CC BY
4
9. Ivanova N.A. Hematological studies in veterinary practice: their clinical significance, main methods and types. VetPharma. 2018; 3. URL: https://vetpharma.org/ articles/169/7785/
10. Makarevich N.A., Lukyanova G.A. Epizootology, symptoms and treatment of hemobartonellosis in cats. Transactions of Taurida Agricultural Science. 2017; 172(9): 97-104.
11. Konyaev S. Transmissible diseases of animals. Laboratory diagnostics. URL: https://vk.com/video-186938409_456239096?access_key=4ffe39bae 10d76c410.
12. Yashchenko E.A., Lutsuk S.N., Dyachenko Yu.V. Hematological indicators in hemobartonellosis of cats. Agricultural Bulletin of Stavropol Region. 2017; 2: 80-83.
Галина Николаевна Бобкова, кандидат биологических наук, доцент, olesyabobkova291101@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-8212-0051
Василий Павлович Иванюк, доктор ветеринарных наук, профессор, vpivanuk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8439-1632
Ева Николаевна Романова, соискатель, zn-shuklina@yandex.ru
Galina N. Bobkova, Candidate of Biology, Associate Professor, olesyabobkova291101@mail.ru, https://orcid.org/0000-0002-8212-0051
Vasily P. Ivanyuk, Doctor of Veterinary Sciences, Professor, vpivanuk@mail.ru, https://orcid.org/0000-0001-8439-1632
Eva N. Romanova, research worker, zn-shuklina@yandex.ru
Вклад авторов: все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Contribution of the authors: the authors contribution equally to this article. The authors declare no conflict of interests.
Статья поступила в редакцию 10.02.2023; одобрена после рецензирования 24.02.2023; принята к публикации 05.03.2023.
The article was submitted 10.02.2023; approved after reviewing 24.02.2023; accepted for publication 05.03.2023.
-Ф-
Научная статья
УДК 616-018
doi: 10.37670/2073-0853-2023-100-2-227-230
Экспрессия маркёра р53 при пренатальном введении эстрогенов на семенники потомства белых лабораторных мышей
Римма Тагировна Сулайманова
Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Университет «Реавиз»,
Санкт-Петербург, Россия
Аннотация. В статье представлены результаты анализа экспрессии иммуногистохического маркёра р53 на семенниках потомства белых беспородных лабораторных мышей при пренатальном воздействии различных доз синтетического аналога эстрогена синэстрола. Объектом исследования было потомство самцов белых беспородных лабораторных мышей, матерям которых на 11-е сутки гестации Е 11.5 беременности в одно и тоже время суток однократно, внутримышечно вводили различные дозы синтетического препарата синестрол: в виде 2%-ного масляного раствора в дозе 25 мкг/кг и в виде 2%-ного масляного раствора в дозе 40 мкг/кг Экспрессию иммуногистохического маркёра р53 оценивали в структурах семенников потомства: сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах, в клетках Лейдига. Результат анализа показал нарушение эндокринного аппарата семенников в виде снижения численности и функциональной активности клеток Лейдига, о чём свидетельствует иммуногистохический маркёр р53.
Ключевые слова: маркёр р53, пренатальное введение, синэстрол, семенники, белые беспородные лабораторные мыши, потомство.
Для цитирования: Сулайманова Р.Т. Экспрессия маркёра р53 при пренатальном введении эстрогенов на семенники потомства белых лабораторных мышей // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2023. № 2 (100). С. 227 - 230. https://doi.org/10.37670/2073-0853-2023-100-2-227-230.
Original article
Expression of the p53 marker during prenatal injection of estrogens to the testes of offspring of white laboratory mice
Rimma T. Sulaimanova
Private institution educational organization of higher education "University "Reaviz", St. Petersburg, Russia
Abstract. The article presents the results of the analysis of the expression of the immunohistochemical marker p53 on the testes of offspring of white mongrel laboratory mice under prenatal exposure to various doses of the synthetic analogue of estrogen synestrol. The offspring of male white mongrel laboratory mice were studied,
whose mothers on the 11th day of gestation E 11.5 gestation at the same time of day, once, intramuscularly administered various doses of the synthetic drug synestrol: in the form of a 2% oil solution at a dose of 25 mcg / kg and in the form of a 2% oil solution at a dose of 40 mcg / kg. The expression of the immunohistochemical marker p53 was evaluated in the structures of the testes of the offspring: spermatogonia, spermatocytes, spermatids, spermatozoa, in Leydig cells. The result of the analysis showed a violation of the endocrine apparatus of the testes in the form of a decrease in the number and functional activity of Leydig cells, as evidenced by the immunohistochemical marker p53.
