CC BY
51
УДК 612.143- 612.313.82
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ АЛЬФА1А- И АЛЬФА2А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ В МИОКАРДЕ И ТКАНИ ПОЧКИ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС ЛИНИИ НИСАГ (КГАН)
Марина Анатольевна РЯЗАНОВА12
1 Институт цитологии и генетики СО РАН,
630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10
2 ФГБУ НИИ физиологии СО РАМН, 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 4
Методом ПЦР в реальном времени исследовали уровень мРНК генов альфа1А- и альфа2А-адренорецепторов в миокарде и ткани почки 1,5- и 7-месячных интактных крыс гипертензивной линии НИСАГ (наследственная индуцированная стрессом артериальная гипертония). В обеих возрастных группах показано снижение количества мРНК гена альфа2А-адренорецептора в ткани почки крыс НИСАГ и повышение экспрессии гена альфа1А-адренорецептора в ткани почки 7-месячных крыс НИСАГ. Измененный профиль экспрессии генов альфа1А-адренорецептора и альфа2А-адренорецептора в ткани почки гипертензивных крыс НИСАГ может указывать на усиление симпатической стимуляции органа и тем самым вносить существенный вклад в развитие и поддержание гипертензивного статуса. Этому способствует также независимое от возраста увеличение экспрессии альфа1А-адренорецепторов в миокарде.
Ключевые слова: альфа1А-, альфа2А-адренорецепторы, почка, миокард, артериальная гипертония, крысы линии НИСАГ.
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что стресс, в частности эмоциональный, является, наряду с генетической предрасположенностью, одним из важных факторов риска развития гипертензивных состояний [1]. Известно также, что одним из существенных компонентов стрессовой реакции является ответ симпатоадреналовой системы на предъявляемые организму вызовы, которые служат причиной стресса. Одним из определяющих компонентов симпатоадреналовой системы, участвующей в организации стрессовой реакции, является ре-цепторное звено. Через адренорецепторы нескольких подтипов реализуются различные эффекты адреналина и норадреналина в органах-мишенях, кроме того, с участием этих рецепторов происходит ауторегуляция функций самой симпатоадреналовой системы.
Целью исследования было изучение экспрессии генов альфа1А- (а1А-АР) и альфа2А-адре-норецепторов (а2А-АР) у крыс линии НИСАГ (1Б1АН - в англоязычной литературе) со стресс-чувствительной артериальной гипертонией в органах мишенях - миокарде и почке. Данная ра-
бота призвана оценить возможный вклад рецеп-торного аппарата симпатической нервной системы в формирование гипертензивного статуса при наличии генетической предрасположенности к развитию артериальной гипертонии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на интактных 1,5-и 7-месячных крысах-самцах двух инбредных линий - гипертензивной линии НИСАГ и нор-мотензивной линии WAG (n = 6 в каждой возрастной группе крыс обеих линий), содержавшихся в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Воду и сбалансированный корм животные получали без ограничения. Исследование выполнено с соблюдением международных правил по работе с экспериментальными животными. В возрасте 1,5 и 7 месяцев крыс взвешивали и декапитиро-вали. На момент декапитации масса тела крыс НИСАГ составляла 169 ± 7 г (1,5 мес.) и 356 ± ± 15 г (7 мес.), WAG - 141 ± 11 г (1,5 мес.) и 336 ± 9 г (7 мес.). Органы, сердце и почку, быстро извлекали и замораживали в жидком азоте
Рязанова М.А. - младший научный сотрудник лаборатории эволюционной генетики, e-mail: ocean-2006@yandex.ru
Таблица 1
Праймеры, используемые для ПЦР в реальном времени
Ген Последовательность праймеров Т отж' °С Т регистр, °С
Rpl30 F-5"-ATGGTGGCTGCAAAGAAGAC-3" R-5"-CAAAGCTGGACAGTTGTTGG-3" 64 83
a1A-AP F-5"-TGCCATCTTTGAGATCCTG-3" R-5"-GGTAGCTCACACCAATGTA-3" 64 87
a2A-AP F-5"-TATGGGCTACTGGTACTTT-3" R^-CCCACACAGTGACAATGAT^ 63 90
для дальнейшего выделения РНК. Суммарную РНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции [2]. Удаление геномной ДНК из образцов, обратную транскрипцию и ПЦР в реальном времени производили, как описано ранее [3].
Праймеры (табл. 1), используемые для определения адренорецепторов, были подобраны с использованием on line олигоанализатора, размещенного на сайте: www.eu.idtdna.com, и проверены на специфичность в базе данных Blast (Basic Local Alignment Search Tool).
