CC BY
74
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 1-2, стр 37-46 © 2004, СПбРОРААКИ
Оригинальные статьи
ЭКСПРЕССИЯ мРНК цитокинов В СЕЛЕЗЕНКЕ И СПИННОМ МОЗГЕ КРЫС С РАЗЛИЧНОЙ ТЯЖЕСТЬЮ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА
НИИэкагериментальпой медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия
Резюме. В патогенезе демиелинизирующих заболеваний - рассеянного склероза (PC) и экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) ключевую роль играют цитокины (TNFa, IL-lp, IL-10, IL-lra и др.), продуцируемые активированными иммунными и глиальными клетками. Однако роль периферического и центрального пулов цитокинов в формировании неврологических нарушений неизвестна. В данной работе исследована связь паттерна экспрессии мРНК цитокинов в селезенке и спинном мозге с выраженностью и длительностью неврологических нарушений у крыс при ЭАЭ, вызванном инокуляцией гомогената гомологичного спинного мозга в полном адъюванте Фрейнда. Тяжесть заболевания оценивали в баллах (от 0 до 6) по наличию у животных стойких парезов и параличей. Экспрессию мРНК, определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) в латентный период, на пике заболевания и в фазу выздоровления животных. Характер экспрессии мРНК цитокинов (TNFa, IL-ip, IL-lra) в селезенке был одинаков у животных с разной тяжестью заболевания, в то время как экспрессия мРНК этих цитокинов в ЦНС отличалась у крыс с различной интенсивностью и длительностью проявления клинических симптомов. У животных с легким течением заболевания экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов (TNFa и /или IL-1P) выявлялась только на пике заболевания (14 день), тогда как у тяжело болевших животных сохранялась до 33 дня. Экспрессия мРНК IL-10 в селезенке выявлялась уже на пике заболевания, но в спинном мозге определялась только в фазу выздоровления. Результаты исследования показывают различный паттерн экспрессии цитокинов в ЦНС и на периферии. Можно предположить, что периферический пул цитокинов определяет предрасположенность к запуску патологических процессов, а центральный пул участвует в развитии неврологических нарушений и предопределяет их длительность и тяжесть последствий.
Ключевые слова: цитокины, экспрессия мРНК, экспериментальный энцефаломиелит, ОТ-ПЦР, крысы.
Abdurasulova I.N., Zhytnukhin Yu.L., Tarasova ЕЛ., Klimenko V.M.
CYTOKINE mRNA EXPRESSION PATTERNS IN SPLEEN AND SPINAL COREL OF RATS WITH EXPERIMENTAL ALLERGIC ENCEPHALOMYELITIS
Abstract. The key role in pathogenesis of demyelinating diseases, such as multiple sclerosis (MS) and experimental allergic encephalomyelitis (EAE), is played by cytokines (TNFa, IL-ip, IL-10, IL-lra and oth.) produced by activated immune and glial cells. However, contributions of peripheral and central pools of cytokines to formation of neurological disorders are still unknown. This study is focused on the correlation between mRNA expression patterns in the spleen and spinal cord on the one hand, and intensity and length of EAE in rats on the other. EAE was induced by inoculation of homological spinal cord homogenate with complete Freund adjuvant.
Абдурасулова И.Н., Житнухин Ю.Л., Тарасова E.A., Клименко В.М.
Адрес для переписки:
Абдурасулова Ирина Николаевна, физиологический отдел им. И.П. Павлова НИИ экспериментальной медицины РАМН,
197376, С.-Петербург, ул. акад. Павлова, д.12.
Тел.: (812) 234-99-37, факс: (812) 234-93-26. E-mail: [email protected]
Intensity of the disorders in animals were rated against a ball scale (from 0 to 6) basing on severity of paresis and paralysis. mRNA expression was evaluated by reverse transcription technique followed by polymerase chain reaction during latent period, on the peak of the illness and at convalescence phase. Cytokine mRNA expression pattern (TNFa, IL-ip, IL-lra) in the spleen was not influenced by the severity of the disorder. At the same time, the patterns in CNS were different, de-
pending on intensity and length of the clinical symptoms suffered by animals. Animals with minor symptoms showed proinflammatory cytokine mRNA expression (TNFa and/or IL-lp) on the peak of the illness only, but those with severe forms had it till 33a day. IL- 10 mRNA expression in the spleen was discovered on the peak of the illness but in the spinal cord, it was registered only at convalescence phase. Thus, the results of the study point to different expression patterns of cytokines in CNS and on periphery. The character of this difference enables the assumption that peripheral cytokine pool determines predisposition to pathological process launch, and central pool is involved in neural disorder development and thus it influences the length and the severity of the illness. (Med.Immunol., 2004, vol.6, № 1-2, pp 37-46)
Введение
Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) у животных имеет сходные патогенетические механизмы с рассеянным склерозом (РС) человека, что позволяет широко использовать эту модель для изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС при развитии заболевания.
В запуске воспалительных и аутоиммунных реакций в ЦНС при РС и ЭАЭ основную роль играет популяция ТМ-клеток и продуцируемые ими про-воспалительные цитокины [30]. Многими исследованиями доказана патогенетическая роль ЮТа, 1Ь-1Э и других провоспал ительных цитокинов, продуцируемых активированными иммунными клетками в патогенезе аутоиммунных демиелинизирую-щих заболеваний мозга [9,19]. Однако при патологических процессах в ЦНС эти цитокины продуцируются непосредственно в нервной системе клетками микроглии, астроцитами, клетками эндотелия сосудов [17]. Цитокины, образовавшиеся за барьером, могут иметь иную функцию, чем в иммунной системе. Так показано, что ТОТа и 1Ь-1р могут оказывать нейропротективное действие, способствуя выживанию культивируемых нейронов [23].
