CC BY
9© Коллектив авторов, 2013
Экспрессия генов факторов роста эндотелия сосудов и их рецепторов при различных вариантах течения множественной миеломы
А.К. ГОЛЕНКОВ1, И.В. БУРАВЦОВА1, Г.А. ДУДИНА1, Т.Д. ЛУЦКАЯ1, Т.А. МИТИНА1, Е.В. КАТАЕВА1, А.Ф. КАРАМЫШЕВА2, Е.С. КАКПАКОВА2, Ю.А. САБЛИНА2, А.А. СТАВРОВСКАЯ2
1Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского; 2НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Gene expression of vascular endothelial growth factors and their receptors in different variants of the course of multiple myeloma
A.K. GOLENKOV1, I.V. BURAVTSOVA1, G.A. DUDINA1, T.D. LUTSKAYA1, T.A. MITINA1, E.V. KATAEVA1, A.F. KARAMYSHEVA2, E.S. KAKPAKOVA2, YU.A. SABLINA2, A.A. STAVROVSKAYA2
'M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow; Research Institute of Carcinogenesis, 2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Резюме
Цель исследования. Определить значение активности ангиогенеза, оцениваемой по экспрессии генов факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС) VEGF-A, VEGF-C и VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFRIs, VEGFR2, VEGFR3 в мононуклеарной фракции аспиратов костного мозга (КМ) с преобладанием опухолевых плазматических клеток при различных вариантах течения множественной миеломы (ММ).
Материалы и методы. Определяли экспрессию генов ФРЭС VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFRIs, VEGFR2, VEGFR3 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ).
Результаты. В мононуклеарной фракции аспиратов КМ с преобладанием опухолевых плазматических клеток больных ММ VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, а также VEGFR1, VEGFRIs, VEGFR2, VEGFR3 экспрессировались с различной интенсивностью, что позволило выделить группы больных. В группе с высокой экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов количество кластеров плазматических клеток и эндотелия сосудов в аспиратах КМ, степень остеолиза в костях скелета больных ММ были достоверно выше, чем в группе с низкой экспрессией или в ее отсутствии. Выживаемость в группе с низкой экспрессией или в ее отсутствии была достоверно выше.
Заключение. Исследование позволило дать оценку процессам ангиогенеза при ММ и установить взаимосвязь с клиническими проявлениями и цитологическими характеристиками.
Ключевые слова: ангиогенез, экспрессия генов факторов роста эндотелия сосудов (VEGF) и их рецепторов (VEGFR), множественная миелома, полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ).
Aim. To determine the significance of the angiogenic activity estimated from the gene expression of the vascular endothelial growth factors (VEGFs) VEGF-A, VEGF-C, and VEGF-D and their receptors VEGFR!, VEGFRIs, VEGFR2, and VEGFR3 in the mononuclear cell fraction of bone marrow (BM) aspirates with tumor plasma cells predominating in different variants of the course of multiple myeloma (MM).
Materials and methods. The gene expression of VEGF-A, VEGF-C, and VEGF-D and their receptors VEGFR!, VEGFRIs, VEGFR2, and VEGFR3 was determined by reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results. VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, as well as VEGFR1, VEGFRIs, VEGFR2, and VEGFR3 were expressed showing different intensities in the mononuclear cell fraction of BM aspirates with a predominance of tumor plasma cells in the patients with MM, which allowed patient groups to be identified. In the group of high gene expression of VEGFs and their receptors, the number of clusters of plasma cells and vascular endothelium in the BM aspirates and the degree of osteolysis in the skeletal bones of patients with MM were significantly higher than those in the group of low or absent gene expression. The survival in the latter group was significantly higher.
Conclusion. The investigation could provide an estimate of angiogenic processes in MM and establish their association with clinical manifestations and cytological characteristics.
Key words: angiogenesis; gene expression of vascular endothelial growth factors (VEGF) and their receptors (VEGFR); multiple myeloma; reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR).
