CC BY
52
КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ЭКСПРЕССИЯ мРНК ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА... 17
УДК 616-006.448:575.117.2:576.385.5
И.В. Буравцова1, Н.Н. Калитин2, Ю.А. Саблина2, Е.С. Какпакова2', А.Ф. Карамышева2,
А.А. Ставровская2, А.К. Голенков1
ЭКСПРЕССИЯ мРНК ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА СЕМЕЙСТВА VEGF И ИХ РЕЦЕПТОРОВ У БОЛЬНЫХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ:
СОПОСТАВЛЕНИЕ С ЦИТОЛОГИЧЕСКИМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ КОСТНОГО МОЗГА
1МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Карамышева Аида Фуадовна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-17-69 e-mail: aikaram@vandex.ru
Статья поступила 09.06.2009, принята к печати: 05.10.2009.
Резюме
Экспрессия мРНК генов факторов роста эндотелия сосудов VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и их рецепторов VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 в аспиратах костного мозга 33 больных множественной миеломой была сопоставлена с некоторыми цитологическими показателями (количеством плазматических клеток, соотношением количества лимфоцитов и плазматических клеток). У большинства исследованных больных сигнальные системы УБОР-А/УБОРК1 и VEGF-QVEGF-D/VEGFR3 были независимыми, поскольку у них отсутствовала экспрессия мРНК гена VEGFR2, кодирующего общий для изучаемых факторов роста рецептор. Показано, что в группах больных, у которых выявлена коэкспрессия генов, кодирующих мРНК факторов роста и рецепторов как VEGFR1-, так и VEGFR3-зависимых сигнальных систем, снижено количество плазматических клеток и повышен показатель соотношения количества лимфоцитов и плазматических клеток.
Ключевые слова: множественная миелома, экспрессия генов, факторы роста эндотелия сосудов (VEGF), рецепторы факторов роста эндотелия сосудов (VEGFR).
I.V. Buravtsova1, N.N. Kalitin2, Yu.A. Sablina2, E.S. Kakpakova2, A.F. Karamysheva2,
A.A. Stavrovskaya2, A.K. Golenkov1
VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTORS
AND THEIR RECEPTORS GENE EXPRESSION IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS: COMPARISON WITH THE BONE MARROW CYTOLOGICAL CHARACTERISTICS
'M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Vascular endothelial growth factors VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D and their receptors VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 gene expression in bone marrow aspirates of 33 multiple myeloma patients was compared with several cyto-logical characteristics (the quantity of plasma cells, the lymphocytes/plasma cells ratio). The VEGF-А/VEGFR1 and VEGF-С, VEGF-D/VEGFR3 signal systems were independent in most patients studied because of the absence of VEGFR2 gene expression, coding the common for the two signal systems receptor. The reduced number of plasma cells and the higher lymphocytes/plasma cells ratio in groups of patients which are characterized by co-expression of genes coding growth factors and receptors for both signal systems studied were found.
Key words: multiple myeloma, gene expression, vascular endothelial growth factors (VEGF), vascular endothelial growth factor receptors (VEGFR).
Введение
Множественная миелома - это лимфопролиферативное заболевание, при котором происходит злокачественная пролиферация клона плазматических клеток в костном мозге, сопровождающаяся секрецией моноклонального иммуноглобулина. Плазматические клетки образуются в результате нормального В-клеточ-ного лимфопоэза. В периферических лимфоидных органах происходит активация и клональная пролиферация В-клеток, часть которых дифференцируется в ко-роткоживущие плазматические клетки (продуцирующие в основном IgM), а часть - в центробласты. В зародышевом центре лимфоузла В-клетки претерпевают несколько изменений, в том числе изотипическое переключение с синтеза ранее продуцируемого IgM на синтез IgA, IgD или ^ [1; 7].
Множественная миелома - медленно пролиферирующая опухоль. Плазматические клетки находятся в основном в Go фазе клеточного цикла, а в 8-фазе находится лишь 1-3%.
Ответ на лечение, длительность фазы терапевтического плато и выживаемость больных с множественной миеломой зависят от пролиферативной активности плазматических клеток [3]. При низком пролиферативном индексе ответ на лечение появляется медленнее, но фаза терапевтического плато и выживаемость дольше. При высоком (>3 %) - наоборот. По имеющимся литературным данным, активность течения множественной миеломы также коррелирует с процентом плазматических клеток в костном мозге (< или >10 %), с их морфологией и др. показателями. В образцах нормального костного мозга плазматических клеток очень мало.