Увеличение активности ЮТа обнаруживается у людей во время обострения болезни [27, 33], при этом наблюдается взаимосвязь между уровнем сек-ретируемого ТОТа и активностью патологического процесса при РС [15] и ЭАЭ [3].
В период повышения активности ТЫРа отмечается нарушение микроциркуляции в зоне воспаления [37] и увеличение проницаемости ГЭБ [46], что является ключевым событием в запуске воспалительного процесса в мозге. Кроме того, ТЫБа цито-токсичен для олигодендроцитов и способствует деструкции миелина [16,44].
Патогенетическая роль ТЫРа при ЭАЭ показана неоднократно. Блокада действия эндогенного ТГ^Рсе при развитии ЭАЭ оказывала протективный эффект [1,45], тогда как введение экзогенного ТОТа в фазу ремиссии вызывало у крыс рецидивы заболевания [9].
Однако экспрессия ТИРа не является обязательным компонентом развития неврологического дефицита, так как у мышей при отсутствии гена ТИР наблюдалась только отсрочка развития симптомов заболевания [24]. В отсутствии ТОТа заболевание может быть индуцировано другими провоспали-
тельными цитокинами, в частности 1Ь-1р, поскольку многие эффекты введения этих цитокинов идентичны. Было показано, что экзогенный П.-1Р усиливает ЭАЭ, вызванный введением энцефалитогенной смеси, либо переносом Т-клеток, сенсибилизированных к мозговым антигенам [28]. Наблюдается потенцирование действия 1Ь-1р и ТОТа или синергизм между молекулами, в частности, повышение проницаемости ГЭБ для белков плазмы и форменных элементов крови [8], цитотоксического действия на культуру нервных клеток [7].
Противовоспалительные цитокины (1Ь-10, 1Ь-1 га и др.), подавляя экспрессию провоспалительных цитокинов или конкурируя с ними за рецепторы, ингибируют аутоиммунные процессы в ЦНС. Неоднократно показано, что введение 111-10 предотвращает развитие ЭАЭ или смягчает его течение [10, 41,50]. С действием эндогенного 11.-10 большинство авторов связывает спонтанное выздоровление животных при ЭАЭ, поскольку при отсутствии гена 1Ь-10 мыши болеют без ремиссий, а трансгенные (с повышенной продукцией) животные оказываются невосприимчивыми к индукции ЭАЭ [6,42]. Показано также протективное действие экзогенного рецепторного антагониста 11,-1 в процессе развития ЭАЭ [5, 29].
Существует немного данных об экспрессии мРНК цитокинов в иммунных клетках [35], а данные о паттерне экспрессии про- и противовоспалительных цитокинов в спинном мозге животных при ЭАЭ неоднозначны. Показано повышение экспрессии провоспалительных цитокинов на пике клинических проявлений ЭАЭ, а противовоспалительных цитокинов в период выздоровления животных [18]. Однако Jander с соавторами [20] выявили экспрессию 1Ь-10 уже на пике заболевания, одновременно с провоспалительными цитокинами. Отмечено увеличение уровня ТЫРа в доклинический период [48]. Кроме того, отсутствуют данные о зависимости выраженности неврологических нарушений от характера экспрессии различных цитокинов в ЦНС и сопоставление паттерна экспрессии центрального и периферического пула цитокинов. В этой связи целью настоящей работы явилось исследование связи паттерна экспрессируемых цитокинов в ЦНС и иммунной системе с выраженностью неврологических нарушений у крыс при ЭАЭ, индуцированном го-могенатом мозговой ткани.
Материалы и методы
Животные и индукция ЭАЭ
Самок крыс Вистар (питомник Рапполово) весом 170-190 г содержали в общих клетках при стандартном режиме освещения и питания. ЭАЭ вызывали однократной инокуляцией энцефалитогенной смеси (ЭГС) из расчета 100 мг гомогената гомологичного спинного мозга; 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда (содержание убитых микобактерий 5 мг/ мл) (ПАФ) и 0,2 мл физиологического раствора на одно животное. ЭГС вводили подкожно (в основание хвоста) под легким эфирным наркозом в общем объеме 0,4 мл. Регистрировали время начала заболевания, его продолжительность и тяжесть, которую оценивали в баллах по наличию у животных мышечной слабости, тремора (0,5 балла), стойких парезов (1 балл) и параличей (1,5 балла). При поражении нескольких конечностей баллы суммировались для расчета клинического индекса (КИ). Отсутствие видимых клинических проявлений оценивалось как КИ =0, летальный исход - КИ = 6. За КИ принимали наибольший, независимо от дня заболевания. Животных с КИ = 0,5-3,0 считали легко болеющими, животных с КИ = 4,5-6,0 - тяжело болеющими.
Определение экспрессии мРНК цитокинов
Экспрессию мРНКТЫРа, 1Ь-1р, 1Ь-10 и 1Ь-1га. в селезенках и спинном мозге животных определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Забор материала проводили на 7 сутки после инокуляции гомогената мозга (латентный период), 14 сутки (пик
Табл.1. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПРАЙМЕРОВ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР
заболевания у большинства животных), 33 сутки (фаза выздоровления у большинства животных). Животных декапитировали, в течение 3 минут выделяли поясничный отдел спинного мозга, немедленно замораживали материал в жидком азоте и хранили при температуре -70°С до выделения мРНК.
