CC BY
49УДК 57.086.8:577.29 DOI: 10.24411/0023-4885-2021-10105
Е.С. Колесник: SPIN-код: 3533-3806; ORCID: 0000-0002-2465-7184; AuthorlD: 1050062; В.И. Глазко: SPIN-код: 1556-3661; AuthorlD: 297850; ORCID: 0000-0002-8566-8717; ResearcherlD: Q-3017-2019, L-3116-2017; ScopusID: 7003981461
Т.Т. Глазко: SPIN-код: 9581-8980; AuthorID: 186988; ORCID: 0000-0002-3879-6935; ResearcherID: S-4925-2017; ScopusID: 6603540980
Г.Ю. Косовский: SPIN-код: 3736-3480; ORCID: 0000-0003-3808-3086; AuthorID: 353097;
ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРА ГЕНА ЛЕПТИНА У КРОЛИКОВ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛОВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
Экспрессия лептина у кроликов
Е.С. Колесник*1, В.И. Глазко1, Т.Т. Глазко1, Г.Ю. Косовский1
1Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева» 140143, Московская область, Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6 e-mail: niipzk@mail.ru
Лептин - ключевой гормон липидного метаболизма млекопитающих, является плейотропным медиатором в широком диапазоне нейроэндокринных функций. В настоящем исследовании представлены впервые выявленные различия уровней экспрессии рецептора гена лептина у кроликов мясных и мясо-шкурковых пород различных половозрастных групп методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Для постижения поставленной цели впервые были спроектированы последовательности олигонук-леотидов, наиболее информативные из которых рекомендуется к использованию в ходе в ПЦР-РВ для изучения экспрессии рецептора к лептину.
Ключевые слова: лептин, экспрессия, кролик, ПЦР, экспрессия лептина, РНК
Лептин — пептидный гормон (16 к Да), продуцируемый белой жировой тканью (относится к адипокинам) и участвующий в регуляции пищевого поведения и энергообмена, а также является плейотропным медиатором в широком диапазоне нейроэндокринных функций [1]. В настоящий момент известно о локализации рецептора к лептину практически во всех органах и тканях [2]. Подавляет аппетит, регулируя деятельность центра насыщения в мозге. Эффект снижения веса опосредуется взаимодействием лептина с рецептором в гипоталамусе, где представлена длинная изоформа рецептора. Короткие изоформы рецептора лептина экспрессируют преимущественно в паренхиматозных органах, таких как почки и легкие, а также в хориоидном сплетении головного мозга. Растворимая изоформа рецептора леп-тина циркулирует в крови и играет роль лептин-связывающего белка. Длинная форма рецептора
состоит из трех доменов - внеклеточного, трансмембранного и внутриклеточного, участвующих в трансдукции сигнала связывания лептина к таким мессенджерам, как МАР-киназа, субстрат инсулинового рецептора, оксид азота, киназа Януса, фактор трансдукции и активации транскрипции [3]. Не исключено, что в развитии ожирения важную роль может играть гиперлептине-мия, которая указывает на резистентность к леп-тину. При этом известно, что развитие крайней степени ожирения может быть связано с мутациями, влекущими инактивацию рецепторов к лептину [4]. Весь спектр влияний, связанных с активацией/ ингибированием лептиновых рецепторов, изучен пока недостаточно.
Целью исследования являлось выявление уровней экспрессии рецептора к лептину у кроликов различных пород разных половозрастных групп.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе отдела экспериментального кролиководства и отдела биотехнологии ФГБНУ НИИПЗК.
Забор образцов крови проводили из краевой ушной вены в объеме 3-5 мл в пробирки без антикоагулянтов и хелатирующих агентов. Исследовали образцы крови от самцов и самок кроликов мясо-шкурковых пород белый великан и советская шиншилла и мясной породы - калифорнийская. Возраст исследуемых животных 3 недели, 3 месяца, 6 месяцев, 2 года, 5 лет. Каждая половозрастная группа состояла из трех особей. Каждую пробу исследовали в трех повторностях.