Известно, что плазматические клетки секре-тируют один из важнейших ангиогенных факторов -фактор роста эндотелия сосудов VEGF [2], а также рецепторы VEGFR1 [9], VEGFR2 (в незначительной степени) [9], и VEGFR3 [11]. С другой стороны, стромальные клетки (стволовые клетки гематопоэза, фибробласты, остеобласты/остеокласты, клетки эндотелия и их предшественники), составляющие микроокружение плазматических клеток, секретируют взаимодействующие с рецептором VEGFR3 факторы роста VEGF-C и VEGF-D [11].
Таким образом, экспрессия факторов роста семейства VEGF и их рецепторов самими плазматическими клетками и их микроокружением в комплексе может обеспечивать как аутокринную (за счет взаимодействия VEGF-А с рецептором VEGFR1), так и паракринную (через взаимодействие VEGF-C и VEGF-D с рецептором VEGFR3) стимуляцию размножения плазматических клеток.
Сравнение некоторых показателей ангиогенеза у больных ММ и пациентов с моноклональной гаммапатией с неопределенной значимостью (MGUS) показало, что существует корреляция между активностью ангиогенеза и прогрессией этого заболевания. Иммуногистохимическое окрашивание биопсий костного мозга выявило, что у пациентов с ММ увеличено количество капилляров по сравнению с больными MGUS.
Уровень ангиогенной активности плазматических клеток пациентов с ММ также оказался повышенным [12; 13]. Повышенное количество капилляров в биопсиях костного мозга пациентов с ММ связывают также с плохим прогнозом, оцениваемым такими клиническими показателями как общая продолжительность жизни и продолжительность периода жизни без рецидивов [8; 10]. Все эти данные в целом указывают на важную роль оценки уровня ангиогенной активности у пациентов с ММ.
Основная задача нашей работы состояла в оценке уровня активности генов, кодирующих основные факторы роста эндотелия сосудов (VEGF) и их рецепторы (VEGFR) у больных множественной миеломой на стадии постановки диагноза и сопоставлении этих данных с некоторыми цитологическими характеристиками с целью выделения групп больных, различающихся по этим показателям. В работе исследовалась экспрессия мРНК генов VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3, а также гена VEGFRls, кодирующего растворимую форму рецептора VEGFR1, в аспиратах костного мозга, полученных от пациентов с ММ.
Результаты сопоставлялись с такими цитологическими характеристиками аспиратов костного мозга как количество плазматических клеток и соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток.
Материалы и методы
В работе исследовались данные о группе из 33 больных (15 мужчин и 18 женщин), у всех пациентов была диагностирована множественная миелома III стадии (табл. 1). Возраст пациентов составлял от 37 до 75 лет. Диагноз «множественная миелома» устанавливался на основании плазмоклеточной инфильтрации костного мозга, иммунохимического исследования сыворотки крови и мочи, рентгенологических данных. Стадирование на момент диагностики проводили по общепринятой системе Durie
B.G.M. и Salmon S.E. [5]. Класс и тип легких цепей патологического иммуноглобулина (PIg) был опре-
делен у 27 пациентов. Иммунохимическая характеристика Pig установила, что у ll пациентов секрети-руется Pig G kappa (G^, у 3 пациентов - Pig G lambda (GX), у 5 пациентов - Pig G kappa/Bj kappa ^кЖк), у 1 пациента - Pig Bj lambda (BJX), у 2 пациентов - Pig G lambda/Bj lambda (GX/BJX), у 2 пациентов - Pig A lambda (AX), у 2 пациентов - Pig А kappa (Ак) и у одного пациента была определена секреция Pig М kappa (Мк).
