. ак. Е. А. Вагнера» Минздрава России, 2014. - 314 с.
4. Левински, А. Узловой зоб, подозрительный на злокачественность / А. Левински, З. Адамчевски // Thyroid International. - 2013. - № 1. - С. 1-18.
References
1. Bernstein L. M. Prakticheskaya onkologiya. - Practical Oncology. 2007;8(1):1-8.
2. Valdina E. A. Thyroid disease. Manual. St. Petersburg: Peter; 2005. 368 p.
3. Zarivchatsky M. F., Bogatyrev O. P., Blinov S. A., Deni-sov S. A., Kolevatov A. P., Teplykh N. S. Warm Fundamentals of Surgical Endocrinology: a guide for physicians. Perm; 2014. 314 р.
4. Lewinski A., Adamchevski Z. Thyroid International. 2013;(1):1-18.
Сведения об авторах:
5. Мерабишвили, В. М. Онкологическая служба в Санкт-Петербурге и районах города в 2005 г / В. М. Мерабишвили. - Санкт-Петербург, 2006. - 123 с.
6. Рак щитовидной железы. «ГЕОТАР-Медиа» [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://tomograph. dp.ua/pdf/oncology-books/Рак%20щитовидной%20 железы.pdf
7. Чиссов, В. И. Злокачественные новообразования в России в 2000 году / В. И. Чиссов, В. В. Старинский. -М. : МНИОИ им. П. А. Герцена, 2002. - 264 с.
8. Schlumberger, M. J. Papillary and follicular thyroid carcinoma / M. J. Schlumberger // New Engl. J. Med. -1998. - Vol. 338, № 5. - P. 297-306.
5. Merabishvili V. M. Oncology Service in St. Petersburg and parts of the city in 2005. St. Petersburg; 2006. 123 p.
6. Thyroid Cancer. «GEOTAR Media». URL: http://tomo-graph.dp.ua/pdf/oncology-books/PaK%20^MTOBUfl-HOM%20xe.ne3bi.pdf
7. Chissov V. I., Starinskiy V. V. Malignancies in Russia in 2000. M.: «MNIOI them. P. A. Gertse»; 2002. 264 p.
8. Schlumberger M. J. New Engl. J. Med. 1998;338(5):297-306.
Варганов Михаил Владимирович, доктор медицинских наук, доцент кафедры факультетской хирургии; тел.: 89226851883; e-mail: [email protected]
Проничев Вячеслав Владимирович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой факультетской хирургии; тел.: 89128501967; e-mail: [email protected]
Леднева Анна Викторовна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры факультетской хирургии; тел.: 89127616151; e-mail: [email protected]
Костарева Елена Юрьевна, кандидат медицинских наук, врач-цитолог; тел.: 8(3412)468661; e-mail: [email protected]
Загребина Надежда Ивановна, врач ультразвуковой диагностики; тел.: 8(3412)468661; e-mail: [email protected]
Суханов Сергей Аркадьевич, врач-патологоанатом; тел.: 8(3412)646653; e-mail: [email protected]
Головизнина Елена Владимировна, врач ультразвуковой диагностики; тел.: 8(3412)468661; e-mail: [email protected]
Порываева Екатерина Леонидовна, аспирант кафедры факультетской хирургии; врач-хирург; тел.: 89127628636; e-mail: [email protected]
© Коллектив авторов, 2016
УДК 616.311-006.6-018:612.015
DOI - http://doi.org/10.14300/mnnc.2016.11122
ISSN 2073-8137
ЭКСПРЕССИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ТКАНЯХ РАКА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА
О. И. Кит1, Е. Ф. Комарова1, В. И. Кононенко2, В. В. Позднякова1, А. Ю. Максимов1, А. А. Демидова2
1 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, Россия
2 Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону, Россия
EXPRESSION OF TRANSCRIPTION FACTORS IN TISSUES OF ORAL MUCOSA CANCER
Kit O. I.1, Komarova E. F.1, Kononenko V. I.2, Pozdniyakova V. V.1, Maksimov A. Yu.1, Demidova A. A.2
1 Rostov Research Institute of Oncology, Rostov-on-Don, Russia
2 Rostov State Medical University, Rostov-on-Don, Russia