Keywords: p53 marker, prenatal injection, synestrol, testes, white outbred laboratory mice, offspring.
For citation: Sulaimanova R.T. Expression of the p53 marker during prenatal injection of estrogens to the testes of offspring of white laboratory mice. Izvestia Orenburg State Agrarian University. 2023; 100(2): 227-230. (In Russ.). https://doi.org/10.37670/2073-0853-2023-100-2-227-230.
Благополучие постнатального развития и репродуктивная активность во взрослой жизни зависят от условий внутриутробного состояния организма. Вредные факторы внешней среды, влияние экзогенных гормонов в пренатальный период закладки и развития гонад являются ключевыми регуляторами репродуктивного здоровья потомства мужского и женского пола [1, 2].
У морфологов появилась возможность им-муногистохимически (ИГХ) маркировать клетки при различных фазах клеточного цикла [3, 4].
В последние годы получены результаты, позволяющие надеяться на разработку новых эффективных способов предсказания клинического течения и терапии новообразования, основанных на высокотехнологичных и более точных методах анализа. По данным научных исследований, таковым является ИГХ маркёр р53, который отвечает за охрану клеток: либо индуцирует репарацию повреждений, либо останавливает клеточный цикл, либо стимулирует клетки с изменённым геномом к апоптозу [5].
Потеря экспрессии ИГХ маркёра р53 приводит к существенному снижению миграционной способности самых разных типов клеток - нормальных фибробластов, кератиноцитов, макрофагов, клеток рака лёгкого и ободочной кишки. С другой стороны, повышение активности р53, вызываемое, в частности, рядом стрессов, наоборот, увеличивает миграционную способность клеток [6, 7].
Экспериментальное исследование влияния различных доз экзогенных гормонов, в частности синтетического аналога синестрола, в пренаталь-ный период закладки репродуктивных органов с анализом экспрессии иммуногистохического маркёра р53 является актуальной и малоизученной научной проблемой.
Цель - анализ экспрессии иммуногистохического маркёра р53 на семенниках потомства белых беспородных лабораторных мышей при пренатальном воздействии различных доз синтетического аналога эстрогена синэстрола.
Материал и методы. В экспериментальной работе использовали потомство самцов белых беспородных лабораторных мышей, матерям которых на 1-е сут. гестации Е 11.5 беременности в одно и то же время суток однократно, внутримышечно
вводили различные дозы синтетического препарата синэстрол: в виде 2%-ного масляного раствора в дозе 25 мкг/кг и в виде 2%-ного масляного раствора в дозе 40 мкг/кг, согласно патенту RU 2676437, 2018. Дозы препаратов рассчитывали и определяли эффективность в соответствии с коэффициентом для перерасчёта доз веществ в мкг/кг для мышей [8 - 11].
Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях при круглосуточном доступе к воде и пище. Все эксперименты, уход и содержание осуществляли в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях.
Потомство самцов мышей было разделено на три группы: интактная группа - без воздействия, I опытная гр. - С-25, II опытная гр. - С-40, название группы получили с учётом дозы вводимого вещества. По достижении половозрелого возраста [12] потомство выводили из эксперимента в фазу диэструса. Определяли эстральный цикл, используя влагалищные мазки, окрашенные по критериям M.C. Cora [13].
Иммугистохимический анализ проводили на семенниках потомства белых беспородных лабораторных мышей, фиксацию и гистологическую проводку осуществляли по стандартной схеме. Подсчёт структур семенников потомства производился под иммерсионным объективом на стандартных полях зрения 90* [14]. Имму-ногистохимическим методом определяли маркёр р53 - ядерный антиген. Анализ проводили на срезах с парафиновых блоков семенников потомства, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике, используя непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия) для мыши (Mouse Monoclonal Antibody р53 Protein, клон fl-393-G; 1:300) по рекомендации производителя Santa Cruz Biotechnology (США). Гистологические срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В 10 полях зрения при увеличении 100 проводилась оценка окрашеных препаратов каждого образца с использованием светового
1. Количество р53 иммунопозитивных клеток в структурах семенников потомства при пренатальном введении синэстрола (X ± 5" х)
Показатель Группа
интактная I опытная С-25 II опытная С-40
Клетки сперматогониев в эпителии извитого семенного канальца 24,4 ± 1,4 25,5 ± 1,0 26,2 ± 0,8
Клетки сперматоцитов в эпителии извитого семенного канальца 27,8 ± 0,8 26,8 ± 0,9 27,0 ± 0,7
Клетки сперматид в эпителии извитого семенного канальца 25,0 ± 1,0 26,3 ± 0,9 25,8 ± 0,8
Клетки сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца 118,9 ± 1,2 121,6 ± 0,2 120,7 ± 0,5
Клетки Лейдига в соединительнотканной строме между извитыми семенными канальцами 5,4 ± 1,1 3,3 ± 0,5* 4,0 ± 0,7*
* В сравнении с интактной группой выявлены различия при уровне значимости P < 0,05.