Тотальную мРНК выделяли в соответствии со стандартным протоколом [43] с использованием гуанидина тиоционата («Ргоп^а», США).
Для проведения обратной транскрипции использовали 1 мкл затравочных олиго-с!Т-праймеров («Рготе§а», США), нуклеотидтрифосфаты (до конечной концентрации 1, 25 мМ каждого) («Силекс М», Москва), 0,5 мкл ингибитора рибонуклеаз («Ргоп^а», США), 1 мкл обратной транскриптазы М-МЬУ («Ргоп^а», США). Пробу добавляли в объеме из расчета 2 мкг на реакцию. Общий объем реакционной смеси доводился до 20 мкл деионизированной водой.
Для проведения ПЦР по 2 мкл продуктов ОТ-реакции добавляли в реакционную смесь, содержавшую: 2,5 мкл 10-кратного буфера, нуклеотидтрифосфаты до конечной концентрации в растворе 0,8 мМ каждого, специфический праймер (+) 25 пкМ, специфический праймер (-) 25 пкМ, 1 мкл Тац ОЫА полимеразы, MgCl2 - концентрацию подбирали для каждой пары праймеров отдельно (см. табл. 1). Конечный объем доводился до 25 мкл деионизированной водой. ПЦР проводились в амплификаторе фирмы «ТесЬпе» (Великобритания) при термальном профиле: 94°С/1 мин; при температуре отжига/ 1 мин (см. табл. 1 - подбиралась предварительно для
Праймер Последовательность Позиция на ядерной ДНК (Ьр) Т(»С) отжига [МдСЫ (мкл) Количество циклов ПЦР
11.-1 р + праймер 5'с(сса1дадсШд1асаадд 3‘ 539-559 57,3 8 30
- праймер З'ддддПдао^дОдЮд! 5' 764-783
ТЫ Ра + праймер 5'Псссааа(дддс(ссс1сЗ' 1495-1513 56,9 2 32
- праймер З'йИдадс^айдПсддб' 1707-1725
1Ыга + праймер 5'1ддссассс(дс(дддааааЗ' 75-94 63,4 6 30
- праймер З’адОддсдаддс^дЮсдб’ 377-396
11.-10 +праймер 5‘адссадасссаса(дс1ссдЗ' 151-170* 64,1 6 31
- праймер З'аддаасдНдк^адЮдсдб1 1077-1096*
р-актин + праймер 5'даада1сс(дассдадсд(дЗ' 2362-2381 59 2 30
- праймер 3'дада1асддКд(д1сасда5' 2757-2776
Примечание. * - позиция на матричной ДНК; Ьр - нуклеотидные пары.
каждой пары праймеров); при температуре +72° С/ 1,2 мин.
Специфические праймеры подбирались с помощью программы «Primer - Master 1.0> по нуклеотидным последовательностям соответствующих мРНК и ДНК крыс, полученным из Европейского молекулярного банка данных. Последовательности праймеров и условия проведения ПЦР (концентрация ионов магния и количество циклов проведения реакции) представлены в таблице 1. В качестве внутреннего стандарта для оценки прохождения реакции обратной транскрипции использовали мРНК р-актина.
Анализ ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием для визуализации мРНК. Фотографирование гелей производили цифровым фотоаппаратом «Canon* (Power Shot S30) в проходящем УФ-свете на трансиллюминаторе «Vilber Lourmat> (Франция).
Результаты
Введение гомогената гомологичного спинного мозга вызывало развитие монофазиого ЭАЭ у 90,7% самок крыс Вистар. Легкое течение заболевания (КИ - 0,5-3,0) наблюдалось у 59,3 % крыс. Более тяжелые неврологические расстройства (КИ - 4,5-6,0) отмечались у 40,7 % животных, причем у 14,8 % заболевание окончилось летально. Клинические симптомы ЭАЭ у крыс появлялись через 8,1 ±0,9 суток, заболевание в среднем продолжалось 21,4±1,8 суток, после чего у большинства животных наступало спонтанное выздоровление. Неврологические проявления сопровождались снижением веса тела, которое было наиболее выражено на пике заболевания у животных с тяжелой симптоматикой. Ранее нами показано наличие у животных гистологических признаков ЭАЭ [2].
интактные
7 сутки
14 сутки TNFct
33 сутки
IL-1 га
М 1 2 3 4
КИ максимальный КИца момент обследования
----- 83 Ьр
____ 244 Ьр
302 Ьр
900 Ьр
____ 327 Ьр
7 М 8 9 14 17 18 20 23 25 0 0 3 5,5 0 2 4,5 5,5
(0) (0) (0,5) (1,5)
Рис.1. Экспрессия мРНК цитокинов в селезенке крыс в процессе развития ЭАЭ.
М - маркер молекулярного веса;
Ьр - пар нуклеотидов;
1 -4 - интактные животные;
5-7 - животные без симптомов заболевания в индуктивную фазу;
8,9,18 - не заболевшие животные (КИ=0);
14 - легко болевшее животное в период пика заболевания (КИ=3);
17 - тяжело болевшее животе в период пика заболевания (КИ=5,5);
20 - легко болевшее животное (КИ=2), выздоровевшее к 33 суткам;
23-25 - тяжело болевшие животные (КИ=4,5-5,5) о остаточными нарушениями (КИ=0,5-1,5) на 33 сутки
Экспрессия мРНК цитокинов при развитии ЭАЭ
Анализ экспрессии мРНК цитокинов в клетках иммунной системы не выявил различий в экспрессии мРНК1Ь-1Р и 1Ь-1гау крыс с индуцированным ЭАЭ и у интактных животных (рис.1). Однако в процессе развития ЭАЭ мы наблюдали некоторое усиление экспрессии мРНК ТОТа. Следует также отметить, что среди интактных были животные с высоким и низким уровнем экспрессии мРНК ТЫРа, при этом экспрессия мРНК 1Ь-10 не выявлялась, а экспрессия мРНК 1Ь-1р и 1Ь-1га была сопоставимой. У животных с разной выраженностью неврологических нарушений и без видимых клинических проявлений ЭАЭ в селезенке наблюдался сходный паттерн экспрессии всех исследованных цитокинов. Экспрессия мРНК 1Ь-10 выявлялась на 14 сутки у отдельных животных (больных и не больных).