КМ — костный мозг ФРЭС — фактор роста эндотелия сосудов
ММ — множественная миелома
ПЦР-ОТ — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
Изучение опухолевого ангиогенеза при множественной ми-еломе (ММ) важно для понимания особенностей патогенеза опухолевого роста, клинических проявлений болезни, ее диагностики и ответа на цитостатическую терапию. Этот вопрос был поставлен ранее в исследованиях, касающихся солидных опухолей
[1—4]. Была сформулирована гипотеза о том, что жизнеспособность микрокластеров опухолевых клеток может обеспечиваться ростовыми факторами микроокружения [5—7]. Однако дальнейший рост опухоли невозможен без формирования опухолевой сосудистой сети [8—11]. В связи с этим при ММ, относящейся к
злокачественным системным В-клеточным лимфопролифера-тивным процессам, некоторые клинические проявления могут быть уточнены при изучении ангиогенной активности опухолевых плазмоцитов [12—14]. Основанием для этого служат клинические данные, указывающие на неоднородный характер опухолевого роста при ММ. У 30% больных ММ за счет экстрадураль-ного роста крупного миеломного узла возникает такой тяжелый клинический синдром, как опухолевая компрессия спинного мозга [15, 16]. Появление видимых опухолей при ММ является закономерным признаком болезни, который может служить критерием эффективной терапии при его уменьшении после лечения [17]. Очаги остеолиза, связанные с узловым типом роста в костном мозге (КМ), также являются признаком болезни и служат одним из критериев для определения ее стадии [18]. Встречаются также формы ММ с диффузным типом опухолевого роста [19]. Это различие клинических вариантов болезни может быть обусловлено изменениями активности ангиогенеза. Результаты исследований свидетельствуют о различной активности генов ан-гиогенеза при ММ и моноклональной гаммапатии неясного ге-неза (МОТО), коррелирующей с различными величинами плотности сосудов КМ по данным иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов КМ [20, 21]. Актуальность данной проблемы подтверждается еще и тем, что исследования ангиоге-неза в солидных опухолях послужили основанием для создания лекарственных препаратов, блокирующих его в опухолевых клетках, которые теперь используют в клинической практике в сочетании с противоопухолевыми препаратами. Современные анти-ангиогенные препараты целенаправленного действия («таргет-ные») могут быть эффективны и у больных ММ с активным анги-огенезом [22].
Цель исследования: установить значение активности ангиогенеза, оцениваемой по экспрессии генов факторов роста эндотелия сосудов (ФРЭС) VEGF-A, VEGF-Cи VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 в мононуклеарной фракции аспиратов КМ с преобладанием опухолевых плазматических клеток при различных вариантах течения ММ.
Материалы и методы
В исследование включили 33 больных (14 мужчин, 19 женщин в возрасте от 37 до 75 лет) с ММ III стадии. Диагноз устанавливали на основании жалоб больных (боли в костях различной интенсивности, в поясничном отделе позвоночника, обусловленные корешковым синдромом). Видимые опухоли имелись у 3 больных. Диагноз подтверждали результатами цитологических исследований аспиратов КМ, в которых выявлялась плазмокле-точная инфильтрация. Всем больным проводили рентгенографию костей скелета в двух проекциях. Генерализованный остео-литический синдром диагностирован у 24 из 33 больных. У 8 пациентов с упорными корешковыми болями выявлен внутриспи-
Сведения об авторах:
Голенков Анатолий Константинович — д.м.н., проф., рук. отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии1 Дудина Галина Анатольевна — к.м.н., н.с. отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии1
Луцкая Татьяна Дмитриевна — к.м.н., с.н.с. отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии1
Митина Татьяна Алексеевна — к.м.н., с.н.с. отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии1