микроскопа Leica. Среднее число положительных к антигенам клеток вычисляли соотношением с клетками, в которых эти антигены не определялись (на 100 просчитанных клеток).
Экспрессию ИГХ маркёра р53 оценивали в структурах семенников потомства: сперматогони-ях, сперматоцитах, сперматидах, сперматозоидах, в клетках Лейдига.
Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, США). По каждому параметру вычисляли среднее арифметическое значение и его стандартную ошибку (М± SD). Достоверность изменений оценивали с помощью метода Краскела - Уолиса, различия определяли при достигнутом уровне значимости P < 0,05.
Результаты и обсуждение. Результаты ИГХ-анализа маркёра р53 семенников потомства белых беспородных лабораторных мышей при пренатальном однократном внутримышечном введении синтетического препарата синэстрол представлены в таблице 1 и на рисунке 1.
Морфометрический анализ ИГХ маркёра р53 при введении синтетического препарата синэ-строл в дозах 25 и 40 мкг/кг в сперматогониях по сравнению с интактной группой показал незначительное увеличение позитивно окрашенных клеток: в группе С-25 - 26,8 ± 0,9, в группе С-40 - 27,0 ± 0,7. В сперматидах количество позитивно окрашенных клеток в группе С-25 составляло 26,3 ± 0,9, в группе С-40 - 25,8 ± 0,8. При анализе сперматозоидов в просвете извитого семенного канальца в интактной группе (118,9 ± 1,2) по сравнению с экспериментальными группами С-25 (121,6 ± 0,2) и С-40 (120,7 ± 0,5) различий не обнаружено.
Сравнительный анализ показал, что в опытных группах С-25 и С-40 по сравнению с интактной группой произошло статистически значимое уменьшение количества клеток Лей-дига на 61,1 % (P < 0,05) и 74,1 % (P < 0,05) соответственно (рис. 1).
Выводы. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что пренатальное введение синтетического аналога эстрогена синэстрола в условиях эксперимента оказывает негативное
7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0
Интактная группа С-25 мкг/кг
Название группы
С-40 мкг/кг
□ Mean I Mean ± 0,95 Conf. Interval
Рис. 1 - Гистограмма, отражающая количество р53 иммунопозитивных клеток Лейдига при пренатальном введении синтетического препарата синэстрол
влияние на морфофункциональное состояние семенников потомства. Наряду с этим наблюдались нарушения эндокринного аппарата семенников в виде снижения численности клеток Лейдига и их функциональной активности, о чём свидетельствует ИГХ маркёр р53. Полученные результаты убедительно доказывают, что пренатальное введение синтетического препарата синэстрол можно рассматривать в качестве этиологического фактора, обуславливающего нарушение мужской фертильности. На наш взгляд, экспериментальные данные можно рекомендовать для лимитирования доз введения синтетического аналога эстрогена синэстрола в пренатальный период.
Список источников
1. Никитин А.И., Сергеев О.В., Суворов А.Н. Влияние вредных факторов среды на репродуктивную, эндокринную системы и эпигеном. М., 2016. 348 с.
2. Курило Л.Ф. Система тестирования факторов, повреждающих женские и мужские гаметы и гонады // Гигиена и санитария. 2011. № 5. С. 72 -78.
3. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / Д.Э. Коржевский, О.В. Кирик, М.Н. Карпенко и др.; под ред. Д.Э. Коржевского. 2-е изд., испр. и доп. СПб.: СпецЛит, 2014. 119 с.
4. Иммуногистохимические методы: руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова. М., 2011. 224 с.
5. Киселев Ф.Л. О молекулярных механизмах возникновения опухолей // Природа. 2014. № 4 (1184). С. 12 - 21.
6. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration. J Biol Chem. 2003; 278(30): 27362-71. https:// doi.org/10.1074/jbc.M300547200.
