CC BY
117
Труды Карельского научного центра РАН № 5.2014. С. 228-233
УДК: 612.422:612.017.1:616-006.6:616.37-002
АНАЛИЗ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ПАТОЛОГИЯХ, СОПРОВОЖДАЮЩИХСЯ РАЗВИТИЕМ ИММУННОЙ СУПРЕССИИ
Г. А. Жулай1, Е. К. Олейник1, П. Н. Кравченко1, А. В. Чуров1, В. М. Олейник1, А. В. Головин2, В. А. Толлер3, К. А. Островский4,
1 Институт биологии Карельского научного центра РАН
2 ГБУЗ Республиканский онкологический диспансер
3 ГБУЗ Больница скорой медицинской помощи,
4 НУЗ Отделенческая клиническая больница на ст. Петрозаводск
Проведена оценка изменений клеточного иммунитета у лиц с заболеваниями желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), патогенез которых сопровождается формированием иммунной супрессии: больные колоректальным раком (КРР, n = 20) и больные тяжелым острым панкреатитом (ОП, n = 16). Контрольную группу составили 14 здоровых доноров. У больных были отмечены признаки развития вторичного иммунодефицита, снижено содержание некоторых популяций лимфоцитов по сравнению с контролем. Показан сдвиг иммунорегуляторного индекса в сторону его снижения. Интересно отметить, что и при развитии КРР, и при ОП у больных было повышено содержание периферических CD4+CD25+FOXP3+ регуляторных Т-клеток (Treg) по сравнению с контролем.
К л ю ч е в ы е с л о в а: лимфоциты, Treg-клетки, FOXP3, колоректальный рак, острый панкреатит, иммунная супрессия.
G. A. Zhulai, E. K. Oleinik, P. N. Kravchenko, A. V. Churov, V. M. Oleinik, A. V. Golovin, V. A. Toller, K. A. Ostrovskii. ANALYSIS OF CELLULAR IMMUNITY IN PATHOLOGIES ACCOMPANIED BY THE DEVELOPMENT OF IMMUNE SUPPRESSION
Changes in cellular immunity in patients with gastrointestinal diseases, where the pathogenesis is accompanied by the formation of immune suppression: patients with colorectal cancer (CRC, n = 20) and patients with severe acute pancreatitis (AP, n = 16), were assessed. The control group consisted of 14 healthy donors. Indications of a developing secondary immunodeficiency were observed in patients. The content of some lymphocyte subsets was reduced in comparison with the control. The immunoregulatory index shifled downwards. It is noteworthy that the content of peripheral CD4+CD25+FOXP3+ Treg cells in both CRC and AP patients increased in comparison with the control.
K e y w o r d s: lymphocytes, Treg cells, FOXP3, colorectal cancer, acute pancreatitis, immune suppression.
Введение
К настоящему времени установлено, что развитие и элиминация любого патологического процесса в организме происходит с участием механизмов иммунологической защиты. Одним из таких механизмов является индукция иммунной супрессии опухолевыми клетками при канцерогенезе. Известно, что опухоль и ее микроокружение способны привлекать различные клетки иммунной системы, изменять их функции и фенотип и стимулировать продукцию ряда супрес-сорных факторов для ускользания от адекватной противоопухолевой иммунной реакции [Бережная, 2009]. Особую роль в этом отношении отводят популяции Тгед-клеток, которые в норме поддерживают иммунологическую толерантность к собственным антигенам посредством подавления функций широкого ряда иммунокомпе-тентных клеток [ЭакадисЫ et а1., 2010].
В вопросе взаимодействия иммунной системы и опухоли активно исследуются лимфо-идные клетки, инфильтрирующие микроокружение опухоли, однако данных, характеризующих состояние периферических лимфоцитов, мало. Исследование особенности распределения системы циркулирующих лимфоцитов у онкологических больных, в частности Тгед-кле-ток, представляется интересным в сравнении с другой патологией, также сопровождающейся развитием иммунной супрессии. В данной работе предлагается рассмотреть основные популяции лимфоцитов и Тгед-клетки у лиц с патологией ЖКТ: больных КРР и больных ОП.