Выделение РНК из клеток костного мозга и электрофорез
Для исследования экспрессии генов у больных собирали костно-мозговой пунктат (аспират), из которого в дальнейшем выделяли РНК. С этой целью клетки костного мозга наслаивали на 3 мл Ficoll и центрифугировали при 1500 об/мин, 30 мин., после чего на границе раздела фаз отбирали мононуклеар-ную фракцию клеток костного мозга, содержащую плазматические клетки. Далее отобранные клетки переносили в пробирку с 8 мл раствора Эрла и пере-осаждали центрифугированием при 1500 об/мин, 10 мин. и отмывали в 2-3 мл раствора Эрла. К осадку клеток добавляли 1 мл тризола (Trizol, «Sigma», США). Процедуру выделения РНК проводили согласно стандартному протоколу. Электрофорез выделенной РНК проводили в l% агарозном геле при 100 В в течение 30-40 мин. Качество выделенной РНК оценивали по наличию полос рибосомальной РНК. Концентрацию РНК определяли по оптическому поглощению при длине волны 260 нм.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)
Экспрессию мРНК генов, кодирующих факторы роста эндотелия сосудов VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D и рецепторы VEGFR1, VEGFRls, VEGFR2 и VEGFR3, определяли полуколичественным методом ОТ-ПЦР. Реакционная смесь для синтеза кДНК содержала 4 мкг тотальной клеточной РНК, 4 мкл «случайных» праймеров (гексануклеотиды) (фирма «Ли-тех», Россия), 2 мМ смеси dNTP («MBi Fermentas»), 2-4 ед. ингибитора РНКаз («MBi Fermentas»), 100 ед. обратной транскриптазы M-MuLV («MBi Fermentas»). Объем смеси составлял 25 мкл. Синтез кДНК с матрицы РНК проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) со следующими параметрами: обратная транскрипция - 42 °С, 50 мин; денатурация - 94 °С, 5 сек. Для наработки продуктов ПЦР составляли реакционную смесь, содержащую: l мкл раствора кДНК; 20 пкмоль каждого из праймеров; 2мМ смеси dNTP («MBi Fermentas»); 2,5 мкл 10-кратного буфера с (NH4)2SO4 («MBi Fermentas»), 25 мМ MgCl2;
1 ед. Taq-ДНК полимеразы; Н2О до конечного объема 25 мкл; минерального масла - 30 мкл. Нуклеотидные последовательности использованных специфических праймеров приведены в табл. 2. Реакцию амплификации проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по следующей схеме: денатурация - 94 °С, 10 сек; аннилинг - Tm, 10 сек; синтез - 72 °С, 20 сек. значения температуры Tm и количество циклов ПЦР для каждого из генов приведены в табл. В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определяли экспрессию Р2-микроглобулина. Продукты реакции ОТ-ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Размеры фрагментов оценивали в соответствии с расположением полос маркерной ДНК. Гель фотографировали при ультрафиолетовом возбуждении с помощью цифровой камеры «Samsung CCTV LENZ».
Таблица 1
Цитологические характеристики больных множественной миеломой ____________________________________
№ п/п Образцы аспиратов костного мозга Тип Р^ Кол-во лимфоцитов Кол-во плазм. клеток (пл.кл.) Соотношение кол-ва лимф./пл.кл.
1. ММ1 вк н.о.* 23,3 н.о.
2. ММ2 Ак н.о. 22,8 н.о.
3. ММ3 вк н.о. 35,4 н.о.
4. ММ4 вх/вл 8,2 13,4 0,61
5. ММ5 вХ 12,0 22,2 0,54
6. ММ6 н.о. н.о. 34,5 н.о.
7. ММ7 вк н.о. 44,0 н.о.
8. ММ8 вк 8,6 85,8 0,10
9. ММ10 н.о. н.о. 88,0 н.о.
10. ММ11 вк/Шк 8,8 56,6 0,16
11. ММ12 н.о. 15,4 39,6 0,39
12. ММ13 вк н.о. 34,0 н.о.
13. ММ15 Мк 17,0 51,2 0,33
14. ММ17 Ак 5,4 60,6 0,09
15. ММ18 н.о. 10,2 56,0 0,18
16. ММ19 вх 15,6 24,4 0,64
17. ММ23 вк/Шк 12,6 31,0 0,41
18. ММ25 н.о. 11,2 23,0 0,49
19. ММ29 вк/ Б1к 2,2 85,0 0,03
20. ММ34 АХ 20,0 25,0 0,80
21. ММ35 вХ/Б1Х 5,0 12,0 0,42
22. ММ36 вк 25,0 50,8 0,49
23. ММ37 вк/Б1к 9,5 31,4 0,30
24. ММ38 вк 6,0 53,4 0,11
25. ММ39 вк 7,8 48,0 0,16
26. ММ40 Б1Х 8,1 25,2 0,32
27. ММ41 АХ 5,4 69,2 0,08
28. ММ44 вх 9,4 43,6 0,22
29. ММ52 вк н.о. 37,0 н.о.
30. ММ57 вк 6,2 69,0 0,09
31. ММ58 вк 5,9 69,0 0,09
32. ММ62 н.о. н.о. 22,0 н.о.