Экстракция РНК проводилась с набором «РНК-экстран» (Синтол, Россия). Очистку РНК проводили стандартным методом с использованием гуанидинизотиоционата и фенола [5]. Качество РНК проверяли электрофорезом в 1%-м ага-розном геле в присутствии бромида этидия. Количество выделенной РНК определялось спектрофотометрически (BiowaveII, Biochrom, США). Для этого сухой осадок РНК растворяли в 24 мкл деионизованной воды с добавлением 0,1% диэтилпирокарбоната (ДЭПК). Для получения раствора РНК с подходящей концентрацией проводится измерение концентрации РНК на спектрофотометре. В каждую пробирку объемом 0,5 мл (индивидуальную для каждого образца) добавляли 246 мкл деионизованной или дистиллированной воды и 4 мкл раствора РНК и перемешивали. Получившийся раствор вносили в кювету спектрофотометра и измеряли его при длине волны 260 нм и 280 нм. А260/280 РНК находилось в пределах 1,8-2,0 соответственно инструкции производителя набора для выделения РНК.
Реакция обратной транскрипции проводилась соответственно инструкции производителя «набор реагентов для проведения обратной транскрипции» (Синтол, Россия).
Концентрация кДНК оценена визуально по маркеру (GeneRuler DNA Ladder 100bp, ThermoS-cientific) после электрофоретического разделения в 1,5% агарозном геле в 1х трис-ацетатном (TAE) буфере (40 mMTris, 1 mM EDTA, 20 mMCH3COOH) после окрашивания бромистым этидием (10 мг/мл) при постоянном напряжении 135В 40 минут. Результаты проанализированы под ультрафиолетовыми лучами в системе фотогельдокументации Quantum-ST4 (VilberLo-urmat, Франция).
ПЦР РВ проведена с набором для ПЦР в реальном времени с красителем ЯОХ (Синтол, Россия). Количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР РВ) для оценки экспрессии рецептора лептина проводилась в объеме 20 мкл и включила 1 мкл раствора кДНК, 1 ЕД ДНК-полимеразы, 1-кратный ПЦР-буфер (рН - 8,3), 2,5 мМ MgCl2, по 200 мкМ каждого из нуклео-тидтрифосфатов, 0,3 мкМ прямого и обратного праймеров. Реакция состояла из 40 циклов (денатурация: 15 секунд при 95°С; синтез: 55 при 60°С)( таблица 1).
Таблица 1. Температурный режим PCR-RT Table 1. Temperature range PCR-RT
Lid: 25.0 °С 4 steps scan °С m:s
1 95.0 05:00
Г 2 95.0 00:30
40х| 3 57.0 00:30
L 4 ♦ 72.0 00:30
25.0 °С 5
6
7
8
9
10
Дизайн праймеров осуществлен в программе Primer-BLAST. Праймеры, используемые в работе:
L1F - CTTCAGGCCCGAGAAACACAT
L1R - CATGGGCACAGCTGGAACAC
L2F - CCTGTCTGTCCTGTGTTCCAG
L2R - ACT GAT CCT GGT GAC AAT GGT T
Результаты исследований
С целью выявления наиболее информативных пар праймеров для оценки экспрессии рецептора гена лептина была поставлена ПЦР со следующими вариантами нуклеотидных последовательностей к разным участкам кДНК лептина (L1, L2 ДНК копии зрелой мРНК лептина фрагментов первого и второго экзонов):
L1F-L1R;
L1F-L2F;
L1F-L2R;
L1R-L2F;
L1R-L2R;
L2F-L2R.
(F-Forward primer - лидирующий прай-мер; R-Reverse primer - терминирующий прай-мер)
По результатам электрофоретического разделения продуктов амплификации были выявлены пары праймеров, которые являются наиболее информативными: L1F-L1R, L1F-L2R, L1R-L2F.
Основываясь на том, что для каждой реакции обратной транскрипции и ПЦР-РВ использовалась спектрофотометрически подтвержденная равная концентрация РНК и кДНК соответственно, мы предполагаем, что результаты ПЦР-РВ отражают уровень экспрессии зрелой матричной РНК рецептора гена лептина у кроликов.
В результате суммарно получены данные, свидетельствующие о том, что наибольший уровень экспрессии рецептора лептина наблюдается у молодых животных 3х недельного возраста, у других возрастных групп она относительно меньше (рис.1, 2).
Заключение
Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что уровень экспрессии рецептора лептина максимален у крольчат под самкой. В трехмесячном возрасте, когда крольчонок уже переведен на гранулированный корм, но еще не достиг физиологической зрелости, уровень экспрессии рецептора лептина снижается примерно вдвое. Наименьший уровень экспрессии отмечается у взрослых животных от 6 месяцев и старше. Выявленная закономерность является общим признаком для кроликов изучаемых пород, дифференциация по экспрессии рецептора гена лептина в одинаковых возрастных группах между мясо-шкурковыми и мясными породами не наблюдается.