В исследовании выполнялось изучение экспрессии Н^-1а и ядерных факторов транскрипции семейства NF-kB р50 и р65 в ткани опухоли больных раком слизистой оболочки полости рта (СОПР). Методом ИФА в опухолевой ткани 41 больного раком СОПР (T1-4N0-2M0-1) оценивали уровень гипоксия-индуци-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Онкология
ORiGiNAL RESEARCH
Oncology
бельного фактора-1 a (HIF-1 а) и ядерных факторов транскрипции семейства NF-kB (р50 и р65 форм). Контролем служила гистологически неизмененная ткань слизистой оболочки рта. В опухолевой ткани по сравнению с гистологически неизмененной содержание HIF-1 а возросло в 2,2 раза (p<0,05), NF-kB p50 - в 3 раза (p<0,05), NF-kB p65 - в 6 раз (p<0,05). Корреляционная связь между содержанием HIF-1 а и NF-kB p50 в опухолевой ткани была наибольшей у больных с низкой степенью дифференцировки G3 (R=0,56 при р<0,0001) и при опухолевом поражении лимфоузлов (R=0,53 при р=0,0001). Корреляционная связь между HIF-1 а и NF-kB p65 была менее тесной. Таким образом, в опухолевой ткани рака слизистой оболочки полости рта установлена статистически значимая положительная корреляционная связь между активацией фактора HIF-1 а и транскрипционных факторов NF-kB р50 и NF-kB р65, сопряженная с распространенностью опухолевого процесса.
Ключевые слова: рак слизистой оболочки полости рта, HIF-1, NF-kB
In the study the expression of HIF-1 а and nuclear transcription factors of the NF-kB family, p50 and p65 in tumor tissue of patients with oral mucosa cancer (OMC) were examined. Levels of hypoxia inducible factor-^ (HIF-1 а) and nuclear transcription factors of the NF-kB family (p50 and p65) were studied by ELISA in tumor tissue of 41 OMC (T1-4N0-2M0-1) patients. Histologically unchanged tissue of oral mucosa served as the control. Tumor tissue showed increased levels of HIF-1 а - by 2.2 times (p<0.05), NF-kB p50 - by 3 times (p<0.05) and NF-kB p65 - by 6 times (p<0.05), in comparison with the histologically unchanged tissue. Correlation between HIF-1 а and NF-kB p50 in tumor tissue was the strongest in patients with poorly differentiated G3 tumors (R=0.56, р<0.0001) and in patients with lymph node lesions (R=0.53, р=0.0001). Correlation between HIF-1 а and NF-kB p65 was not so strong.
In conclusions, tumor tissue of oral mucosa cancer showed statistically significant positive correlation between the activation of HIF-1 а and NF-kB р50 and NF-kB р65, which was connected with the tumor grade.
Keywords: oral mucosa cancer, HIF-1, NF-kB
При формировании раковой опухоли изменяется баланс между потребностью в кислороде и его доставкой. Гипоксия, с одной стороны, ограничивает рост опухоли, с другой - через стимуляцию факторов ангиогенеза ведет к росту новых сосудов и метастазированию опухолевых клеток, а с третьей - стимулирует транскрипционные факторы, способствуя быстрому делению клеток, в том числе опухолевых [3]. Индуцируемый гипоксией транскрипционный фактор 1-альфа (HIF-1a) считается ведущим транскрипционным регулятором генов млекопитающих, активируется в физиологически важных местах регуляции кислородных путей, обеспечивая быстрые и адекватные ответы на гипоксический стресс, включает гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический метаболизм, эритропоэз и апоптоз [7, 9-11]. В экспериментальных исследованиях показано, что у эмбрионов крыс с «нокаутом» гена HIF-1a не наблюдается апоптотического ответа [6].