33. ММ64 вк/Б1к 5,0 87,8 0,06
н.о. - не определяли
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности специфичных праймеров к генам, размер продукта, температура отжига праймеров и количество циклов, используемых в ПЦР___________________________________________________
Ген Название праймера Нуклеотидная последовательность Размер продукта, пары оснований Температура отжига праймера Кол-во циклов
УБвР-А УБвР-Р УБвР-Я 5’-АвТООТОААОТТСАТООАТОТС-3 ’ 5’-ТООТСТАТСТТТСТТТООТСТО-3’ 295 п.о. 56°С 26
УБвР-С УБвРс-Р УБвРс-Я 5’-САОТТАСООТСТОТОТССАОТОТАв-3 ’ 5’-ООАСАСАСАТООАООТТТАААОААв-3’ 300 п.о. 60°С 30
УБвР-Б уа-Р уа-я 5 ’ -ТССАОАТСССТОААОААОАТСОСТО-3’ 5’-АТОСТТТОСАСАТОСТОТТТТвС-3’ 387 п.о. 61°С 34
УБвРЮ РЬТ1-Р РЬТ1-Я 5 ’ -САОСТССАААТАТСТАвСТОТАСС-3 ’ 5’-ОАООАСААОАОТАТООССТСТААв-3’ 436 п.о. 60°С 33
УБвРЯ! * 8РЬТ1-Р 8РЬТ1-Я 5’-ОСАССТТООТТОТООСТОСТвАС-3 ’ 5’-ААТОТТТТАСАТТАСТТТОТОТОв-3’ 510 п.о. 62°С 35
УБОРЯ2 КБЯ-Р КБЯ-Я 5’-АТООССТСТТСТОТААвАСАСТСАС-3 ’ 5 ’ -ААОААОООТАТТСССАОТТОААвТС-3’ 556 п.о. 54°С 30
УБвРЯЗ Рв-^-Р Рв^-Я 5’-СТТОТСООТАССООСвТСАТС-3 ’ 5’ -ОАООАТСТТОАОСТССОАСАТСАв-3’ 366 п.о. 60°С 32
В2т А3-Р Б3-Я 5 ’ -АСССССАСТОАААААвАТОА-3 ’ 5 ’-АТСТТСАААССТССАТвАТв-3’ 114 п.о. 59°С 22
*Нуклеотидная последовательность праймеров для гена УБвРЯ! взята из статьи [4]
Статистическая обработка данных
Статистическая обработка выполнена с помощью компьютерных программ Microsoft Excel и OriginPro 7.5. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия Манна-Уитни, различия считались достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
В работе была исследована экспрессия мРНК генов семейства факторов роста эндотелия сосудов VEGF (VEGF-А, VEGF-С и VEGF-D) и их рецепторов VEGFR (VEGFR1, растворимой формы рецептора VEGFRls, VEGFR2 и VEGFR3) в мононукле-арной фракции клеток аспиратов костного мозга 33 больных ММ (см. табл. 1).
Общая характеристика экспрессии генов
Содержание мРНК каждого из исследованных генов колебалось у разных больных в широких пределах. Наиболее высокой была экспрессия VEGF-А, VEGFR1 и VEGFRls. мРНК VEGF-А была экспрессирована у всех исследованных больных, причем уровень ее экспрессии был достаточно высоким практически во всех образцах. мРНК VEGFR1 и VEGFRls была выявлена, соответственно, у 29/33 (88 %) и 30/33 (91 %) больных, при этом достаточно высокие уровни экспрессии мРНК VEGFR1 наблюдались у 26/33 (79 %) больных, а мРНК VEGFR1s - у 19/33 (58 %) больных. Уровни экспрессии мРНК генов факторов роста VEGF-С и VEGF-D были более низкими, чем VEGF-А, и у значительной части больных (у 10/33 или 30 % для VEGF-С и у 12/33 или 36 % для VEGF-D) экспрессия этих генов в наших условиях не была обнаружена. мРНК гена рецептора VEGFR3 также экспрессировалась на более низком уровне, чем генов VEGFR1 и VEGFR1s, мРНК этого гена не обнаружена у 4/33 (12 %) больных, а мРНК гена VEGFR2 была выявлена только у 3/33 (9 %) больных.
Отсутствие детектируемой мРНК гена, кодирующего этот рецептор, в мононуклеарной фракции клеток костного мозга большей части больных ММ указывает на то, что у этих больных сигнальные системы VEGF - A/VEGFR1 и VEGF-QVEGF-D/VEGFR3 являются независимыми.
Рецептор VEGFR2 является единственным общим рецептором для всех 3 факторов роста VEGF-А, VEGF-С и VEGF-D, и в отсутствие этого рецептора фактор роста VEGF-А специфически связывается только с рецептором VEGFR1, а факторы роста VEGF-С и VEGF-D взаимодействуют только с рецептором VEGFR3. Таким образом, можно отдельно оценивать роль каждой из этих систем в размножении клеток, входящих в мононуклеарную фракцию, и в развитии заболевания. Сопоставление экспрессии генов с некоторыми цитологическими характеристиками аспиратов костного мозга больных множественной миеломой.