Рисунок 1. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Розовая линия указывает на уровень экспрессии рецептора лептина у крольчонка 3 недельного возраста породы белый великан, самец (использовалась пара праймеровL1F-L1R). Ниже зеленым отмечен уровень экспрессии у кролика породы калифорнийская 3 месячного возраста (пара праймеровL1F-L1R). Остальные линии - образцы от кроликов породы белый великан, советская шиншилла и калифорнийская, по 1 самке и 1 самцу от каждой породы в возрасте 6 месяцев - 5 лет.
Figure 1. Real-time PCR. The pink line indicates the level of leptin receptor expression in a 3-week-old male white giant rabbit (primer pair L1F-L1R used). Below in green is the expression level in a 3-month-old Californian rabbit (primer pair L1F-L1R). The rest of the lines are samples from rabbits of the White Giant, Soviet Chinchilla and Californian breed, 1 female and 1 male from each breed at the age of 6 months - 5 years.
Список литературы
1. Wauters M., Considine R. V., van Gaal L. F. Human leptin: from an adipocyte hormone to an endocrine mediator // Eur. J. Endocrinol. 2000; 143, 293-311
2. Иевлева К.Д., Баирова Т.А., Рычкова Л.В., Ше-неман Е.А., Храмова Е.Е., Колесникова Л.И. Метаболизм и ожирение: вклад гена рецептора лептина // Acta Biomedica Scientifica. 2017. №5-1 (117). Ievleva K.D., Bairova T.A., Rych-kova L.V., Sheneman E.A., Khramova E.E., Ko-lesnikova L.I. Metabolism and obesity: the con-
tribution of the leptin receptor gene // Acta Biomedica Scientifica. https://doi.org/10.12737/ar-ticle_59e85cb55584e4.51145791 3. Чубенко Е.А., Беляева О.Д., Беркович О.А., Баранова Е.И. Лептин и метаболический синдром // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 2010. Т.96. №10. С.945-965. Chubenko E.A., Belyaeva O.D., Berkovich O.A., Baranova E.I. Leptin and metabolic syndrome // Russian Journal of Physiology named after I.M. Sechenov. 2010. Vol.96. No. 10. S.945-965.
2977,98
1935,49
493,58
509,71
486,24
3 нед
3 мес
6 мес
2 года
5 лет
Рисунок 2. ПЦР в реальном времени кДНК зрелой мРНК лептнна различных возрастных групп кролика.
Forward primer CTTCAGGCCCGAGAAACACAT Reverse primer CATGGGCACAGCTGGAACAC
Figure 2. Real-time PCR of cDNA of mature mRNA leptin of different age groups of the rabbit. Forward primer CTTCAGGCCCGAGAAACACAT Reverse primer CATGGGCACAGCTGGAACAC
4. Коваренко М.А., Руяткина Л.А., Петрищева М.С., Бодавели О.В. Лептин: физиологические и патологические аспекты действия // Вестник НГУ. Серия Биология, клиническая медицина. - 2003. - Т. 1, Вып. 1. - С. 59-74. Ko-varenko MA, Ruyatkina LA, Petrishcheva MS, Bodaveli OV. (2003). Leptin: physiological and pathological aspects [Leptin: fiziologicheskie i pa-tologicheskie aspekty deystviya] Vestnik Novosi-birskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya Biologiya, klinicheskaya meditsina, 1 (1), 59-74.
5. Sambrook J., Maniatis T. Molecular Cloning. A laboratory, Manual. 2nd Edition ed. Harbour: CSHL Press, 1989
KEY GENE EXPRESSION OF LIPID METABOLISM IN RABBITS OF VARIOUS SEXUAL AND AGE GROUPS
Expression of lipid metabolism in rabbits
E.S. Kolesnik*1, V.I. Glazko1, T.T. Glazko1, G.Yu. Kosovsky1
1FSBSI «Scientific Research Institute for Fur Animal Breeding and Rabbit Breeding n.a. V.A. Afanas'ev»
e-mail: niipzk@mail.ru
Abstract. Leptin, a key hormone of lipid metabolism in mammals, is a pleiotropic mediator in a wide range of neuroendocrine system functions. This study presents for the first time differences in the expression levels of the leptin gene receptor in meat rabbits and rabbits of the breed both for meat and fur. Experimental animals were of various sex and age groups. The main research method is real-time polymerase chain reaction.
To achieve this goal, the sequences of oligonucleotides were designed for the first time, the most informative of them are recommended for use in PCR-RT to study leptin receptor expression.
Keywords: leptin, expression, rabbit, PCR, expression of leptin, RNA
Expression of lipid metabolism in rabbits
37