7. Multifaced р53: variety of forms, functions, tumor-suppressive and oncogenic activities / B.P. Kopnin, P.B. Kopnin, N.V. Khromova, L.S. Agapova // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2008. № 1 (1). С. 2 - 9.
8. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ / Е.В. Арзамасцев, Т.А. Гуськова, И.В. Березовская и др.; под ред. Р.У Хабриева. М.: Медицина, 2005. С. 41- 54.
9. Гуськова Т.А. Доклиническое токсикологическое изучение лекарственных средств как гарантия безопасности проведения их клинических исследований // Токсикологический вестник. 2010. № 5 (104). C. 2-6.
10. Пат. № RU 2676437 Способ моделирования проканцерогенного действия синестрола на яичники потомства женского пола у лабораторных мышей / Сулайманова Р.Т., Хайруллин Р.М., Имаева А.К. и др. Опубл. 09.01.2018.
11. Хабриев Р. У Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. C. 49 - 51.
12. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария, Б.В. Западнюк. 3-е изд. Киев, 1983. 383 с.
13. Cora M.C., Kooistra L., Travlos G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse: Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears. Toxicologic Pathology. 2015; 43(6): 776-793.
14. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. M.: Медицина, 1990. 384 с.
References
1. Nikitin A.I., Sergeev O.V., Suvorov A.N. Influence of harmful environmental factors on the reproductive, endocrine systems and epigenome. M., 2016. 348 p.
2. Kurilo L.F. A system for testing factors that damage female and male gametes and gonads. Hygiene and Sanitation. 2011; 5: 72-78.
3. Theoretical foundations and practical application of immunohistochemistry methods: a guide / D.E. Korzhevsky, O.V. Kirik, M.N. Karpenko and others; ed. D.E. Korzhevsky. 2nd ed., rev. and additional St. Petersburg: SpecLit, 2014. 119 p.
4. Immunohistochemical methods: a guide / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.: DAKO / Per. from English. ed. G.A. Frank and P.G. Malkov. M., 2011. 224 p.
5. Kiselev F.L. On the molecular mechanisms of the onset of tumors. Priroda. 2014; 1184(4): 12-21.
6. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration. J Biol Chem. 2003; 278(30): 27362-71. https:// doi.org/10.1074/jbc.M300547200.
7. Multifaced p53: variety of forms, functions, tumor-suppressive and oncogenic activities / B.P. Kopnin, P.B. Kopnin, N.V. Khromova, L.S. Agapova. Clinical oncohema-tology. Basic research and clinical practice. 2008; 1(1): 2-9.
8. Guidelines for the study of the general toxic action of pharmacological substances / E.V. Arzamastsev, T.A. Gus-kova, I.V. Berezovskaya and others; ed. RU. Khabrieva. M.: Medicine, 2005, pp. 41 - 54.
9. Guskova T.A. Preclinical toxicological study of drugs as a guarantee of the safety of their clinical trials. Toxicological Bulletin. 2010; 104(5): 2-6.
10. Patent RU 2676437 A method for modeling the pro-carcinogenic effect of sinestrol on the ovaries of female offspring in laboratory mice / Sulaimanova R.T., Khairullin R.M., Imaeva A.K. and others. Publ. 01/09/2018.
11. Khabriev R.U. Guidelines for the experimental study of new pharmacological substances. M., 2005. C. 49-51.
12. Laboratory animals. Breeding, maintenance, use in the experiment / I.P. Zapadnyuk, V.I. Zapadnyuk, E.A. Zachariah, B.V. Zapadnyuk. 3rd ed. Kyiv, 1983. 383 p.
13. Cora M.C., Kooistra L., Travlos G. Vaginal Cytology of the Laboratory Rat and Mouse: Review and Criteria for the Staging of the Estrous Cycle Using Stained Vaginal Smears. Toxicologic Pathology. 2015; 43(6): 776-793.
14. Avtandilov G.G. Medical morphometry. Management. M.: Medicine, 1990. 384 p.
Римма Тагировна Сулайманова, кандидат биологических наук, доцент, rimma2006@bk.ru, https://orcid. org/0000-0002-1658-9054
Rimma T. Sulaimanova, Candidate of Biology, Associate Professor, rimma2006@bk.ru, https://orcid.org/0000-0002-1658-9054
Статья поступила в редакцию 18.02.2023; одобрена после рецензирования 10.03.2023; принята к публикации 20.03.2023.
The article was submitted 18.02.2023; approved after reviewing 10.03.2023; accepted for publication 20.03.2023. -♦-