Катаева Елена Васильевна — к.м.н., с.н.с. отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии1
Карамышева Аида Фаудовна — д.б.н., рук. лаб. генетики опухолевых клеток2
Какпакова Евгения Сергеевна — д.б.н., в.н.с. лаб. генетики опухолевых клеток2
Саблина Юлия Александровна — н.с. лаб. генетики опухолевых клеток2
Ставровская Алла Александровна — д.б.н., проф., науч. консультант лаб. генетики опухолевых клеток2
нальный опухолевый рост без симптомов компрессии спинного мозга (по данным магнитно-резонансной томографии позвоночника). Иммунохимическое исследование белков сыворотки крови и мочи выполнили у 31 из 33 больных. Выявленная монокло-нальная секреция парапротеина распределилась следующим образом: Gk — у 15 больных, GA — у 4, GkBJk — у 4, GABJA — у 2, Ak — у 2, AX — у 2, Mk — у 1, BJA — у 1. К началу настоящего исследования 23 пациента были первичными, 9 — резистентными к проводимой ранее цитостатической терапии, у одного зафиксирован рецидив. Индукционный период лечения включал от 6 до 8 курсов цитостатической терапии по протоколу М-2 (циклофос-фан, мелфалан, винкристин, преднизолон, нитрозомочевина). Поддерживающую терапию проводили по протоколу М-2 1 раз в 3 мес. Лечение резистентных и рецидивных больных в дальнейшем проводили с помощью программ, содержащих велкейд, в одном наблюдении использовали ревлимид.
Выделение РНК из клеток КМ. После аспирации клетки костного мозга (ККМ) наслаивали на Ficoll и центрифугировали, после чего на границе раздела фаз отбирали мононуклеарную фракцию клеток ККМ, содержащую преимущественно плазматические клетки. К осадку клеток добавляли Trizol. Выделения РНК проводили согласно стандартному протоколу. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически по поглощению света при длине волны 260 нм. Электрофорез выделенной РНК проводили в 1% агарозном геле с добавлением бромида этидия. Качество выделенной РНК оценивали визуально по наличию полос рибосомальной РНК.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ). Экспрессию мРНК генов, кодирующих (ФРЭС) VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и рецепторы VEGFR1, VEGFRls, VEGFR2 и VEGFR3 определяли методом ПЦР-ОТ на амплифика-торе Терцик («ДНК-технология», Россия). Нуклеотидные последовательности использованных специфических праймеров приведены в таблице. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию ß2-микроглобулина. Продукты ПЦР-ОТ анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромидэтидия. Размеры фрагментов оценивали визуально в соответствии с расположением полос маркерной ДНК. Гель фотографировали при ультрафиолетовом возбуждении с помощью цифровой камеры Samsung CCTV LENZ.
Цитологическая оценка аспиратов КМ больных ММ. При установлении диагноза проводили стандартную цитологическую оценку аспирата КМ, окрашенного по Романовскому (ув. 1000). Затем проводили расширенный анализ аспиратов КМ больных с подсчетом количества плазматических клеток, кластеров плазматических клеток (клеточная структура, содержащая от 3 плазматических клеток) и эндотелия сосудов (однослойный пласт эндо-телиальных клеток, выстилающих участок кровеносного сосуда изнутри) в одном поле зрения (ув. 200). В каждом аспирате КМ произведен подсчет 50 полей зрения, что является репрезентативной выборкой. Для контроля клеточного состава проводили цитологическую оценку полученной мононуклеарной фракции КМ, которая содержала от 74,2 до 93,6% опухолевых плазматических клеток.
Оценка остеодеструктивного процесса в костях скелета больных ММ. Критерии оценки остеолиза разработаны в отделении клинической гематологии и иммунотерапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Для оценки выбирали 4 зоны: череп, ребра, позвоночник, таз. Остеолиз оценивали в баллах: отсутствие очагов остеолиза — 0 баллов, 1 или 2 очага в одной зоне — 1 балл, множественные (> очаги в одной зоне) и/или мягкоткане-вой — 2 балла.
