CC BY
2664_TECHNICAL SCIENCE / <<Ш1ШЗДиМ"^©иГМа1>>#26ШЗ,2Ш9
Жулай Г.А.1, Чуров А.В.1, Мамашов К.Ы.2
1Федеральный исследовательский центр «Карельский научный центр Российской академии наук» (КарНЦ РАН), г. Петрозаводск.
2Кемеровский государственный медицинский университет, г. Кемерово.
DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10940
ЭКСПРЕССИЯ ИНГИБИРУЮЩЕЙ МОЛЕКУЛЫ CTLA-4 СУБПОПУЛЯЦИЯМИ CD4+ Т-
КЛЕТОК ПРИ КОЛОРЕКТАЛЬНОМ РАКЕ
Zhulai G.A.1, Churov A.V.1, Mamashov K. Y.2
1 Federal Research Center "Karelian Research Center Russian Academy of Sciences" (KarRC RAS), Petrozavodsk.
2Kemerovo State Medical University, Kemerovo.
EXPRESSION OF THE CTLA-4 INHIBITING MOLECULE BY CD4+ T-CELL SUBPOPULATIONS
IN COLORECTAL CANCER
Аннотация
Колоректальный рак является одной из ведущих локализаций среди злокачественных новообразований в общей структуре онкологической заболеваемости в России (Каприна и др., 2014) и в мире (Mougiakakos, 2011; Циммерман, 2012). В развитии резистентности опухолевых клеток к механизмам иммунологической защиты важную роль отводят формирующейся в микроокружении опухоли иммунной супрессии. Непосредственными участниками этого процесса являются регуляторные Т-клетки (Treg).
Целью исследования заключалась в исследовании уровня экспрессии ингибирующей молекулы CTLA-4 субпопуляциями Treg-клеток и CD4+ Т-клеток у больных колоректальным раком.
Abstract
Colorectal cancer is one of the leading localizations among malignant neoplasms in the general structure of cancer incidence in Russia (Kaprina et al., 2014) and in the world (Mougiakakos, 2011; Zimmerman, 2012). In the development of resistance of tumor cells to immunological defense mechanisms, an important role is played by the immune suppression formed in the tumor microenvironment. Direct participants in this process are regulatory T cells (Treg).
The aim of the study was to investigate the expression level of the CTLA-4 inhibitory molecule by Treg cell and CD4+ T cell subpopulations in patients with colorectal cancer.
Ключевые слова: Treg-клетки, колоректальный рак, CTLA-4.
Key words: Treg cells, colorectal cancer, CTLA-4.
Введение
Колоректальный рак (КРР) является одной из ведущих локализаций среди злокачественных новообразований в общей структуре онкологической заболеваемости в России [1] и в мире [2,3]. В настоящее время немаловажную роль в развитии резистентности опухолевых клеток к механизмам иммунологической защиты отводят формирующейся в микроокружении опухоли иммунной супрессии. Непосредственными участниками этого процесса являются регуляторные Т-клетки (Г1^). Эти клетки в норме подавляют чрезмерный иммунный ответ в организме, поддерживая иммунологическую толерантность, в том числе пищевую толерантность в кишечнике. При канцерогенезе Treg-клетки рассматриваются в качестве мишени для иммунотерапии, с целью ограничения их функционирования. Однако роль этой популяции в механизмах развития КРР четко не ясна. По некоторым данным, в отличие от большинства других форм рака, при КРР повышенное содержание инфильтрирующих опухоль Treg-клеток связано с благоприятным прогнозом выживаемости для больных [4,5]. Не
ясно, является ли это следствием положительного влияния Treg-клеток, которое может быть связано со сдерживанием воспаления [6], возникающего в микроокружении опухоли, или причина в особенностях функционирования Treg-клеток при КРР.
Известно несколько механизмов Treg-супрес-сии, связанных с презентацией антигена. Наиболее важным из них является снижение костимулирую-щих молекул на дендритных клетках (ДК) посредством взаимодействия их с CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4). Известно, что Treg-клетки конститутивно экспрессируют CTLA-4 и что использование анти-CTLA-4 моноклональных антител (мАТ) отменяет подавление пролиферации эффекторных Т-клеток Treg-клетками in vitro [7].
Таким образом, CTLA-4 является важной функциональной молекулой в Treg-опосредованной супрессии и представляет огромный интерес в качестве мишени в противоопухолевой иммунотерапии. В связи с этим целью исследования являлся анализ экспрессии CTLA-4 у пациентов с КРР для Treg-клеток и CD4+ Т-клеток. Также
/ TECHNICAL science
в работе оценивали наличие связи между количеством CD4+CTLA-4+ Т-клеток и количественными изменениями в популяционном составе циркулирующих лимфоцитов больных КРР.