ОП характеризуется воспалением поджелудочной железы с возможным вовлечением пе-рипанкреатических тканей и формированием полиорганной функциональной недостаточности, которая в свою очередь может возникать вследствие панкреонекроза, присутствия инфекции или сепсиса [МоАеИ, 2008]. Последние исследования демонстрируют, что развитие ОП тесно связано с нарушением равновесия в иммунных механизмах, особенно в регуляции Т-хелперов (ТИ)1/ТИ2 и секреции ими цитокинов. Было показано, что тяжелый ОП сопровождается индукцией иммунной супрессии, которая может
способствовать развитию вторичной инфекции и ухудшать состояние больного [Li et al., 2013; Ueda et al., 2006]. Однако данных о содержании и функционировании Treg-клеток у больных ОП в литературе немного. Поэтому целью настоящей работы являлось сравнительное изучение популяций периферических лимфоцитов, в частности Treg-клеток, у больных КРР и ОП.
Материалы и методы
В работе исследовано 50 образцов периферической крови человека. Группу больных с тяжелым ОП составили 16 человек в возрасте от 22 до 83 лет, среди которых 7 больных имели деструктивную форму (табл.). Диагноз поставлен на основе классификации, принятой на IX Всероссийском съезде хирургов в 2000 году. Забор крови осуществляли на 1-10-е сутки после поступления на лечение, до оперативного вмешательства. В группу больных КРР вошли 20 человек в возрасте от 44 до 83 лет на разных стадиях развития опухоли (см. табл.). Забор крови проводили также до хирургического вмешательства. Контрольную группу составили 14 здоровых доноров в возрасте от 25 до 65 лет. Анализ содержания основных популяций лимфоцитов проводили методом проточной ци-тометрии на приборе Cytomics FC500, с применением программного обеспечения CXP 2.0 («Beckman Coulter», США). Для оценки экспрессии клетками мембранных маркеров использовали моноклональные антитела CD3-PE, CD19-FITC, CD16-FITC (ООО «Сорбент», Москва), CD4-FITC, CD8-FITC, CD25-PC5 («Beckman Coulter», Франция). Определение Treg-клеток осуществляли по фенотипу CD4CD25FOXP3+, с использованием моноклональных антител к FOXP3 и растворов для пермеабилизации производства «eBioscience», США. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «BioStat 5.8.4», достоверность различий между группами рассчитывали по критерию Манна-Уитни при уровне значимости р < 0,05.
Исследование выполнено с применением оборудования Центра коллективного пользования научным оборудованием ИБ КарНЦ РАН.
Характеристика обследованных групп
Здоровые доноры Больные острым панкреатитом Больные колоректальным раком
Количество обследованных лиц 14 16 20
Средний возраст, лет 40,8 ± 13 44,8 ± 17 66,8 ± 10
Пол, мужчины/женщины 5/8 13/3 7/13
Развитие панкреонекроза, n - 7 (43,8 %) -
Развитие опухоли,n
I-II стадии 7 (35 %)
III стадия 6 (30 %)
IV стадия 7 (35 %)
80 п 2.5
CD3+ CD 19" CD164" GD3+CD4+ CD3+CD8~ ПРИ
Т-клетки В-клетки NK-клетки Т-хелперы ЦТЛ (CD4 CDS )
Рис. 1. Содержание популяций лимфоцитов в периферической крови больных колорек-тальным раком на разных стадиях болезни, % от общего числа лимфоцитов.