Характеристику распространенности остеолитического процесса получали при суммировании баллов каждой из исследованных рентгенологических зон костной системы (в 2 проекциях). Минимальная оценка составляла 1 балл, максимальная — 8 баллов.
Контактная информация:
Буравцова Иоланта Валентиновна — к.м.н., врач отд-ния клинической гематологии и иммунотерапии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского; тел.: +7(495)631-7315; e-mail: buravtsova70@mail.ru
Нуклеотидные последовательности праймеров
Анализируемый ген Название праймера Последовательность
УЕО¥-А \EGF-F 5'-AGTGGTGAAGTTCATGGATGTC-3'
VEGF-R 5'-TGGTCTATCTTTCTTTGGTCTG-3'
УЕО¥-С VEGFc-F 5'-CAGTTACGGTCTGTGTCCAGTGTAG-3'
VEGFc-R 5'-GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG-3'
УЕО¥-Б Vd-F 5'-TCCAGATCCCTGAAGAAGATCGCTG-3'
Vd-R 5'-ATGCTTTGCACATGCTGTTTTGC-3'
УЕО¥Я1 FLT1-F 5'-CAGCTCCAAATATCTAGCTGTACC-3'
FLT1-R 5'-GAGGACAAGAGTATGGCCTCTAAG-3'
УЕО¥ЯЬ* sFLT1-F 5'-GCACCTTGGTTGTGGCTGCTGAC-3'
sFLT1-R 5'-AATGTTTTACATTACTTTGTGTGG-3'
УЕО¥Я2 KDR-F 5'-ATGGCCTCTTCTGTAAGACACTCAC-3'
KDR-R 5'-AAGAAGGGTATTCCCAGTTGAAGTC-3'
УЕО¥Я3 FG-1s-F 5'-CTTGTCGGTACCGGCGTCATC-3'
FG-3as-R 5'-GAGGATCTTGAGCTCCGACATCAG-3'
В2т А3^ 5'-ACCCCCACTGAAAAAGATGA-3'
В3^ 5'-ATCTTCAAACCTCCATGATG-3'
Статистическую обработку данных проводили определением достоверности методом непрямых разностей (Монцевичюте— Эрингене, 1964). Общую выживаемость больных оценивали с помощью теста Вилкоксона—Гехана. Различия считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
При анализе экспрессии генов ФРЭС УБОГ-А, УЕО¥-С, УЕО¥-Б у больных ММ экспрессия гена ФРЭС УЕО¥-А выявлена у 24 (72,7%), ген УЕО¥-С был экспрессирован у 13 (39%), мРНК фактора роста УЕО¥-Б — у 7(21,2%). Таким образом, мРНК основного ФРЭС УЕО¥-А имелась у большинства больных.
При анализе результатов экспрессии генов рецепторов ФРЭС УЕО¥Я1, УЕО¥ЯЪ, УЕО¥Я2, УЕО¥Я3 экспрессия гена рецептора УЕО¥Я1 была выявлена у 25 (75,7%) больных, ген растворимой формы рецептора УЕО¥ЯЬ — у 27 (81,8%), экспрессия гена УЕО¥Я2 — у 3 (9%), экспрессия гена рецептора УЕО¥Я3 — у 25 (75,7%). Таким образом, экспрессия генов рецепторов УЕО¥Я1, УЕО¥ЯЬ и УЕО¥Я3 выявлена у большинства больных ММ, а экспрессия гена рецептора УЕО¥Я2 встречалась редко.
Представляло интерес проанализировать коэкспрессию генов ФРЭС УЕО¥-А,УЕО¥-С,УЕО¥-В. У 8 (24,2%) больных экспрессия генов ФРЭС не отмечена, ген одного из факторов УЕО¥ был экспрессирован у 8 (24,2%) пациентов, гены 2 факторов УЕО¥ — у 14 (42,4%), у 3 (9%) обнаружена экспрессия генов 3 ФРЭС.