В качестве цитологических характеристик, с помощью которых оценивалось состояние больных, были выбраны такие показатели как количество плазматических клеток в мононуклеарной фракции аспиратов костного мозга и соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток. Численные значения выбранных характеристик колебались в значительных пределах. Так, количество плазматических клеток у различных больных составляло от
12 % до 88 %, а соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток - от 0,03 до 0,80 (см. табл. 1). Сопоставление между собой этих двух цитологических показателей выявило достаточно высокую степень корреляции между ними, описываемую экспоненциальной кривой с коэффициентом регрессии Я2 = 0,798 (рис. 1). Коэффициент отрицательной корреляции между этими показателями составил - 0,83. Таким образом, у больных с более высоким количеством плазматических клеток соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток снижено, что указывает на преимущественное размножение пула плазматических клеток.
y = 1,1215e-0,0352x R2 = 0,79В
0 20 40 60 80 100
Количество плазматических клеток
Рис. 1. Корреляция между количеством плазматических клеток и соотношением количества лимфоцитов/плазматических клеток: уравнение, описывающее полученную кривую; Я - коэффициент регрессии.
Коэкспрессия мРНК генов УБЄБ-А и УБОЖЯЇ
Коэкспрессия генов того или иного фактора роста и его рецептора свидетельствует в пользу того, что в клеточной популяции может функционировать аутокринная или паракринная стимуляция размножения клеток с участием этой системы. Мы сопоставили наличие или отсутствие коэкспрессии мРНК генов VEGF-А и VEGFR1 с цитологическими характеристиками больных ММ. Для этого было выделено 2 группы больных, различающихся по содержанию мРНК VEGF-А и VEGFR1 (рис. 2А-Б). Поскольку ген фактора роста VEGF-А был экспрессирован, в большей или меньшей степени, у всех больных, группы различались, в основном, по содержанию мРНК VEGFR1:
— в группу I вошли больные с высоким содержанием мРНК VEGFR1 и VEGF-А (рис. 2А),
— в группу II вошли больные, у которых мРНК рецептора VEGFR1 отсутствовала или ее количество было очень невелико (рис. 2Б).
Количества плазматических клеток и значения соотношения количества лимфоцитов и плазматических клеток у больных, вошедших в эти группы, приведены на рис. 3А-Б. При подсчете средних значений клинических показателей в этих группах оказалось, что в группе I несколько снижено среднее количество плазматических клеток и повышено среднее количество лимфоцитов (табл. 3). Показатель соотношения лимфоцитов и плазматических клеток в группе I оказался статистически достоверно выше, чем в группе
II. Растворимая форма рецептора УБвЕИ! (УБвЕИ^) также связывается с УБвР-А, но поскольку эта форма не является трансмембранным рецептором, она не передает сигнал фактора роста в клетки эндотелия и фактически является конкурентным ингибитором рецептора УБвЕЯ1. В нашем исследовании не было найдено корреляций между уровнями экспрессии гена VEGFR1s и генов VEGFR1 или VEGF-А, также не было обнаружено корреляций между экспрессией этого гена и какими-либо клиническими показателями, исследовавшимися в нашей работе.
КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ЭКСПРЕССИЯ мРНК ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА... 21
Группа I
Рис. 2. Экспрессия генов фактора роста VEGF-А и его рецепторов VEGFR1 и VEGFRls в группах I и II: А - больные с высоким уровнем коэкспрессии генов VEGF-А, VEGFR1и VEGFRls;
Б - больные, у которых отсутствует коэкспрессия генов VEGF-А, VEGFR1 и VEGFRls.
А
Группа! Группа!!
Группы больных
1,4
1,2
ї 1,0
3
2 0,8
)
j 0,6 І 0,4-= 0,20,0-0,2
Б
тг
Группы больных
Рис. З. Цитологические показатели в группах больных ММ, различающихся по уровню коэкспрессии мРНК
VEGF-A и VEGFRl:
значения количества плазматических клеток (А) и соотношения количества лимфоциты/плазматические клетки (Б) у отдельных больных, медианы распределений и среднеквадратичные отклонения.
Группа I. Больные с высоким уровнем коэкспрессии; Группа II. Нет коэкспрессии.
Таблица 3
Сопоставление цитологических характеристик больных ММ в группах, различающихся по коэкспрессии мРНК генов VEGF-А и VEGFRl
80
40
20
Группы Плазматические к-ки Лимфоциты Соотношение лимф./пл.кл.
I 31,04±12,68 14,24±6,82 0,48±0,17
II 55,53±28,40 6,84±5,11 0,19±0,25
Статистическая значимость - - р < 0,05
Таблица 4
Сопоставление цитологических характеристик больных ММ в группах, различающихся по коэкспрессии мРНК генов VEGF-С, VEGF-D и VEGFR3_____________________________________________________________________
Группы Плазматические к-ки Лимфоциты Соотношение лимф./пл.кл.
III 40,22±13,08 9,93±2,80 0,28±0,14
IV 67,17±20,61 7,28±2,89 0,14±0,13
Статистическая значимость р < 0,01 р < 0,05 р < 0,05
Однако можно отметить, что в группе из 4-х больных, характеризующихся наиболее высокими уровнями экспрессии генов VEGF-А и VEGFR1, экспрессия гена VEGFRls была несколько снижена.