Условием для стимуляции посредством гипок-сия-индуцибельного фактора других транскрипционных молекул, способствующих делению опухолевых клеток, является проникновение фактора в ядро. В настоящее время выявлено взаимовлияние транскрипционных факторов HIF-1 a и NF-kB даже в условиях нормоксии [12]. Ядерный транскрипционный фактор kappa-В (nuclear factor kappa-В, NF-kB) связан с процессами апоптоза и контролем пролиферации клеток [8]. В настоящее время показано, что регуляция NF-kB сигнального пути нарушена во многих опухолях человека, в том числе и при раке слизистой оболочки полости рта (СОПР) [4]. Содержание в ткани опухоли рака СОПР NF-kB сопряжено с вовлечением в опухолевый процесс регионарных лимфоузлов [5].
Целью исследования было изучение экспрессии HIF-1 a и ядерных факторов транскрипции семейства NF-kB р50 и р65 в ткани опухоли больных раком СОПР.
Материал и методы. В исследование были включены 41 больной раком слизистой оболочки полости рта T1-4N0-2M0-1 стадии процесса. Средний возраст больных составил 50,5±4,4 лет. Изолированное поражение тканей языка, переход процесса с языка на дно полости рта, очаги поражения в ретромоляр-ной области и рак дна полости рта были установлены соответственно у 32,3; 19,4; 23,3 и 19,4 % больных. Были выявлены единичные случаи локализации на слизистой щеки и твердого неба.
Диагностика рака основывалась на результатах гистологического исследования в соответствии с отраслевыми стандартами и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии. Проведение данной работы было одобрено этическим комитетом ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ. В каждом конкретном случае было получено добровольное информированное согласие больных на использование материалов для проведения научных исследований.
Были изучены ткани опухоли, взятые во время оперативного вмешательства, а также образцы гистологически неизмененной ткани, взятые от удаленных от видимого края опухоли участков (контроль). Исследуемые ткани были заморожены для дальнейшего хранения при температуре -70 °С.
Методом твердофазного иммуноферментно-го анализа определяли уровень экспрессии гипок-сия-индуцибельного фактора-1 а (HIF-1 а; USCN Life Science, Китай) и ядерных факторов транскрипции семейства каппа-В (NF-kBр50 и NF-kBр65, Caymanchem, США) в 10 % цитозольных фракциях, приготовленных на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7.4, содержащем 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА.
Данные обрабатывались при помощи пакета статистических программ «STATISTICA 10.0». Взаимосвязь изученных факторов выявляли с помощью корреляционного анализа по Спирмену. При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских исследований.
МЕДИЦИНСКИЙ ВЕСТНИК СЕВЕРНОГО КАВКАЗА
2016. Т. 11. № 4
MEDiCAL NEWS OF NORTH CAUCASUS
2016. Vоl. 11. iss. 4
результаты и обсуждение. Содержание изученных транскрипционных факторов в ткани опухоли и гистологически неизмененной ткани больных раком СОПР представлено в таблице 1.
Таблица 1
тканевая экспрессия транскрипционных факторов в ткани опухоли больных раком слизистой оболочки ротовой полости
Примечание: 1 - различия достоверны по сравнению с гистологически неизмененной тканью (р<0,05). ОП - ткань опухоли, НТ - гистологически неизмененная ткань.
В опухолевой ткани по сравнению с гистологически неизмененной тканью содержание HIF-1a возросло в 2,2 раза (р<0,05), NF-kB р50 - в 3 раза (р<0,05), NF-kB р65 - в 6 раз (р<0,05). Повышение коэффициента NF-kB р65/р50 для опухолевой ткани свидетельствовало о преобладании активированных форм NF-kB.