Исходя из полученных результатов можно сделать заключение о достаточно высокой частоте экспрессии генов ФРЭС при ММ: у 51,4% больных обнаружена коэкспрессия 2 или 3 генов исследованных ФРЭС. При изучении коэкспрессии генов рецепторов ФРЭС установлено, что гены УЕО¥Я экспрессированы или коэкспрессированы у всех 33 пациентов. Ген одного из рецепторов экспрессирован у 5 (15,1%) больных, гены 2 рецепторов — у 9 (27,3%), 3 рецепторов — у 17 (51,5%) и 4 рецепторов — у 2 (6%).
Высокая частота экспрессии генов рецепторов ФРЭС УЕО¥Я свидетельствует о том, что опухолевые плазматические клетки, преимущественно содержащиеся в мононуклеарной фракции аспиратов КМ больных ММ, способны отвечать на сигналы факторов роста VEGF, секретируемых либо клетками стромы микроокружения, либо самими плазматическими клетками, тем самым поддерживая активность опухолевого роста.
Исходя из анализа экспрессии и коэкспрессии генов ФРЭС УЕО¥-А, УЕО¥-С, УЕ0¥-0 и их рецепторов УЕО¥Я1, УЕО¥ЯЪ, УЕО¥Я2, УЕО¥Я3 создавались предпосылки для разделения больных на группы по наличию или отсутствию экспрессии. В резуль-
тате мы выделили 2 группы: 24 (72,7%) больных с наличием и/или высокой экспрессией генов («васкулярный» тип) и 9 (27,3%) — с низкой и/или отсутствующей экспрессией («аваскулярный» тип). При этом в «аваскулярной» группе у всех 9 больных ММ отсутствовала экспрессия гена фактора роста УЕО¥-А, который является одним из основных факторов ангиогенеза. Экспрессия гена УЕО¥-С выявлена только у 1 больного этой группы. У этих же больных экспрессия гена фактора УЕО¥-В не определялась. В то же время экспрессия гена рецептора УЕО¥Я1 выявлена у 5 из 9 больных. Высокая частота экспрессии гена растворимой молекулы УЕО¥ЯЬ встречалась у 6 больных из 9. мРНК гена рецептора УЕО¥Я3 обнаружена у 5 больных из 9. При этом следует отметить полное отсутствие в данной группе больных экспрессии гена рецептора УЕО¥Я2 — основного рецептора для УЕО¥-А.
Проведена оценка экспрессии генов в «васкулярной» группе из 24 (72,7%) больных с высокой экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов.
У всех 24 больных этой группы выявлена экспрессия гена фактора УЕО¥-А — одного из основных факторов ангиогенеза. Экспрессия генов факторов УЕО¥-С и УЕО¥-В встречалась в этой группе с меньшей частотой (12 и 7 больных соответственно), причем выявлялись случаи коэкспрессии 2 и 3 факторов. Следует также отметить, что при этом варианте ММ была высокая частота экспрессии и коэкспрессии генов рецепторов УЕО¥Я1, УЕО¥ЯЬ и УЕО¥Я3. Экспрессия гена рецептора УЕО¥Я2 выявлена лишь у 3 из 24 больных.
На основании полученных нами данных составлена логическая модель ангиогенеза при ММ. Опухолевая плазматическая клетка в большинстве случаев характеризуется активной функцией генов ФРЭС, включая ген, кодирующий один из основных ангиогенных факторов, — УЕО¥-А. В результате активной функции гена синтезированный фактор выделяется в окружающую среду, где взаимодействует со своим рецептором VEGFR2, который представлен на эндотелии сосудов микроокружения, что стимулирует образование новых сосудов вокруг плазматической клетки. Подобный рецептор практически не синтезируется на опухолевой плазматической клетке, что подтверждается нашими исследованиями, которые выявили активность этого гена лишь у 9% больных. Это обстоятельство имеет большое биологическое значение, которое заключается в том, что взаимодействие VEGF-A со своими рецепторами не будет блокироваться опухолевой клеткой.