Сопоставление коэкспрессии мРНК генов VEGF-С, VEGF-D и VEGFR3
Для оценки возможной взаимосвязи между активностью сигнальной системы VEGF-QVEGF-D/VEGFR3 и клеточным составом аспиратов костного мозга пациентов с множественной миеломой, так же как и в случае с фактором роста VEGF-А и рецептором VEGFR1, все больные были разделены на
2 группы. В группу III вошли больные с высоким уровнем экспрессии мРНК гена VEGFR3, одновременно экспрессирующие мРНК хотя бы одного из факторов роста VEGF-С или VEGF-D (рис. 4 А); в группу IV вошли больные, у которых отсутствовала экспрессия мРНК либо гена рецептора VEGFR3, либо обоих взаимодействующих с этим рецептором факторов роста (рис. 4 Б). Количества плазматических клеток и значения соотношения количества лимфоцитов и плазматических клеток у больных, вошедших в эти группы, приведены на рис. 5А-Б.
Из данных, приведенных в табл. 4, видно, что в случае отсутствия коэкспрессии мРНК генов VEGF-С,VEGF-D/VEGFR3 у больных повышено среднее количество плазматических клеток, снижено среднее количество лимфоцитов и более низкий показатель соотношения лимфоциты/ плазматические клетки. Все эти различия оказались статистически значимыми.
Представлялось интересным сравнить между собой по уровням экспрессии мРНК группы, характеризующиеся крайними значениями исследуемых цитологических характеристик. Так, мы выделили для сравнения группу больных, у которых количество плазматических клеток не превышает 25 (10 человек) и, группу, в которой это количество больше 60 (8 человек; табл. 5). Аналогично, для показателя соотношения количества плазматических клеток и лимфоцитов были выделены группы с показателем менее 0,1 (7 человек) и более 0,49 (8 человек; табл. 6). Прежде всего, можно отметить, что, как видно из данных, приведенных в табл. 5 и 6, в группу с высоким количеством плазматических клеток и в группу с низким показателем соотношения, за небольшим исключением, входят практически одни и те же больные.
Группа III
А
Группа IV
Б
Рис. 4. Экспрессия генов факторов роста VEGF-C, VEGF-D и их рецептора VEGFR3 в группах III и IV: А - больные с высоким уровнем коэкспрессии генов VEGF-C, vEGF-D и VEGFR3;
Б - больные, у которых отсутствует коэкспрессия генов VEGF-C, VEGF-D и VEGFR3.
А
Группа!!! Группа^
Группы больных
o, 8
o, 7
o,6
ь o, 5 І o,4 g
a! o,3
І °'2 I o,i o,o -o,i
Б
і
Группа!!! Группа^
Группы больных
so
6o
4o
2o
Рис. 5. Цитологические показатели в группах больных ММ, различающихся по уровню коэкспрессии мРНК
VEGF-C, VEGF-D и VEGFR3:
значения количества плазматических клеток (А) и соотношения количества лимфоциты/плазматические клетки (Б) у отдельных больных, медианы распределений и среднеквадратичные отклонения.
Группа III. Больные с высоким уровнем коэкспрессии; Группа IV. Нет коэкспрессии.
Таблица 5
Группы больных с наиболее высокими и низкими показателями количества плазматических клеток_________
Количество плазматических клеток
№ > 60 < 25
п/п Пациент Группа Плазматические к-ки Пациент Группа Количество пл. кл.
1. ММ8 IV 85,8 ММ1 I 23,3
2. ММ10 - 88,0 ММ2 - 22,8
3. ММ17 II, IV 60,6 ММ4 - 13,4
4. ММ29 II 85,0 ММ5 III 22,2
5. ММ41 69,2 ММ13 III 24,0
6. ММ57 IV 69,0 ММ19 II 24,4
7. ММ58 IV 69,0 ММ25 I 23,0
8. ММ64 II, IV 87,8 ММ34 I 25,0
9. - - - ММ35 I 12,0
10. - - - ММ62 II 22,0
Группы больных с наиболее высокими и матических клеток Таблица 6 низкими показателями соотношения количества лимфоцитов и плаз-
№ п/п Соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток
< 0,10 > 0,50
Пациент Группа Лимф./пл.кл. Пациент Группа Лимф./пл.кл.