Здесь и далее: * - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,05; ** - различия достоверны по сравнению с контролем при р < 0,01
Результаты и обсуждение
Для определения изменений, происходящих в клеточном иммунитете у больных с исследуемыми заболеваниями ЖКТ, было проанализировано относительное количество Сй3+ Т-лимфоцитов, Сй19+Сй3- В-лимфоцитов и Сй16+Сй3- натуральных киллеров (ЫК). Также была проведена оценка субпопуляций Т-кле-ток: Т-хелперов (Сй3+Сй4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ, Сй3+С08). Было показано, что у больных КРР по сравнению с контролем снижено число В-лимфоцитов (рис. 1).
Количество циркулирующих Т-лимфоцитов у больных КРР на начальных стадиях развития опухоли (1-11 стадии) не отличалось от контроля, тогда как у больных с ИМУ стадиями КРР Т-кле-ток было меньше. В отношении ЫК-клеток у больных КРР намечена тенденция к увеличению их количества при прогрессии заболевания, однако достоверных различий по сравнению с контролем не выявлено. Значительные изменения наблюдались в субпопуляционном составе Т-клеток. Так, иммунорегуляторный индекс (ИРИ), отражающий баланс Сй4+/Сй8+ Т-клеток, у больных КРР был ниже контрольных значений. Причем на начальных стадиях развития опухоли его снижение происходило за счет меньшего числа Сй4+ Т-хелперов и повышенного количества Сй8+ ЦТЛ. Увеличение относительного числа Сй8+ Т-клеток может выявляться в случаях массивного поступления антигена, в том числе и онкогена, когда в его элиминации задействованы антигенспецифические механизмы. К тому же именно цитотоксическая активность Сй8+
Т-клеток играет важную роль в противоопухолевом иммунном ответе [Ling et al., 2007]. При исследовании периферических CD8+ Т-клеток на более поздних стадиях заболевания нами показано, что их содержание было на уровне нормы (см. рис. 1). Однако ИРИ у таких больных также оставался ниже контроля в основном за счет значительного уменьшения числа CD4+ Т-кле-ток. При этом у больных КРР наблюдалось сниженное по сравнению с контролем содержание активированных CD4 CD25+ Т-клеток на всех стадиях развития болезни (рис. 2). Полученные данные, а также литературные сведения [Seretis et al., 2014] свидетельствуют о том, что у больных КРР в процессе канцерогенеза происходит ослабление иммунной реакции, что может способствовать прогрессии болезни.
Рис. 2. Содержание активированных Сй4+С025+ Т-лимфоцитов в периферической крови больных КРР и ОП, % от общего числа лимфоцитов
230
Рис. 3. Содержание популяций лимфоцитов в периферической крови больных острым панкреатитом, % от общего числа лимфоцитов
У обследованных больных ОП также наблюдались признаки вторичного иммунодефицита. Было показано, что содержание Т-лимфоцитов и CD4+ Т-клеток ниже, чем в контроле (рис. 3). Количество активированных Т-хелперов также было снижено по сравнению с таковым у здоровых доноров (см. рис. 2). Изменения в соотношении субпопуляций Т-клеток отразились в значительном снижении ИРИ. Отмечено, что наряду с увеличенным числом CD8+ ЦТЛ у больных ОП было повышено содержание NK-клеток по сравнению с контролем. Это может свидетельствовать о том, что в иммунную реакцию при ОП включаются и специфические, и неспецифические механизмы элиминации антигена.
Природа иммунной недостаточности при остром панкреатите кроется в нарушении баланса продукции цитокинов Th1 и Th2, что приводит к их одновременной гиперпродукции. Это влечет за собой запуск каскада реакций, приводящих к чрезмерному иммунному ответу. При развитии заболевания усиленная активация иммунокомпетентных клеток сменяется увеличением уровня апоптоза периферических лимфоцитов, что, вероятно, и приводит к снижению их количества [Zhang et al., 2009]. Снижение числа циркулирующих Т- и В-лимфоцитов у больных ОП отмечается и в работах других авторов [Pietruczuk et al., 2006; Ueda et al., 2006; Li et al., 2013].