В ЦНС отмечались различные паттерны экспрессии мРНК про- и противовоспалительных цитокинов в зависимости от тяжести заболевания животных (рис.2). Важно отметить, что единственным цитокином, выявленным в спинном мозге интактных, крыс был 1Ь-1га. Кроме того, только экспрессия мРНК 1Ь-1га наблюдалась у всех инокулирован-ных животных на 7сутки (латентный период).
При развитии заболевания паттерн экспрессии мРНК цитокинов в спинном мозге отличался у крыс с разной выраженностью заболевания. Так, у животных без видимых неврологических нарушений экспрессия мРНК исследованных цитокинов не выявлялась ни на одном из исследованных сроков. У крыс с легкими клиническими симптомами на пике заболевания (14 сутки) определялась экспрессия мРНК только одного провоспалительного цитокина (ТОТа или 1Ь-1|3), при выздоровлении
7 сутки
14 сутки
33 сутки
— 83 Ьр
,244 Ьр
— 302 Ьр
900 Ьр
327 Ьр
11 12 13 14 15 16 17 М 1,5 2 2 3 4,5 4,5 5,5
М 1 2 3
КИ максимальный КИна момент обследования
Рис.2. Экспрессия мРНК цитокинов в спинном мозге крыс в процессе развития ЭАЭ.
М - маркер молекулярного веса;
Ьр - пар нуклеотидов;
1 -4 - интактные животные;
5-7 - животные без симптомов заболевания в индуктивную фазу;
8,9,10,18,19 - не заболевшие животные (КИ=0);
11-14- легко болевшие животные в период пика заболевания (КИ=1,5-3);
15-17 - тяжело болевшие животные в период пика заболевания (КИ=4,5-5,5);
20,21 - легко болевшие животные (КИ=2-3), выздоровевшие к 33 суткам;
22-25 - тяжело болевшие животные (КИ=4,5-5,5) с остаточными нарушениями (КИ=0,5-1,5) на 33 сутки
20 21 22 23 24 25 2 3 4,5 4,5 5 5,5 (0) (0) (0,5) (0,5) (1,5) (1,5)
(33 сутки) у таких животных экспрессия мРНК ци-токинов не определялась. У тяжело болевших животных наличие неврологических нарушений сочеталось с экспрессией мРНК обоих провоспалитель-ных цитокинов (ТЫБа и Ц.-1Р), а также противовоспалительного цитокина (1Ь-1га). На 33 сутки у этих животных все еще сохранялась экспрессия одного из провоспалительных цитокинов параллельно с экспрессией мРНК 1Ь-10 или 1Ь-1га. Причем выявлялась определенная закономерность: у животных с экспрессией мРНК 1Ь-1га отсутствовала экспрессия мРНК 1Ь1Р, а у животных с экспрессией 1Ь-10 отсутствовала экспрессия мРНК ТЫБа Кроме того, более выраженная симптоматика у крыс (КИ-5,0-5,5) отмечалась при наличии мРНК ЮТа, тогда как в присутствии мРНК 1Ь-1р в ЦНС наблюдались умеренные симптомы болезни (КИ-3,0-4,5).
Обсуждение
Полученные нами данные указывают на то, что цитокины, присутствующие в ЦНС, могут участвовать в формировании неврологических нарушений при ЭАЭ. Об этом свидетельствует различный паттерн экспрессии мРНК цитокинов в ЦНС у легко и тяжело болеющих животных при отсутствии различий в экспрессии мРНК цитокинов на периферии (в селезенке) у животных с индуцированным ЭАЭ и у интактных животных.
Выявленная нами в селезенке интактных животных мРНК ЮТа, 1Ь-1Р и 1Ь-1га свидетельствует о наличии базовой экспрессии этих цитокинов. Это согласуется с имеющимися в литературе немногочисленными данными. Так, в селезенке показана экспрессия мРНК ЮТа у свиней [32], 1Ь-1р - у мышей, крыс, свиней [22,25, 32], 1Ь-1га - у мышей [14].
Наличие разного базового уровня экспрессии мРНК ТЩ^а в селезенке может отражать выявленный нами ранее [3] различный базовый уровень циркулирующего в крови 1№а, причем у впоследствии заболевших животных исходный уровень ТОТа был выше, чем у не заболевших.
Нам удалось обнаружить в селезенке крыс незначительную динамику экспрессии только мРНК Т^а в процессе развития ЭАЭ, хотя Окис]а с соавторами [35] показано повышение уровня мРНК 1Ь-1р, ТОТаи р, 1Ь-10 в преклиническую и/или активную фазу, со снижением их в стадию выздоровления в лимфатических узлах, селезенке и моно-нуклеарных клетках периферической крови мышей. Это может быть связано как с применением разных методов, так и с видовым различием животных.