Анализ результатов оценки корреляционной связи между содержанием Н^-1а и NF-kB р50 в опухолевой ткани больных раком СОПР выявил следующие особенности (табл. 2): при Т3-4 установлена достоверная прямая связь ^=0,34 при р=0,04) между параметрами. В то время как у пациентов при Т1-2 статистически значимая связь отсутствовала ^=0,11 при р=0,35).
Таблица 2
корреляционная связь содержания Н^-1а и NF-kB p50 в ткани опухоли больных раком СОпр с различным клиническим статусом
Корреляционная связь между содержанием Н^-1а и NF-kB р50 в опухолевой тикани была более тесной у больных с низкой степенью дифференцировки 03 ^=0,56 при р<0,0001) и при опухолевом поражении лимфоузлов ^=0,53 при р=0,0001). Известно, что в неизмененной ткани ядерный фактор транскрипции NF-kB находится в цитоплазме в неактивном состоянии в ассоциации с ингибитором [4], что объясняет его низкую активность. Наличие статистической взаимосвязи между Н^-1а и NF-kB р50 свидетельствовало о совместной активации двух транскрипционных факторов при развитии и прогрессии рака СОПР.
Таким образом, результаты анализа показателей у больных с различным клиническим статусом показали, что взаимосвязь между изучаемыми факторами усиливалась при повышении размера опухоли, наличии метастазов в лимфоузлы и снижении дифференцировки опухолевых клеток.
Структура корреляционной связи между Н^-1а и NF-kB р65 в ткани опухоли больных раком СОПР повторяла характеристики связи между Н^-1а и NF-kB р50 (табл. 3).
Таблица 3
корреляционная связь содержания Н^-^ и NF-kB p65 в ткани опухоли больных раком СОпр с различным клиническим статусом
Статус Показатель 1 Показатель 2 Я P
Т1-2 HIF-1a NF-kB p65 0,23 0,58
Т3-4 HIF-1a NF-kB p65 0,31 0,03
N0 HIF-1a NF-kB p65 0,21 0,27
N1-2 HIF-1a NF-kB p65 0,40 0,002
G1-2 HIF-1a NF-kB p65 0,44 0,03
G3 HIF-1a NF-kB p65 0,47 <0,0001
Однако связь между Н^-1а и NF-kB р65 была менее тесной, чем между Н^-1а и NF-kB р50 при Т3-4 ^=0,31 при р=0,03 против R=0,34 при р=0,04), N1-2 ^=0,40 при р=0,002 против R=0,52 при р=0,0001), 03 ^=0,47 при р<0,0001 против R=0,56 при р<0,0001).
Полученные результаты свидетельствуют, что в ткани опухоли рака слизистой оболочки полости рта активность изученных транскрипционных факторов повышалась по сравнению с контрольными показателями. Обнаружено повышение индекса ^-кВ р65/ ^-кВ р50 в опухолевой ткани рака СОПР, что говорит о преобладании ядерного транскрипционного фактора каппа-В формы р65. Известно, что в неизмененной ткани ядерный фактор транскрипции ^-кВ находится в цитоплазме в неактивном состоянии в ассоциации с ингибитором [2], что объясняет его низкую активность. Повышение активности факторов, а также коэффициента ^-кВ р65/ р50 в опухолевой ткани по сравнению с гистологически неизмененной тканью указывает на преобладание активированных форм ^-кВ. Опережающее накопление ^-кВ р65 по сравнению с ^-кВ р50 свидетельствует о повышении транскрипционной активности фактора ^-кВ, который прямо или опосредованно модулирует экспрессию генов, контролирующих клеточное деление, апоптоз, неоан-гиогенез и инвазию - основополагающие процессы канцерогенеза [1].