При анализе содержания Treg-клеток у больных КРР было обнаружено, что число периферических CD4CD25FOXP3+ Т-клеток у больных (n = 20) выше, чем в контроле (5,31 ± 2,7 % и 3,41 ± 0,8 % от CD4+ Т-клеток соответственно, p < 0,01). Многие авторы
демонстрируют повышенное количество Тгед-клеток у онкологических больных, причем отмечено, что накопление этих субпопуляций происходит в микроокружении опухоли и дренирующих опухоль лимфатических узлах, где их число в несколько раз превышает число периферических Тгед-клеток [Эа1ата е1: а1., 2009; Эеге^в е1: а1., 2014]. Предполагается, что привлечение и стимуляция Тгед-лимфоцитов опухолевыми клетками способствует формированию иммунной супрессии, которая рассматривается в качестве одного из важных механизмов уклонения от противоопухолевого иммунного ответа [Уапд, ДпэеИ, 2009].
Интересно отметить, что при анализе содержания Тгед-клеток у больных ОП (п = 7) также было обнаружено, что их количество в периферической крови выше (7,71 ± 2,1 % от Ой4+ Т-клеток, р < 0,01), чем в контроле. Увеличение числа циркулирующих Тгед-кле-ток у больных ОП показали также □ и. Р. с со-авт. при изучении развития иммунной супрессии по мере прогрессирования заболевания [□ е1: а1., 2013]. Учитывая повышенное содержание Тгед-клеток, а также воспалительный характер заболевания и увеличение уровня апоптоза циркулирующих лимфоцитов [7апд е1: а1., 2009], можно предположить, что развитие состояния иммунной супрессии у таких больных происходит как компенсаторный механизм, ограничивающий степень развития воспалительной реакции.
Заключение
В результате исследования двух патологий ЖКТ было показано, что при развитии
в
КРР и ОП происходят изменения в популяци-онном составе лимфоцитов периферической крови, приводящие к ослаблению иммунного ответа. Эти заболевания имеют разный генез и механизмы формирования, однако их развитие сопровождается иммунной супрессией, при которой происходит активация популяции Treg-клеток, что, по всей видимости, играет немаловажную роль в патогенезе как КРР, так и ОП. Исследования Treg-клеток у таких больных позволят выявить ключевые моменты их регуляторных функций при развитии иммунной супрессии, что в свою очередь позволит найти более эффективные мишени для иммунотерапии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-04-98826).
Литература
Бережная Н. М. Роль клеток системы иммунитета в микроокружении опухоли. I. Клетки и цитокины -участники воспаления // Онкология. 2009. Т. 11, № 1. С. 6-17.
Li J. P., Yang J., Huang J. R. et al. Immunosuppression and the infection in patients with early SAP // Front Biosci. (Landmark Ed). 2013. Vol. 18. P.892-900.
Ling K. L., Pratap S. E., Bates G. J., Singh B. et al. Increased frequency of regulatory T cells in peripheral blood and tumour infiltrating lymphocytes in colorectal cancer patients // Cancer Immun. 2007. Vol. 7, N 7.
Mofleh I. A. Severe acute pancreatitis: pathogenetic aspects and prognostic factors // World J. Gastroenterol.
2008. Vol. 14. P. 675-684.
Pietruczuk M., Dabrowska M. I., Wereszczynska-Siemiatkowska U. et al. Alteration of peripheral blood lymphocyte subsets in acute pancreatitis // World J. Gastroenterol. 2006. Vol. 12. P. 5344-5351.
Sakaguchi S., Miyara M., Costantino C. M., Hafler D. A. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system // Nat. Rev. Immunol. 2010. Vol. 10. P. 490-500.
Salama P., Phillips M., Grieu F., Morris M. et al. Tumor-infiltrating FOXP3+ T regulatory cells show strong prognostic significance in colorectal cancer // J. Clin. Oncol. 2009. Vol. 27. P. 186-192.