В литературе имеются единичные работы о базовой продукции цитокинов в ЦНС, в основном ис-
следуются П--1Р и 1Ь-1га, причем их экспрессия либо не выявляется, либо определяется на очень низком уровне [14]. О базовой продукции ТОТа в ЦНС сведений нет. В норме у взрослых животных также не выявлена экспрессия мРНК 1Ь-10, но обнаружена у новорожденных [26].
Отсутствие базовой экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов в ЦНС и ее выявление у заболевших животных позволяет предположить, что центральный пул цитокинов ответственен за развитие клинических проявлений. Используя модели монофазного и рецидивирующего ЭАЭ, Окис1а с соавторами [36] показали, что паттерн экспрессии цитокинов в ЦНС может влиять на тип заболевания.
Наличие экспрессии мРНК ТЫРа и/или 1Ь-1р в спинном мозге животных с легкими или тяжелыми неврологическими проявлениями указывает на то, что каждый из цитокинов способен запускать в ЦНС патологические процессы, приводящие в конечном счете к неврологическому дефициту. Однако их комплексное действие оказывается наиболее сильным, поскольку у тяжело болеющих животных наблюдается присутствие обоих цитокинов в спинном мозге. СЬао с соавторами [7] показали, что добавление в культуру клеток ТОТа или 1Ь-1Р не оказывало цитотоксического действия, однако при их совместном применении наблюдалась массовая гибель клеток.
Нам не удалось выявить экспрессию мРНК ЮТа в латентный период, хотя наличие экспрессии ТЫБа в спинном мозге до появления клинических симптомов показано [48]. Присутствие мРНК ЮТа у животных только при наличии клинических симптомов согласуется с патогенетической ролью этого цитокина. Однако обнаружение экспрессии ТИБа в нейронах через 30 и даже 40 дней после выздоровления животных [49] может указывать и на иную роль ТОРа в ЦНС. В литературе имеется немало сведений о нейропротективном действии ТОТа и об участии его в репарации поврежденных тканей в ЦНС [23,34]. Показано, что ТЫРа быстро продуцируется в мозге в ответ на повышение нейрональной активности и тканевое повреждение, защищая нейроны от эксайтотоксичности через активацию транскрипционного фактора ОТ-кВ [13]. По-видимому, роль этого цитокина (патологическая или защитная) определяется как концентрацией, так и теми путями сигнальной трансдукции, которые запускаются в клетке: ОТ-кВ-зависимый, ведущий к выживанию клетки, или РАОБ-зависимый, ведущий к апоптозу [12].
Ключевая роль П^РШ (р55) сигнального пути в контроле воспаления и демиелинизации в ЦНС выявлена при использовании нокаутных и трансгенных по гену ТЫ Б или его рецепторов мышей. Показано, что при длительной активации ТЫРа рецеп-
тора I типа (р55 или ТОТШ), опосредующего биологическое действие ТОТа, при действии провос-палительиых цитокинов (1Ь-1а, И-6 и №N7) может инициироваться постоянный иммунный ответ, вызывающий демиелинизирующее воспаление [4]. Следует отметить, что у мышей с различной восприимчивостью к ЭАЭ (ВАЬВ/с и не наблюда-
лось отличий в уровне экспрессии мРНК рецепторов ТОТ, индуцированном цитокинами. Однако блокирование р55 рецептора ТОТ подавляло про-воспалительную активность ТИР при аутоиммунных демиелинизирующих заболеваниях, что доказывает участие этого рецептора в развитии острой фазы заболевания [23].
Нокаутные мыши по генам обоих рецепторов ТИР р55/р75(-/-) были резистентны к развитию заболевания, как и мыши с отсутствием гена только р55 рецептора ТОТ, при этом у животных отмечалась сниженная продукция ТЫ цитокинов. Напротив, у мышей, дефицитных по гену рецептора ТИР р75(-/-), отмечалось тяжелое течение ЭАЭ, сопровождавшееся повышенной продукцией ТЫ цитокинов. Таким образом, р55 рецептор ТОТ требуется для инициации заболевания, тогда как р75 - участвует в регуляции иммунного ответа [47].
Рецепторный антагонист Н_-1 является естественным регулятором активности 1Ь-1р, конкурируя с ним за рецепторы, по-видимому, с этим связано наличие базовой экспрессии мРНК 1Ь-1 га в ЦНС. Смещение баланса 1Ь-1р/1Ь-1га в сторону 1Ь-1(3 приводит к запуску воспалительных процессов, из чего следует, что соотношение этих цитокинов, а не количество каждого из них, может определять риск развития и прогрессирования заболевания [21].
Сохранение экспрессии мРНК 1Ь-1га у животных с индуцированным ЭАЭ в доклинический период можно объяснить тем, что смещения равновесия в сторону 1Ь-1Р еще не произошло и воспалительный процесс еще не развился в ЦНС. Возможно, что это происходит накануне появления клинических симптомов, поскольку у не болеющих животных, исследованных в этот период (8-9 сутки), экспрессия мРНК 1Ь-1га уже не выявляется (данные не представлены).
Помимо того, что 1Ь-1(3 способен запускать патологические процессы в ЦНС, показано его участие в репаративных процессах [31], а также в регуляции нейрональных и нейроэндокринных функций [40]. Многообразие биологических свойств 1Ь-1|3 может объясняться тем, что активность его связана с различными системами вторичных мессенджеров (в частности, протеинкиназой С, циклическим АМФ, протеинкиназой А, а также 1Ь-1-ассоцииро-ванной киназой), которые запускают разные пути сигнальной трансдукции [39].