1. ММ8 IV 0,10 ММ4 0,61
2. ММ17 II, IV 0,09 ММ5 III 0,54
3. ММ29 II 0,03 ММ15 I 0,52
4. ММ41 0,08 ММ19 II 0,64
5. ММ57 IV 0,10 ММ23 IV 0,55
6. ММ58 IV 0,09 ММ25 I 0,52
7. ММ64 II, IV 0,06 ММ34 I 0,80
8. - - - ММ36 I 0,49
Группы больных, характеризующихся относительно небольшими количествами плазматических клеток и низким показателем соотношения, совпадают наполовину (5 больных входят как в ту, так и в другую группу). Из табл. 5 также видно, что 6/10 пациентов с низким количеством плазматических клеток (< 25) характеризуются высоким уровнем коэкспрессии мРНК генов (группы I или III). К этим же группам относятся 5/8 пациентов, у которых соотношение количества лимфоцитов и плазматических клеток 0,50 (табл. 6). И напротив, 6/8 пациентов с наиболее высоким количеством плазматических клеток характеризуются отсутствием коэкспрессии (группы II или IV). Аналогично, 6/7 пациентов с соотношением количества лимфоцитов и плазматических клеток 0,10 также относятся к группам II или IV. Анализируемые в нашей работе клеточные составы мононуклеарных фракций клеток аспиратов костного мозга, полученные от больных множественной миеломой, представляют собой сложную смесь различных типов клеток, в состав которой наряду с клетками кроветворения входят также стромальные клетки (остеобласты, фибробласты, клетки эндотелия). Количество стромальных клеток очень невелико, не более 2 % от общего числа клеток, однако эти клетки могут играть важную роль в паракринной регуляции размножения плазматических клеток. В работе Vacca А. й а1. [11] авторы показали, что плазматические клетки преимущественно экспрессируют фактор роста 'УБвГ-А (экспрессия факторов роста 'УБвР-В, 'УБвР-С и 'УБвГ-Б была незначительна) и рецептор "УБвГЮ. В то же время стромальные клетки экспрессируют факторы роста 'УБвР-С и 'УБвГ-Б, а также рецепторы "УЕОБ^ (клетки эндотелия) и 'УгЕОГЯ1 (остаточные стромальные клетки). Из этих данных следует, что секретируемый плазматическими клетками "УЕвГ-А может воздействовать на стро- мальные клетки через взаимодействие с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2, а стромальные клетки, в свою очередь, могут воздействовать на плазматические клетки, поскольку секретируемые ими факторы роста VEGF-C и VEGF-D взаимодействуют с рецептором VEGFR3, обнаруживаемым на плазматических клетках. В своей работе Vacca A. et al. показали: действительно, при добавлении к плазматическим клеткам кондиционированной среды, полученной при культивировании стромальных клеток, уровень включения 3Н-тимидина плазматическими клетками существенно повышается. Аналогичный эффект наблюдался при добавлении к среде культивирования плазматических клеток факторов роста VEGF-C и VEGF-D, добавление же к среде антител к рецептору VEGFR3 снимает данный эффект. Таким образом, VEGFR3-зависимая сигнальная система играет важную роль в паракрин-ной регуляции размножения плазматических клеток. Однако, аутокринная регуляция пролиферации плазматических клеток также возможна. В своей работе S. Kumar et al. [6], используя более чувствительный метод «гнездного» ОТ-ПЦР, показали, что плазматические клетки экспрессируют также и рецепторы VEGFR1 и VEGFR2; продемонстрирована активация STAT- и MAPK- сигнальных путей в некоторых линиях культивируемых клеток миеломы в ответ на их стимуляцию VEGF-A. В нашей работе доказано, что мРНК гена VEGFR1 экспрессирована у подавляющего большинства пациентов с ММ (29 из 33), и уровень экспрессии был достаточно высоким. Напротив, мРНК гена VEGFR2 была обнаружена лишь у 3 из 33 больных. Эти данные предполагают, что в мононуклеар-ной фракции аспиратов костного мозга большинства пациентов, вследствие отсутствия значимых уровней экспрессии мРНК гена, кодирующего общий для изучаемых факторов роста рецептор VEGFR2, VEGF-А- и 'УТСР-С/УБСР^-зависимые сигнальные системы функционируют независимо.
24 КЛИНИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ ЭКСПРЕССИЯ мРНК ГЕНОВ ФАКТОРОВ РОСТА...
При этом УБОР-А-зависимая система достаточно высоко активна у подавляющего большинства исследованных больных (29/33 или 87,87 %). Уровни экспрессии мРНК генов VEGF-С, VEGF-D и VEGFR3 были относительно ниже, и эта сигнальная система была неактивна (вследствие отсутствия сигналов мРНК рецептора или обоих факторов роста) у 6/33 (18,18 %) пациентов.
Сравнение цитологических характеристик с уровнями экспрессии мРНК генов показало, что у больных с высоким уровнем активности УБОР-А-зависимой системы наблюдается относительно низкое количество плазматических клеток костного мозга, а количественное соотношение лимфоциты/плазматические клетки повышено.