Кроме указанного главного механизма стимуляции ангиоге-неза опухолевыми миеломными клетками, осуществляемого при взаимодействии VEGF-A с VEGFR2, существуют дополнительные механизмы, которые могут усиливать или подавлять ангио-генное воздействие опухолевой клетки на эндотелий сосудов. К
дополнительным факторам, усиливающим ангиогенез, следует отнести VEGF-D, который экспрессировался при ММ у 21,2% больных. Как показали опубликованные исследования, фактор VEGF-D обладает возможностью стимулировать лимфангиоге-нез и рост эндотелия сосудов при взаимодействии с VEGFR2. Аналогичные данные литературы известны и в отношении фактора роста VEGF-C. К факторам, блокирующим стимуляцию ан-гиогенеза опухолевой клеткой, следует отнести экспрессию растворимой формы рецептора VEGFR1s на плазматической клетке, который связывает некоторое количество фактора VEGF-A, конкурируя с расположенным на мембране клетки рецептором VEGFR1 за связывание с VEGF-A. Кроме того, VEGFR1, локализованный на клетках стромы, также будет связывать фактор VEGF-A, снижая его взаимодействие с VEGFR2. Следует отметить, что расположенные на мембранах плазматических и стро-мальных клеток рецепторы VEGFR1 и VEGFR3 могут связываться с экспрессируемыми этими клетками факторами роста семейства VEGF, обеспечивая тем самым аутокринный опухолевый рост.
Достаточно высокая активность экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов свидетельствует о возможности поддержания опухолевого роста как по аутокринному, так и по паракринному механизму. Группа больных с низкой экспрессией генов ФРЭС характеризуется наличием опухолевых плазмоцитов, которые не оказывают ангиогенное воздействие на эндотелий сосудов микроокружения. Однако при наличии в этих опухолевых клетках экспрессии генов рецепторов поддержание их роста может обеспечиваться по паракринному механизму за счет влияния на опухолевую клетку ангиогенных факторов VEGF стромального микроокружения. В связи с этим данный тип ММ не будет характеризоваться интенсивным опухолевым ростом.
Полученные результаты позволяют нам выделить «васкуляр-ный» (с наличием экспрессии генов) и «аваскулярный» (без экспрессии генов) типы ММ как самостоятельные патогенетически обусловленные варианты течения заболевания. Указание на подобные варианты течения болезни имелись и в работе А. Уаеса, D. ШЬаШ [20]. При сравнительном анализе представленных результатов, прежде всего, следует обратить внимание на различие экспрессии генов ангиогенеза у этих групп больных.
Так, в «васкулярной» группе больных ММ мРНК генов факторов VEGF-A, VEGF-C и VEGF-D нам встречалась с частотой 100, 50 и 29,1% соответственно. В то же время у больных «аваскуляр-ной» группы экспрессия аналогичных генов практически отсутствовала и составляла 0, 11,1% и 0 соответственно. В «васкуляр-ной» группе больных частота выявления генов рецепторов VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3 составила 83,3, 95,8, 12,5 и 29,1% соответственно. Следует также отметить меньшую частоту выявления экспрессии генов рецепторов ФРЭС у больных в «ава-скулярной» группе по всем изучаемым рецепторам — VEGFR1, VEGFR1s, VEGFR2, VEGFR3, что составило 55,5, 66,6, 0 и 22,2% соответственно. Исходя из логической модели ангиогенеза, которая может быть сформулирована при анализе полученных данных, можно понять значение исследуемых генов в патогенезе опухолевого роста при ММ. У больных с «васкулярным» типом болезни опухолевые клетки имеют активно функционирующие гены ФРЭС и их рецепторного аппарата. При этом возникают предпосылки для активации пролиферативной активности эндотелия сосудов микроокружения. Кроме того, активный рецеп-торный аппарат этих клеток воспринимает сигналы VEGF клеток стромы и самих опухолевых клеток, вызывая активацию их роста по аутокринному и паракринному механизмам. У больных с «ава-скулярным» типом болезни опухолевые клетки не будут активировать эндотелий стромы микроокружения, а рецепторный аппарат клеток будет взаимодействовать только с фактором роста VEGF, секретируемыми клетками стромы. В этом случае активность данных сигнальных систем будет ниже и в силу своей невысокой активности будет слабее активироваться опухолевый рост по аутокринному и паракринному механизмам.