Seretis F., Seretis C., Youssef H., Chapman M. Colorectal cancer: seed and soil hypothesis revisited // Anticancer Res. 2014. Vol. 34, N 5. P. 2087-2094.
Ueda T., Takeyama Y., Yasuda T., Shinzeki M. et al. Immunosuppression in patients with severe acute pancreatitis // J. Gastroenterol. 2006. Vol. 41. P. 779-784.
Yang Z. Z., Ansell S. M. The role of Treg cells in the cancer immunological response // Am. J. Immunol.
2009. Vol. 5, N 1. P. 17-28.
Zhang X. P., Chen H. Q., Liu F., Zhang J. Advances in researches on the immune dysregulation and therapy of severe acute pancreatitis // J. Zhejiang. Univ. Sci. B. 2009. Vol. 10, N 7. P. 493-498.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Жулай Галина Анатольевна
младший научный сотрудник
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910
эл. адрес: гИдаМИ 11@rambler.ru
тел.: (8142) 769810
Zhulai, Galina
Institute of Biology, Karelian Research Centre, Russian Academy of Sciences 11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: zhgali-111@rambler.ru tel.: (8142) 769810
Олейник Евгения Константиновна
руководитель группы иммунологии, д. б. н.
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910
эл. адрес: ole@krc.karelia.ru
тел.: (8142) 769810
Oleinik, Evgenia
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Sciences
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk,
Karelia, Russia
e-mail: ole@krc.karelia.ru
tel.: (8142) 769810
Кравченко Полина Николаевна
аспирант
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910
эл. адрес: k-polina13@mail.ru
тел.: (8142) 769810
Kravchenko, Polina
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Sciences
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk,
Karelia, Russia
e-mail: k-polina13@mail.ru
tel.: (8142) 769810
Чуров Алексей Викторович
научный сотрудник, к. б. н.
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910
эл. адрес: achurou@yandex.ru
тел.: (8142) 769810
Churov, Alexei
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Sciences
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk,
Karelia, Russia
e-mail: achurou@yandex.ru
tel.: (8142) 769810
Олейник Виктор Михайлович
старший научный сотрудник, д. б. н.
Институт биологии Карельского научного центра РАН
ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185910
эл. адрес: scigraph@yandex.ru
тел.: (8142) 769810
Головин Андрей Викторович
врач хирург-онколог
ГБУЗ Республиканский онкологический диспансер Лососинское ш., 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185002 эл. адрес: ya-pomorin@yandex.ru тел.: (8142) 764235
Толлер Виктор Артурович
врач-колопроктолог
ГБУЗ Больница скорой медицинской помощи ул. Кирова, 40, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185031 эл. адрес: vtoller@yandex.ru тел.: (8142) 766253
Островский Константин Адольфович
врач-ординатор, к. м. н.
НУЗ Отделенческая клиническая больница
на ст. Петрозаводск
пр. Первомайский, 17, Петрозаводск,
Республика Карелия, Россия, 185001
эл. адрес: aost2@mail.ru
тел.: (8142) 714677
Oleinik, Victor
Institute of Biology, Karelian Research Centre,
Russian Academy of Sciences
11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk,
Karelia, Russia
e-mail: scigraph@yandex.ru
tel.: (8142) 769810
Golovin, Andrey
Republican Oncology Center 11 Lososinskaya St., 185002 Petrozavodsk, Karelia, Russia
e-mail: ya-pomorin@yandex.ru tel.: (8142) 764235
Toller, Victor
Hospital of Emergency Care
40 Kirova St., 185031 Petrozavodsk,
Karelia, Russia
e-mail: vtoller@yandex.ru
tel.: (8142) 766253
Оstrovskü, Konstantin
Department of clinical hospital at station Petrozavodsk, 17 Pervomaiskaya St., 185001 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: aost2@mail.ru tel.: (8142) 714677