Установлена наиболее тесная положительная корреляционная связь между содержанием Н^-1а и ^-кВ р50 в опухолевой ткани у больных с низкой степенью дифференцировки 03 и при опухолевом поражении лимфоузлов. У пациентов с этими же характеристиками заболевания корреляционная связь между Н^-1а и ^-кВ р65 была менее выраженной, но достоверной, что вероятно объясняется несоответствием между градиентом роста Н^-1а, ^-кВ р50 и ^-кВ р65 по мере развития и прогрессии рака СОПР. Наличие статистической взаимосвязи между Н^-1а и ^-кВ р50 свидетельствовало о совместной взаимосвязанной активации двух транскрипционных факторов при развитии и прогрессии рака СОПР.
заключение. Таким образом, в опухолевой ткани рака слизистой оболочки полости рта установлена статистически значимая положительная
Уровень экспрессии УЕ/мг белка Исследуемая ткань Медиана Нижний квартиль Верхний квартиль
HIF-1a ОП 11,5±4,2* 10,9 8,5 13,3
НТ 5,2±2,5 5,1 3,7 2,5
NF-kB p50 ОП 10,7±3,4* 10,2 7,8 15,2
НТ 3,6±1,6 3,8 2,4 5,3
NF-kB p65 ОП 12,1±3,8* 12,5 8,7 16,1
НТ 2,0±0,9 2,2 1,1 3,2
Коэффициент NF-kB p65/ р50 ОП 1,17±0,151 1,12 0,92 1,28
НТ 0,61±0,06 0,57 0,45 0,73
Статус Показатель 1 Показатель 2 Я P
Т1-2 HIF-1a NF-kB p50 0,11 0,35
Т3-4 HIF-1a NF-kB p50 0,34 0,04
N0 HIF-1a NF-kB p50 0,18 0,21
N1-2 HIF-1a NF-kB p50 0,52 0,0001
G1-2 HIF-1a NF-kB p50 0,38 0,02
G3 HIF-1a NF-kB p50 0,56 <0,0001
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Онкология
ORiGiNAL RESEARCH
Oncology
корреляционная связь между активацией фактора Н1Р-1 а и транскрипционных факторов NF-kB р50 и NF-kB р65, сопряженная с распространенностью опухолевого процесса, что позволяет говорить о взаимовлиянии транскрипционных факторов, пред-
полагать модифицирующее влияние гипоксия-индуцибельного фактора на активацию ядерных факторов транскрипции семейства NF-kB, а также значимость этих факторов в патогенезе рака слизистой оболочки полости рта.
Литература
1. Герштейн, Е. С. Ключевые компоненты ^-кВ-сигнального пути в опухолях больных раком молочной железы / Е. С. Герштейн, А. М. Щербаков, Е. В. Ошкина // Вестник Тамбовского университета. Серия: Естественные и технические науки. - 2014. -Т. 19, № 3. - С. 950-956.
2. Клаан, Н. К. Ядерный фактор каппа В (^-кВ) в качестве мишени для действия природных противоопухолевых соединений / Н. К. Клаан, Т. А. Пронина, Л. П. Акиньшина, В. В. Решетникова // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - № 1. - С. 3-8.
3. Лимфангиогенез и метастазирование опухолей / А. А. Фильченков // Онколопя (укр.). - 2009. - Т. 11, № 2. - С. 94-103.
4. Спирина, Л. В. Активность и субъединичный состав протеасом в плоскоклеточных карциномах головы и шеи / Л. В. Спирина, И. В. Кондакова, Е. Л. Чойнзонов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - № 1. - С. 89-92.
5. Спирина, Л. В. Экспрессия транскрипционных факторов NF-kB и HIF-1 в плоскоклеточных карциномах головы и шеи: связь с прогнозом заболевания / Л. В. Спирина, Е. Л. Чойнзонов, И. В. Кондакова [и др.] // Вопросы онкологии. - 2013. - № 5. - С. 575-579.
6. Carmeliet, P. Role of HIF-1a in hypoxia-mediated apop-tosis, cell proliferation and tumour angiogenesis / P. Carmeliet, Y. Dor, J.-M. Herbert [et al.] // Nature. - 1998. -№ 394. - P 485-490.