Статистический анализ полученных данных проведен с помощью пакета программ «Statis-tica 6.0» с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Методом ПЦР в реальном времени показано достоверное снижение количества мРНК гена альфа2А-адренорецептора в ткани почки крыс НИСАГ как в возрасте 1,5 (p < 0,01), так и 7 месяцев (p < 0,05) по сравнению с нормотен-зивным контролем - крысами линии WAG (рис. 1, б). В возрасте 7 месяцев выявлено повышенное содержание мРНК гена alA-AP (p < 0,05) в ткани почки крыс линии НИСАГ (рис. 1, а). У молодых крыс НИСАГ наблюдаются сходные, хотя не достигающие степени статистической достоверности изменения в экспрессии гена a1A-AP в почке. Исследование миокарда крыс линии НИСАГ в возрасте 1,5 мес. выявило тенденцию к повышению количества мРНК гена a1A-AP по сравнению с крысами линии WAG (p = 0,06; рис. 2). Мы решили отметить наличие такой тенденции, так как у взрослых крыс НИ-САГ наблюдается изменение экспрессии мРНК гена a1A-AP в том же направлении, что и у молодых. Расчет различий между объединенными возрастными группами крыс НИСАГ и WAG показал наличие статистически достоверного (p < 0,001) увеличения содержания мРНК гена a1A-AP миокарда в группе гипертензив-ных крыс. Экспрессию гена a2A-AP в миокарде крыс использованным методом ПЦР количественно оценить не удалось, так как ее уровень был настолько мал, что находился за пределами чувствительности данного метода.
б
1,5 мес.
НИСАГ
Рис. 1. Количество мРНК гена альфа 1А-адренорецептора (а) и альфа2А-адренорецептора (б) в ткани почки крыс линий НИСАГ и WAG. Данные представлены в относительных значениях количества мРНК исследуемого гена к мРНК гена домашнего хозяйства Rpl30 (т ± SEM). Межлинейные отличия внутри возрастной группы по критерию Манна—Уитни: * — р < 0,05, ** — р < 0,01
ОБСУЖДЕНИЕ
Содержание мРНК гена а1А-АР как в миокарде, так и в почечной ткани крыс линии НИ-САГ имеет явную направленность к повышению по сравнению с нормотензивными крысами линии WAG (см. рис. 1, а, рис. 2).
Следует отметить, что в отличие от человека, у которого число а-АР в миокарде относительно невелико, у крыс их значительно больше и превосходит число ß-АР [4]. а1-АР, по-видимому, играют важную роль в миокарде крыс, поскольку с ними связывают реализацию положительного инотропного эффекта катехола-минов [5] и гипертрофию миокарда у крыс [6]. Возможно, что повышенная стимуляция а1-АР миокарда может вносить вклад в развитие ги-пертензии у крыс линии НИСАГ и способствовать компенсаторной гипертрофии миокарда в ответ на повышение артериального давления.
В литературе имеются данные об изменении экспрессии а1-АР миокарда в других моделях артериальной гипертонии. Так, у спонтанно гипертензивных крыс (линия SHR) получены противоречивые сведения: одни авторы находят снижение [4], другие повышение [7, 8] числа al-АР. Такие противоречия могут быть обусловлены различиями исследованных сублиний крыс SHR, разводимых в разных лабораториях
Рис. 2. Количество мРНК гена альфа 1А-адренорецеп-тора в миокарде крыс линий НИСАГ u WAG. Данные представлены в относительных значениях количества мРНК исследуемого гена к мРНК гена домашнего хозяйства Rpl30 (m ± SEM). Межлинейные отличия внутри возрастной группы по критерию Манна—Уит-ни: # — тенденция, p = 0,06
мира и с методическими особенностями. В случае вторичной (почечной) гипертонии отмечается либо снижение [7], либо отсутствие изменений плотности а-АР миокарда [9].
Что касается а2А-АР, то обнаружить использованным методом сколько-нибудь значимый уровень их экспрессии в миокарде исследованных крыс не удалось. Из литературы известно, что а2А-АР в заметном количестве присутствуют в центральной нервной системе и в некоторых периферических органах, но в последних - в значительно меньшем количестве. Так, у спонтанно гипертензивных крыс линии SHR и у крыс линии WKY, хотя и удалось детектировать мРНК гена а2А-АР в миокарде, ее количество было очень низким [8]. В других исследованиях по определению содержания мРНК гена а2А-АР в различных тканях крысы показано, что его мРНК в миокарде практически отсутствует [10], что соответствует нашим данным. По-видимому, мРНК гена а2А-АР в миокарде крыс действительно очень мало и ее содержание находится на границе чувствительности методов определения.