Выявление в селезенке экспрессии мРНК 11.-10 у отдельных животных на 14 сутки соответствует
максимуму его концентрации в крови, обнаруженному нами ранее [2]. Было показано, что только у легко болеющих животных отмечается увеличение продукции IЬ-10 в этот период, тогда как у тяжело болеющих крыс такой реакции не наблюдалось. Аналогичные данные получены в клинике и при более тяжелых формах рассеянного склероза, в стимули-роваиных лимфоцитах больных отмечался более низкий уровень 1Ь-10 [38].
Вероятно, этот дефицит наблюдается и в ЦНС, поскольку у наиболее тяжело болеющих животных нам не удалось обнаружить экспрессии этого цито-кина в спинном мозге. Экспрессия мРНК 1Ь-10 появляется в ЦНС позже, чем в иммунных клетках, лишь в период выздоровления (33 сутки) и только у животных с менее выраженными клиническими симптомами. Э1аЬ с соавторами [11] показали, что при рецидивирующем ЭАЭ у крыс экспрессия мРНК 1Ь-10 в период ремиссии снижена, по сравнению с монофазным ЭАЭ, что, по мнению авторов, и определяет возникновение рецидивов. Следовательно, повышение продукции 1Ь-10 может быть одним из основных адаптационных механизмов, способствующих выходу из обострения и стабилизации течения заболевания.
Таким образом, с изменением баланса в сторону провоспалительных цитокинов связано развитие клинических проявлений у животных. Причем, рано появляющиеся (8-9 сутки) и быстро проходящие (к 14-17 суткам) симптомы заболевания у легко болеющих животных, вероятно, обусловлены развитием локальных отеков и воспалительных реакций в ЦНС, инициированных провоспалительными цитокинами (ТОТа или 1Ь-1|3). В формировании длительно сохраняющихся неврологических нарушений (до 33 суток и более) принимают участие несколько цитокинов, которые, потенцируя продукцию и действие друг друга, дольше сохраняются в циркуляции. Постоянное присутствие цитокинов поддерживает хронический воспалительный процесс в ЦНС, сопровождающийся демиелинизацией, а в ряде случаев и гибелью нейронов. Этому способствует недостаточность супрессорного звена иммунитета, которая имеется как на периферии, так и в ЦНС.
Работа выполнена при поддержке РФФИ. Гранты №02-04-49595, №03-04-06944
Список литературы
1. Житнухин Ю.Л., Никитина Е.Ю., Фрейдлин И.С. Развитие активно индуцированного экспериментального аллергического энцефаломиелита в условиях введения пентоксифиллина // В: Нейроиммунология, нейроинфекции, демиелинизация.-СПб. Лики Росси,- 1997.-С. 22-25.
2. Житнухин Ю.Л., Никитина Е.Ю., Абдурасу-лова И.Н., Карпишева К.В., Фрейдлин И.С. Изменение уровней циркулирующего фактора некроза опухолей-альфа и интерлейкина-10 при индукции экспериментального аллергического энцефаломиелита Ц Рассеянный склероз: основы здоровья,- СПб: Лики России, 1999,- С. 18-21.
3. Житнухин Ю.Л., Малышкин К.А., Абдурасу-лова И.Н., Новикова Т.А., Фрейдлин И.С. Динамика сывороточного фактора некроза опухолей-альфа в процессе развития экспериментального аллергического энцефаломиелита у крыс разных линий // Рассеянный склероз: лечение и оздоровление.- СПб: Лики России, 2000,- С. 36-39.
4. Aranguez I., Torres С., Rubio N. The receptor for tumor necrosis factor on murine astrocytes: characterization, intracellular degradation, and regulation by cytokines and Theiler’s murine encephalomyelitis virus // Glia.- 1995.- Vol. 13,- P. 185-94.
5. Badovinac V., Mostarica-Stujkuvle М., Dinarel-lo C., Stosle-Grujlcic S. Interleukin-1 receptor antagonist suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in rats by influencing the activation and proliferation of encefalitogenic cells //J. Neuroimmu-nol.- 1998.- Vol. 85,- P. 87-95.
6. Bettelli E., Das M.P., Howard E.D., Weiner H.L., Sobel R.A., Kuchroo V.K. IL-10 is critical in the regulation of autoimmune encephalomyelitis as demonstrated by studies of IL-10 and IL-4 deficient and transgenic mice //J. Immunol.-1998.- Vol. 161.- P. 3299-3306.
7. Chao C.C., Hu S., Ehrlich L., Peterson P.K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-а synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methil-D-aspartate receptors // Brain, Behav. and Immun.- 1995,- Vol. 9.- P. 355-365.
8. Claudio L„ Martiney J.A., Brosnan C.F. Ultra-structural studies of the blood-retina barrier after exposure to interleukin-1 beta or tumor necrosis factor-alpha// Lab. Invest.- 1994.-Vol. 70,- P. 850-861.
9. Crisi G.M., Santambrogio L., Hochwald G.M., Smith S.R., Carlino J.A., Thorbecke G.J. Staphylococcal enterotoxin В and tumor-necrosis factor-alfa- induced relapses of experimental allergic encephalomyelitis: protection by transforming growth factor- beta and interleukin-10//Eur.J. Immunol.-1995.- Vol. 25.-P. 3035-3040.
10. Cua D.J., Herve G., Hinton D.R., Stohlman S.A., Coffman R.L. Transgenic interleukin 10 prevents Induction of experimental allergic encephalomyelitis // J. Exp. Med.- 1999.- Vol. 189,- P. 1005-1010.