Материалы и методы
В работе исследовано 38 образцов периферической крови пациентов с КРР, средний возраст которых составил 66±13,4 лет. Обследованные лица были разделены на две группы: пациенты с начальными стадиями заболевания (I-II стадии) и пациенты с поздними стадиями заболевания (III-IV стадии). В качестве контроля анализировали лимфоциты 30 здоровых доноров в возрасте 54,4±20,6 лет. Экспрессию молекул клетками оценивали методом многоцветной проточной цитометрии на приборе Cytomics FC500 («Beckman Coulter», США) с использованием моноклональных антител CD4-FITC, CD8-FITC, CD25-PC5, CD127-PC7, CTLA-4-PE («Beckman Coulter», Франция), CD3-PE, CD16-FITC, CD19-FITC (ООО «Сорбент», Россия) и соответствующих изотипических контролей. Анализ внутриклеточной экспрессии CTLA-4 выполняли с применением набора буферов для фиксации и пер-меабилизации. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ
65
«Statistica 6.0», достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна-Уитни при уровне значимости р<0,05. Для выявления и оценки характера связи между признаками использовали коэффициент ранговой корреляции Спир-мена. Данные представлены в виде M±SD. Исследование выполнено с использованием приборной базы Центра коллективного пользования научным оборудованием КарНЦ РАН.
Результаты и обсуждение
При КРР наблюдалось увеличение количества CD4+ Т-клеток, экспрессирующих ингибирующие молекулы CTLA-4 (р<0,05), что согласуется с литературными данными [8-10]. Повышенное содержание CD4+ Т-клеток по сравнению с контролем наблюдалось уже на ранних стадиях заболевания -у пациентов с 1-11 стадиями КРР (р<0,05).
Для более полного представления об уровне экспрессии исследуемой молекулы в популяции CD4+ Т-клеток у пациентов с КРР оценивали экспрессию CTLA-4 Treg-клетками с фенотипом CD4+CD25+CD127lo/-, а также у клеток с фенотипами CD4+CD25+ и CD4+CD25-. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1
Уровень экспрессии CTLA-4 у CD4+CD25+CD127lo/-, CD4+CD25+ и CD4+CD25- Т-клеток
CD4+CD25+ CD4+CD25- CD4+CD25+CD127lo/-
Контроль 15,15±3,6 4,92±1,22 43,65±4,9
Больные КРР I-II стадии 22,26±11,4 10,67±3,7* 59,19±15,0*
Больные КРР III-IV стадии 23,34±9,6* 10,76±6,7* 60,45±11,9*
Примечание. * - различия достоверны по сравнению с контролем при p <0,05.
Наиболее высокий уровень экспрессии СТЪА-4 приходится на CD4+CD25+CD127lo/- Т^-клетки. Повышенная экспрессии этой молекулы выявлена и для других клеток. В литературе имеются сведения, что экспрессия CTLA-4 повышается после активации лимфоцитов [8,11]. Это и наблюдалось нами для клеток с фенотипами CD4+CD25+ в сравнении с CD4+CD25- (р<0,05). У активированных CD4+CD25+ Т-клеток больных КРР на более поздних стадиях экспрессия CTLA-4 была достоверно выше, чем в контроле. CD4+CD25- Т-клетки пациентов с КРР также отличаются повышенной экспрессией этой молекулы. При нормальных условиях CTLA-4 экспрессируется на терминальных стадиях иммунной реакции для ограничения пролиферации эффекторной клетки и это рассматривается как механизм саморегуляции [11]. Отмечается также, что
такие лимфоциты становятся анергичными и некоторыми авторами показано увеличение содержания этих клеток в периферической крови онкологических [8,11-12], что также наблюдалось и нами в случае КРР.
Ранее нами были показаны изменения в попу-ляционном составе лимфоцитов периферической крови больных КРР, приводящие к ослаблению иммунного ответа. Для оценки роли CTLA-4+ Т^-клеток в иммунной супрессии больных КРР был проведен корреляционный анализ содержания CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CTLA-4, с количеством Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток (таблица 2). Отрицательная корреляция имела место между содержанием CD3+CD4+ Т-хелперов и количеством CTLA-4+ Т^-клеток.