7. De Lima, P. O. Hypoxic condition and prognosis in oral squamous cell carcinoma / P. O. De Lima, C. C. Jorge, D. T. Oliveira, M. C. Pereira // Anticancer research. -2014. - Vol. 34. - P. 605-612.
8. Hoffmann, A. Circuitry of nuclear factor kappaB signaling / A. Hoffmann, D. Baltimore // Immunol. Rev. - 2006. -Vol. 210. - P. 171-186.
9. Kang, F. W. Hypoxiainducible factor-1a overexpression indicates poor clinical outcomes in tongue squamous cell carcinoma / F. W. Kang, Y. Gao, L. Que [et al.] // Exp. Ther. Med. - 2013. - Vol. 5. - P. 112-118.
10. Perez-Sayans, M. Hypoxia-inducible factors in OSCC / M. Perez-Sayans, J. M. Suarez-Peflaranda, G. D. Pilar, F. Barros-Angueira // Cancer letters. - 2011. - Vol. 313, № 1. - P. 1-8.
11. Semenza, G. L. Oxygen sensing, hypoxia-inducible factors, and disease pathophysiology / G. L. Semenza // Ann. Rev. Pathol. - 2013. - Vol. 7. - P. 7.
12. Uden, P. Regulation of hypoxia-inducible factor-1 alpha by NF-kappaB / P. Uden, N. S. Kenneth, S. Rocha // Bio-chem. J. - 2008. - Vol.412, № 3. - P. 477-484.
References
1. Gershtejn E. S., Shherbakov A. M., Oshkina E. V. Vestnik Tambovskogo universiteta. - Journal Tambov University Reports. 2014;19(3):950-956.
2. Klaan N. K., Pronina T. A., Akin'shina L. P., Reshetniko-va V. V. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal. - Russian journal of Biotherapy. 2014;1:3-8.
3. Fil'chenkov A. A. Onkologija. - Oncology. 2009;11(2):94-103.
4. Spirina L. V., Kondakova I. V., Chojnzonov E. L., Sharo-va N. P., Chizhevskaja S. Ju, Shishkin D. A. Bjulleten' jek-sperimental'noj biologii i mediciny. - Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2010;1:89-92.
5. Spirina L. V., Chojnzonov E. L., Kondakova I. V., Shishkin D. A., Chizhevskaja S. Ju. Voprosy onkologii. - Problems of oncology. 2013;5:575-579.
6. Carmeliet P., Dor Y., Herbert J.-M. Nature. 1998;394:485-490.
7. De Lima P. O., Jorge C. C., Oliveira D. T., Pereira M. C. Anticancer research. 2014;34:605-612.
8. Hoffmann A., Baltimore D. Immunol. Rev. 2006;210:171-186.
9. Kang F. W., Gao Y., Que L., Sun J., Wang Z. L. Exp. ther. med. 2013;5:112-118.
10. Perez-Sayans M., Suarez-Peflaranda J. M., Pilar G. D., Barros-Angueira F. Cancer letters. 2011;313(1):1-8.
11. Semenza G. L. Ann. rev. pathol. 2013;7:7.
12. Uden P., Kenneth N. S., Rocha S. Biochem. J. 2008;412(3):477-484.
Сведения об авторах:
Кит Олег Иванович, доктор медицинских наук, профессор, директор; тел.: (8633)003005; e-mail: [email protected]
Комарова Екатерина Федоровна, доктор биологических наук, профессор РАН, главный научный сотрудник; тел.: 89287777523; e-mail: [email protected]
Кононенко Владимир Иванович, кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой стоматологии № 3; тел.: 89185541831; е-mail: [email protected]
Позднякова Виктория Вадимовна, доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела опухолей мягких тканей и костей; тел.: 89034046277; е-mail: [email protected]
Максимов Алексей Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по перспективным научным разработкам; тел.: 89198874902; е-mail: [email protected]
Демидова Александра Александровна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры медицинской и биологической физики; тел.: 89081764900; е-mail: [email protected]