11. Diab A., Zhu J., Xiao B. G., Mustafa M„ Link H. High IL-6 and IL-10 in the central nervous system are associated with protracted relapsing EAE in DA rats //J. Neuropatol. and Exp. Neurol.- 1997,- Vol. 56.- P. 641-651.
12. Duckett C.S. Apoptosis and NF-kB: the FAAD connection//J. Clin. Invest.- 2002,- Vol. 109.- P. 579-580.
13. Furukawa K.& Mattson M.P. The transcription factor NF-kappaB mediates increases in calcium currents and decreases in NMDA- and AMPA/kainate-induced currents induced by tumor necrosis factor-al-pha in hippocampal neurons //J Neurochem.- 1998.-Vol. 70.- P. 1876-1886.
14. Gabellec M.M., Griffais R., Fillion G., Haour F. Expression of interleukin 1 beta and interleukin receptor antagonist mRNA in mouse brain: regulation by li-popolysaccharide (LPS) treatment // Brain Res. Mol. Brain Res.- 1995,- Vol. 31.- P. 122-130.
15. Hauser S.L., Doolittle T.H., Lincoln R., Brown R.H., Dinarello C.A. Cytokine accumulations in CSF of multiple sclerosis patients: frequent detection of IL-1 and tumor necrosis factor but not IL-6 // Neurol.-1990.- Vol.40.- P. 1735-1739.
16. Hisahara S., Takano R„ Shoji S., Okano H., Mi-ura M. Role of caspase-1 subfamily in cytotoxic cytokine-induced oligodendrocyte cell death // J. Neural. Transm. Suppl.- 2000,- Vol. 58.- P. 135-142.
17. Hopkins S.J. & Rothwell N.J. Cytokines and the nervous system: expression and recognition // Trends Neurosci.- 1995,- Vol. 18,- P. 83-88.
18. Issazadeh S., Lorentzen J.C., Mustafa M., Hoje-berg B., Mussener A„ Olsson T. Cytokines in relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis in DA rats: persistent mRNA expression of proinflammatory cytokines and absent expression of interleukin-10 and transforming growth factor-beta //J. Neuroimmunol.-1996,-Vol. 69,- P. 103-115.
19. Jacobs C.A., Baker P.E., Roux E.R., Picha K.S., Toivola B., Waugh S., Kennedy M.K. Experimental autoimmune encephalomyelitis is exacerbated by IL-la and suppressed by soluble IL-1 receptor //J. Immunol.- 1991,- Vol. 146,- P. 2983-2989.
20. Jander S., Pohl J., D’Urso D., Gillen C., Stoll G. Time course and cellular localization of interleukin-10 nRNA and protein expression in autoimmune inflammation of the rat central nervous system // Am. J. Pathol.- 1998,- Vol. 152,- P. 975-982.
21. Jong B.A., Huizinga T.W.J., Bollen E.L.E.M., Uitdehaag B.M.J., Bosma G.P.T., van Buchem M.A., Remarque E.J., Burgmans A.C.S., Kalkers N.F., Polman C.H., Westendorp R.G.J. Production of IL-1(3 and IL-lra as risk factors for susceptibility and progression of relapse-onset multiple sclerosis // J. Neuroimmunol.-2002.- Vol. 126.-P. 172-179.
22. Jung B.D., Kimura K., Kitamura H„ Makondo K., Kanehira K., Saito M. Sympathetic activation of hepatic and splenic IL-ip mRNA expression during oscillation stress in the rat//J. Vet. Med. Sci.- 2000.- Vol. 62,- P. 409-413.
23. Kassiotis G. & Kollias G. Uncoupling the proinflammatory from the immunosuppressive properties of tumor necrosis factor (TNF) at the p55 TOF receptor level: implications for pathogenesis and therapy of autoimmune demyelination //J. Exp. Med.- 2001.- Vol. 193,- P. 427-434.
24. KOrner H„ Riminton D.S., Strickland D.H., Lem-ckert F.A., Pollard J.D., Sedgwick J.D. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting //J. Exp. Med.- 1997,-Vol. 186,- P. 1585-1590.
25. Levin D. & Gershon H. IL-1 secretion and membrane IL-1 expression by neonatal spleen cells during soluble antigen presentation // Cell Immunol.- 1988.-Vol. 116,- P. 382-391.
26. Lovett-Racke A.E., Smith M.E., Arredondo L.R., Bittner P.S., Ratts R.B., Shive C.L., Forsthuber T.S., Racke M.K.Developmentally regulated gene expression of Th2 cytokine in the brain // Brain Res.- 2000,- Vol. 870,- P. 27-35.
27. Maimone D., Gregory S., Arnason B.G.W., Re-der A.T. Cytokine levels in the cerebrospinal and serum of patients with MS //J. Immunol.- 1991.- Vol. 32,- P. 67-74.
28. Mannie M.D., Dinarello C.A., Paterson P.Y. Interleukin 1 and myelin basic protein synergistically augment adoptive transfer activity of lymphocytes mediating experimental autoimmune encephalomyelitis in Lewis rats //J. Immunol.- 1987,- Vol. 138,- P. 4229-4235.
29. Martin D. & Near S.L. Protective effect of the IL-1 receptor antagonist (IL-lra) on experimental allergic encephalomyelitis in rats //J. Neuroimmunol.-1995.- Vol. 61.- P. 241-245.
30. Martin R., McFarland H.F. Immunological aspects of experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis // Crit. Rev. Clin. Lab. Sci.-1995,-Vol. 32,- P. 121-182.