Пациенты, у которых отсутствует коэкспрес-сия мРНК генов, кодирующих факторы роста и рецепторы обеих исследованных сигнальных систем (особенно, УБОР-С/УБОР-Б-зависимой системы) характеризуются пониженным показателем соотношения количества лимфоцитов и плазматических клеток, т.е. баланс между клетками, образующимися в лимфоидном ростке, сдвинут в сторону плазматических клеток.
Из приведенных выше литературных данных известно, что плазматические клетки экспрессируют рецептор УБОРЯЗ и в таком случае увеличение количества плазматических клеток должно сопровождаться увеличением уровня экспрессии мРНК этого гена.
Однако в нашем исследовании наблюдается, скорее противоположная тенденция.
Отсутствие экспрессии мРНК VEGFR3 у большинства больных с повышенным количеством плазматических клеток можно было бы объяснить возникновением на определенной стадии прогрессии активно пролиферирующего клона плазматических клеток, у которых экспрессия этого гена утеряна и, следовательно, регуляция их размножения осуществляется не УБОРР3-зависимой сигнальной системой, а какими-то другими регулирующими механизмами.
Заключение
Данные, полученные в нашей работе, свидетельствуют о том, что у большей части обследованных пациентов с множественной миеломой отсутствует экспрессия мРНК гена, кодирующего общий для факторов роста УБОР-А, УбОР-С и УБОР-Б рецептор УБОРЯ2, и, следовательно, у них могут быть активны 2 независимые сигнальные системы: УБОР-А/УБОРШ и УБОР-С, УБОР-Б/УБОРК3.
При этом больные с высоким процентным содержанием плазматических клеток в аспиратах костного мозга характеризуются пониженным уровнем экспрессии мРНК генов, кодирующих факторы роста и рецепторы обеих сигнальных систем, по сравнению с теми пациентами, у которых количество плазматических клеток невелико.
Литература
1. Bakkus M.H., Van Riet I., Van Camp B., Thielemans K. Evidence that the clonogenic cell in multiple myeloma originates from a pre-switched but somatically mutated B cell. // Br. J. Haematol. - 1994. -Vol. 87. - P. 68-74.
2. Bellamy W.T., Richter L., Frutiger Y. et al. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in hematological malignancies // Cancer Res. - 1999. - Vol. 59. - P. 728-33.
3. Greipp P.R., Lust J.A., O'Fallon W.M. et al. Plasma cell labeling index and p2-microglobulin predict survival independent of thymidine kinase and C-reactive protein in multiple myeloma // Blood. -1993. - Vol. 81. - P. 3382-7.
4. Gruemmer R., Motejlek K., Berghaus D. et al. Regulation of soluble vascular endothelial growth factor receptor (sFlt-1/sVEGFR1) expression and release in endothelial cells by human follicular fluid and granulose cells // Reprod. Biol. Endocrinol. - 2005. - Vol. 3. - P. 57.
5. Durie B.G.M., Salmon S.E. A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment and survival // Cancer. -1975. - Vol. 36. - P. 842-54.
6. Kumar S., Witzig T.E., Timm M. et al. Expression of VEGF and its receptors by myeloma cells // Leukemia. - 2003. - Vol. 17. - P. 2025-31.
7. Kyle R.A. The monoclonal gammopathies // Clin. Chem. - 1994. - Vol. 40(11). - P. 2154-61.
8. Munshi N.C., Wilson C. Increased bone marrow density in newly diagnosed multiple myeloma carries a poor prognosis // Semin. Oncol. - 2001. - Vol. 28(6). - P. 565-9.
9. Podar K., Tai Y.T., Davies F.E. et al. Vascular endothelial growth factor triggers signaling cascades mediating multiple myeloma cell growth and migration // Blood. - 2001. - Vol. 98. - P. 428-35.
10. Rajkumar S.V., Kyle R.A. Angiogenesis in multiple myeloma // Semin. Oncol. - 2001. - Vol. 28(6). -P. 560-4.
11. Vacca A., Ria R., Ribatti D. et al. A paracrine loop in the vascular endothelial growth factor pathway triggers tumor angiogenesis and growth in multiple myeloma // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. -P. 176-85.
12. Vacca A., Ribatti D., Presta M. et al. Bone marrow neovascularization, plasma cell angiogenic potential and matrix metalloproteinase-2 secretion parallel progression of human multiple myeloma // Blood. - 1999. - Vol. 93. - P. 3064-73.
13. Vacca A., Ribatti D., Roncali L. et al. Bone marrow angiogenesis and progression in multiple myeloma // Br. J. Haematol. - 1994. - Vol. 87. - P. 503-8.