Клиническая и цитологическая характеристика больных ММ с различной экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов. При цитологической оценке аспиратов КМ в 2 группах больных проведен срав-
Рис. 1. Картина КМ у пациентов с ММ (ув. 200).
а — ММ44; б — ММ11.
нительный анализ результатов подсчета кластеров миеломных клеток.
В группе из 24 больных с «васкулярным» типом количество кластеров миеломных клеток в аспиратах КМ было достоверно больше (3,76+1,16), чем в группе из 9 больных с «аваскулярным» типом (0,48+0,08; р<0,01). Среднее количество эндотелия сосудов в аспиратах КМ было достоверно больше у больных с «васку-лярным» типом ММ, чем у больных «аваскулярным» типом (0,0075+0,001; р<0,001).
При визуальной оценке аспиратов КМ у больных с «васку-лярным» типом определялись большие кластеры плазматических клеток как с эндотелием сосудов, так и без него (рис. 1, а), тогда как у больных с «васкулярным» типом выявлялись поля кластеров плазматических клеток без эндотелия сосудов. На рис. 1, б отражена картина КМ пациента с ММ «васкулярный» тип, где определяется большой кластер плазматических клеток с эндотелием сосуда внутри кластера.
В связи с высоким количеством кластеров опухолевых клеток в аспиратах КМ больных с коэкспрессией генов VEGF и их рецепторов представляло интерес проанализировать интенсивность остеолиза у этих больных. При оценке остеолитического процесса в костях скелета интенсивность остеолиза у больных с «васкулярным» типом была значительно выше, чем у больных с
«аваскулярным» типом течения ММ: в среднем 1,76+0,12 и 0,8+0,31 балла (р<0,06).
При сравнении выживаемости в 2 группах выявлены статистически значимые различия (рис. 2). У больных с «аваскуляр-ным» типом выживаемость составила 67 мес, что достоверно выше, чем больных с «васкулярным» типом течения — 29 мес (р<0,05).
Заключение
Полученные данные отражают высокую значимость для диагностики, расширения знаний о патогенезе ММ и свидетельствуют, что мононуклеарная фракция КМ с преимущественным содержанием опухолевых плазматических клеток у больных ММ характеризуется различной степенью экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов. Установлена высокая экспрессия растворимой формы молекулы гена УEО¥Я1s. Интегральная оценка полученной экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов позволила разделить больных на 2 группы с высокой и низкой активностью генов. У больных с наличием экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов количество кластеров и эндотелия сосудов в аспиратах КМ больных ММ достоверно выше, чем у больных с низкой экспрессией их или в их отсутствие. Данные исследования позволяют расширить возможности цитологической диагностики ММ за счет включения в оценку аспиратов КМ подсчета количества кластеров плазматических клеток и эндотелия сосудов. Повышенное количество кластеров, наличие эндотелия сосудов в аспиратах может быть предиктором тяжелого течения болезни. Остеодеструктивный процесс в костях скелета больных ММ у больных с экспрессией генов ФРЭС и их рецепторов достоверно выше, чем у больных с низкой их экспрессией. «Аваскулярный» тип ММ (с низкой активностью экспрессии исследованных генов) имел большую медиану общей выживаемости, чем «васку-лярный» тип (с наличием экспрессии).
1-я группа (n=24)
2-я группа (n=9)
100 90 80 70 ^ 60
со 50
О
40 30 20 10 0
Медиана 29 p<0,05
Ljb Мед
Медиана 67
СН
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Рис. 2. Выживаемость в 2 группах больных ММ с различной экспрессией генов.