31. Mason J.L., Suzuki K., Chaplin D.D., Matsushima G.K. Interleukin-1 beta promotes repair of the CNS //J. Neurosci.- 2001.- Vol. 21.- P. 7046-7052.
32. Mikami 0., Muneta Y., Mori Y., Yokomizo Y., Nakajima Y. Expression of proinflammatory cytokine mRNA in the lymphatic organs of adult and neonatal pigs //Vet. Immunol. Immunopathol.- 2002.- Vol. 90.-P. 203-207.
33. Mikova O., Yakimova R., Bosmans E., Kenis G„ Maes M. Increased serum tumor necrosis factor alpha concentration in major depression and multiple sclerosis // Eur. Neuropsycho-pharmacol.- 2001.- Vol. 11.-P. 203-208.
34. Muhallab S., Lundberg C., Gielen A.W., Lidman O., Svenningsson A., Piehl F., Olsson T. Differential expression of neurotrophic factors and inflammatory cytokines by myelin basic protein-specific and other recruited T cells infiltrating the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis // Scand. J. Immunol.- 2002.- Vol. 55.- P. 264-273.
35. Okuda Y., Sacoda S., Yanagihara T. The pattern of cytokine gene expression in lymphoid organs and peripheral blood mononuclear cells of mice with experimental allergic encephalomyelitis // J. Neuroimmu-nol.- 1998a.- Vol. 87,- P. 147-155.
36. Okuda Y„ Sacoda S., Bernard C.C., Yanagihara T. The development of autoimmune encephalomyelitis provoked by myelin oligodendrocyte glycoprotein is associated with an upregulation of both proinflammatory and immunoregulatory cytokines in the central nervous system //J. Int. Cytokine Res.- 1998b.- Vol.
18,-P. 415-421.
37. Pan W. & Kastin AJ. Upregulation of the transport system for TNFalpha at the blood-brain barrier // Arch. Physiol. Biochem.- 2001.- Vol. 109,- P. 350-335.
38. Petereit H.F., Pukrop R., Fazekas F„ Bambor-schke S.U., Rupele S., Kulmel H.W., Merkelbach S., Japp G., Jongen P.J.H., Hartung H.P., Hommes O.R. Low interleukin-10 production is associated with higher disability and MRI lesion load in secondary progressive multiple sclerosis // J. Neurol. Sci.- 2003.- Vol. 206,- P. 209-214.
39. Pita I., Jelaso A.M., Ide C.F. IL-lp increases intracellular calcium through an IL-1 type 1 receptor mediated mechanism in C6 astrocytic cells // Int. J. Devi. Neurosci.- 1999,- Vol. 17.- P. 813-820.
40. Raber J., Sorg O., Horn T.F.W., Yu N.. Koob N.Y., Campbell I.L., Bloom F.E. Inflammatory cytokines: putative regulators of neuronal and neuro-endo-crine function // Brain Res. Rev.- 1998.- Vol. 26,- P. 320-326.
41. Rott O., Fleischer B„ Cash E. Interleukin-10 prevents experimental allergic encephalomyelitis in rats // Eur. J. Immunol.- 1994,- Vol. 24,- P. 1434-1440.
42. Samoilova E.B., Horton J.L., Chen Y. Acceleration of experimental autoimmune encephalomyelitis in interleukin-10-deficient mice: roles of interleukin-10 in disease progression and recovery // Cell. Immunol.-1998,-Vol. 188.- P. 118-124.
43. Sambrook J., Fritsch .F„ Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual.- 1989.- Gold Spring Harbor Laboratory Press.- 2 Ed.- Vol. 2,- P. 14.18-14.19.
44. Selmaj K. & Raine C.S. Tumor necrosis factor mediates myelin and oligodendrocyte damage in vitro // Ann. Neurol.- 1988,- Vol. 21.- P. 339-346.
45. Selmaj K. & Raine C.S, Experimental autoimmune encephalomyelitis: immunotherapy with anti-tumor necrosis factor antibodies and soluble tumor necrosis factor receptor //Neurology.- 1995.- Vol. 45,- P. 44-49.
46. Sharief M.K. & Thompson E.J. In vivo relationship of tumor necrosis factor-а to blood-brain barrier damage in patients with active multiple sclerosis //J. Neuroimmunol.-1992.-Vol. 38.- P. 27-33.
47. Suvannavejh G.C., Lee H.O., Padilla J., Dal Canto M.C., Barrett T.A., Miller S.D. Divergent roles for p55 and p75 tumor necrosis factor receptors in the pathogenesis of MOG (35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis // Cell Immunol.-2000,- Vol. 205.- P. 24-33.
48. Villarroya H„ Violleau K„ Ben Younes-Chen-noufi A., Baumann N. Myelin-induced experimental allergic encephalomyelitis in Lewis rats: tumor necro-
sis factor alpha levels in senim and cerebrospinal fluid immunohistochemical expression in glial cells and macrophages of optic nerve and spinal cord //J. Neuroim-munol.- 1996,- Vol. 64,- P. 55-61.
49. Villarroya H., Marie Y., Ouallet J.-C., Le Saux F., Tchelingerian J.-L., Baumann N. Expression of TNFa in central neurons of Lewis rat spinal cord after
EAE induction //J. Neurosci. Res.- 1997,- Vol. 49.- P. 592-599.
50. Xiao B. G., Bai X.F., Zhang G.X., Link H. Suppression of acute and protracted-relapsing experimental allergic encephalomyelitis by nasal administration of low-dose IL-10 in rats //J. Neuroimmunol.- 1998,-Vol. 84.- P. 230-237.
поступила в редакцию 14.01.2004 принята к печати 22.01.2004