Таблица 2
Коэффициент корреляции, отражающий содержание субпопуляций лимфоцитов
CD4+CTLA-4+
r Р
CD3+CD19- Т-клетки -0,02 0,894
CD3+CD4+ Т-хелперы -0,44 0,022
CD3+CD8+ цитотоксические Т-клетки 0,20 0,324
CD3-CD19+ В-клетки -0,31 0,148
CD3-CD16+ NK-клетки 0,16 0,404
Примечание. Жирным шрифтом выделены достоверные значения коэффициента корреляции.
66
TECHNICAL SCIENCE /
Заключение
Treg-клетки пациентов с онкологическими заболеваниями могут использовать различные механизмы для подавления иммунного ответа на опухолевые антигены. Одним из основных способов иммунной супрессии, опосредованной Тreg-клетками, является контакт-зависимая супрессия с помощью экспрессии молекулы CTLA-4. Есть данные о том, что Treg-клетки отличаются конститутивной усиленной экспрессией CTLA-4 по сравнению с обычными T-хелперами, и эта молекула используется в качестве маркера Treg-клеток. Для детального понимания механизмов иммунной супрессии с участием Treg-клеток требуются дальнейшие исследования.
Финансирование:
Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств федерального бюджета на выполнение государственного задания КарНЦ РАН, № 0218-2019-0083 (по теме «Изменение транскрипционных программ дифференцировки регу-ляторных Т-клеток при иммуновоспалительных и онкологических патологиях»).
Благодарности: спонсор публикации ООО «ПРАЙМ ПЕЙПЕРС» (научные переводы, www.primepapers.ru).
Список литературы
1. Состояние онкологической помощи населению России в 2015 / Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. Герцена филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. - 2016. - 250 с.
2. Mougiakakos, D. Regulatory T cells in colorectal cancer: from biology to prognostic relevance / D. Mougiakakos // Cancers. - 2011. - Vol. 3. - P. 17081731
3. Циммерман, Я.С. Колоректальный рак: современное состояние проблемы / Циммерман Я.С. // РЖГГК. - 2012. - Т. 22 (4). - С. 5-17.
4. Lee, I. Recruitment of Foxp3+T regulatory cells mediating allograft tolerance depends on the CCR4
chemokine receptor / I. Lee, L. Wang, A.D. Wells et al. // J. Exp. Med. - 2005. -Vol. 201. - P. 1037-1044
5. Nosho, K. Tumour-infiltrating T-cell subsets, molecular changes in colorectal cancer, and prognosis: cohort study and literature review / K. Nosho, Y. Baba, N. Tanaka et al. // J. Pathol. - 2010. - Vol. 222. - P. 4350-4366.
6. Lasry, A. Inflammatory networks underlying colorectal cancer / A. Lasry, A. Zinger, Y. Ben-Neriah //Nat. Immunol. - 2016. - Vol. 17 (3). - P. 230-240
7. Tanaka, A. Regulatory T cells in cancer immunotherapy / A. Tanaka and S. Sakaguchi // Cell Research. - 2017. - Vol. 27. - P. 109-118.
8. Erfani, N. Increase of regulatory T cells in met-astatic stage and CTLA-4 over expression in lymphocytes of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC)/ N. Erfani, S.M. Mehrabadi, M.A. Ghayumi, M.R. Haghshenas et al. // Lung Cancer. - 2012 - Vol. 77 - P. 306-311 .Nishikawa, N. Regulatory T cells in tumor immunity / N. Nishikawa, S. Sakaguchi // Int. J. Cancer. - 2010. - Vol. 127. - P. 759-767.
9. Svensson, H. Accumulation of CCR4+CTLA-4 FOXP3+CD25(hi) regulatory T cells in colon adenocarcinomas correlate to reduced activation of conventional T cells / H. Svensson, V. Olofsson, S. Lundin et al. // PLoS One. - 2012. - Vol. 7(2). - e30695.
10. Callahan, M.K. At the bedside: CTLA-4- and PD-1-blocking antibodies in cancer immunotherapy / M.K. Callahan, J.D. Wolchok // J. Leukoc. Biol. -2013. -Vol. 94. - P. 41-53.
11. Motta, M. Increased expression of CD152 (CTLA-4) by normal T lymphocytes in untreated patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia / M. Motta, L. Rassenti, B.J. Shelvin et al. // Leukemia. -2005. - Vol. 19. - P. 1788-1793
12. Fife, B.T. Control of peripheral T-cell tolerance and autoimmunity via the CTLA-4 and PD-1 pathways / B.T. Fife, J.A. Bluestone // Immunol Rev. -2008. - Vol. 224. - P. 166-182.