Таким образом, исследование позволило дать оценку процессам ангиогенеза при ММ и установить взаимосвязь с клиническими проявлениями и цитологическими характеристиками. Оценку экспрессии генов ФРЭС и их рецепторов при ММ следует проводить для более полной диагностики заболевания. Введение новой оценочной категории в описательную часть миело-граммы при ММ (подсчет кластеров опухолевых плазматических клеток и эндотелия сосудов) позволяет определить прогноз заболевания и она может быть рекомендована к применению в широкой клинической практике.
ЛИТЕРАТУРА
1. Голенков А.К., Шабалин В.Н. Множественная миелома. СПб: Гиппократ 1995; 144.
2. Карамышева А.Ф. Ангиогенез опухоли: механизмы, новые подходы к терапии. В кн.: Канцерогенез. Под ред. Д.Г. За-ридзе М: Медицина 2004: 429—447.
3. Bakkus M.H., Van Riet I., Van Camp B. et al. Evidence that the clonogenic cell in multiple myeloma originates from a pre-switched but somatically mutated B cell. Br J Haematol 1994; 87: 68—74.
4. Bellamy W.T., Richter L, Frutiger Y. et al. Expression of vascularnbendothelial growth factor and its receptors in hematopoietic malignancies. Cancer Res 1999; 59: 728—733.
5. CarmelietP. Mechanism of angiogenesis. Nat Med 2000; 6: 389— 395.
6. Dvorak H.F. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy. J Clin Oncol 20024; 20: 4368—4380.
7. Ferrara N. The role of vascular endothelial growth factor in pathological angiogenesis. Breast Cancer Res Treatment 1995; 36: 127—137.
8. Ferrara N, Gerber H.P. The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis. Acta Haematol 2001; 106: 148—156.
9. Ferrara N, GerberH.P., LeCouter J. The Biology ofVEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669—676.
10. Folkman J. Wath is evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Nat Cancer Inst 1990; 82: 4—6.
11. Folkman J. Angiogenesis. J Clin Oncol 1994; 4: 441—443.
12. Kumar S., Fonseca R., Dispenzieri A. et al. value of angiogenesis in solitary bone plasmacytoma. Blood 2003; 101: 1715—1717.
13. Kumar S., Witzig T.E., Timm M. et al. Expression of VEGF and its receptors by myeloma cells. Leukemia 2003; 17: 2025—2031.
14. Kyle R.A. Prognostic factors in multiple myeloma. Stem Cell 1995; 2: 56—63.
15. Kyle R.A., Raj Kumar S.V Multiple myeloma. N Engl JMed 2004; 351: 1860—1873.
16. Rajkumar S.V., Greipp P.R. Prognostic factors in multiple myeloma. Hematol Oncol Clin North Am 1999; 13: 1295—1314.
17. Rajkumar S.V., Kyle R.A. Angiogenesis in multiple myeloma. Semin Oncol 2001; 28: 560—564.
18. Rajkumar S.V., Mesa R.A., Fonseca R. et al. Bone marrow angiogenesis in 400 patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance, multiple myeloma, and primary amyloidosis. Clin Cancer Res 2002; 8: 2210—2216.
19. Rajkumar S.V., Kyle R.A. Multiple Myeloma: diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc 2005; 80: 1371 — 1382.
20. Vacca A., Ribatti D., Roncali L. et al. Bone marrow angiogenesis and progression in multiple myeloma. Br J Haematol 1994; 87: 503—508.
21. Vacca A., Ribatti D. Bone marrow angoiogenesis in multiple myeloma. Leukemia 2006; 20: 193—199.
22. Vacca A., Ribatti D. Angiogenesis and antiangiogenesis in patients with multiple myeloma. EHA 2011, Hematology Education 5: 273—279.
Поступила 13.05.2013