Существенные изменения количества мРНК адренорецепторов обнаружены в ткани почки крыс линии НИСАГ. Содержание мРНК а1А-АР было достоверно повышено у взрослых крыс НИСАГ и такая же тенденция отмечена у молодых гипертензивных крыс (см. рис. 1, а). Наряду с повышением экспрессии гена а1А-АР в ткани почки крыс НИСАГ отмечено значительное изменение в сторону снижения экспрессии гена а2А-АР (см. рис. 1, б). Такое разнонаправленное изменение экспрессии двух подтипов альфа-адренорецепторов в ткани почки гипер-тензивных крыс приобретает особое значение, так как и тому, и другому сдвигу и тем более их сочетанию должно сопутствовать усиление симпатических влияний на почку. Для более четкого представления об изменении соотношения экспрессии генов альфа-адренорецепторов первого и второго типов нами был рассчитан для почки коэффициент - отношение содержания мРНК а1А-АР к содержанию мРНК а2А-АР. Его величина у крыс НИСАГ, как у молодых, так и взрослых, значительно превышает соответствующие величины у нормотензивных крыс WAG: значение коэффициента у молодых крыс в ткани почки - 2,47±0,29 (НИСАГ) и 0,68±0,17 (WAG) (p < 0,001), у взрослых крыс - 1,63±0,3 (НИСАГ) и 0,55±0,04 (WAG) (p < 0,01). Таким образом, этот показатель красноречиво свидетельствует в пользу существенной роли, которую может играть изменение соотношения аль-фа-адренорецепторов первого и второго подти-
пов в ткани почки в усилении симпатической иннервации почки и в патогенезе стресс-чувствительной артериальной гипертонии у крыс линии НИСАГ.
Из литературы известно, что именно а1А-АР преобладают в прегломерулярной сосудистой сети почки крыс [11] и, главным образом, опосредуют сужение этих сосудов [12]. Также есть исследования, показывающие, что а1А-АР, как и а2А-АР, могут играть непосредственную роль в регуляции водно-солевого гомеостаза. Так, активация а1А-АР усиливает реабсорбцию воды и натрия в почке крыс [13]. Стимуляция гуанфацином а2А-АР почки крысы повышает осмотический клиренс, а ингибирование этого рецептора селективным антагонистом RX-82002 уменьшает его [14].
Исследования на крысах SHR также указывают на увеличение плотности а1-АР в почке [4, 15]. У гипертензивных крыс линий MHS [16], SBH [17] и DS [18] увеличения содержания а1-АР в почке не обнаружено. При вторичной (почечной) гипертонии уровень этих рецепторов в почке существенно не изменяется [4, 15].
Аналогичное найденному нами у крыс НИ-САГ снижение уровня экспрессии а2-АР в почке описано для гипертензивных крыс линии SHR, однако содержание мРНК гена а1-АР, измеренное в этой работе, было также снижено [8]. В то же время другие исследователи показали повышение плотности а2-АР в почке крыс SHR [15, 19]. Подобное увеличение количества а2-АР в почке обнаружено также у гипертензивных крыс линий DS [18] и SBH [17]. Животные - модели со вторичной (почечной) гипертонией не имели отличий по этим рецепторам [15] или их количество было снижено [19]. Сведения о плотности а-АР в почке ги-пертензивных крыс достаточно противоречивы, что свидетельствует о сложности и специфичности изменений данного механизма регуляции почечной функции в каждой конкретной модели артериальной гипертензии. Сравнительная оценка наших и литературных данных говорит о том, что разные генетические модели артериальной гипертонии действительно отличаются по механизмам, участвующим в патогенезе ги-пертензивных состояний. В то же время нетрудно заметить наличие некоторых общих черт в изменении адренорецепторов, в частности между линией крыс НИСАГ и линией SHR.
Можно полагать, что включение почечного звена в цепь событий, приводящих к формированию стойкой артериальной гипертензии, является обязательным условием ее становления,
даже в том случае, когда первичным фактором может выступать эмоциональный стресс. Возможность подключения почечного звена при условии стрессорного генеза гипертензивного состояния, скорее всего, связана с генетической предрасположенностью, в том числе и с особенностями экспрессии генов альфа-адрено-рецепторов в ткани почки. Значение усиленной симпатической стимуляции почки в патогенезе гипертонической болезни подчеркивается во многих исследованиях [20]. Одним из факторов переключения «нормального» соотношения между системным артериальным давлением и натрийурезом в сторону повышения уровня давления, необходимого для поддержания достаточного уровня натриуреза, служит, по мнению некоторых авторов, повышение симпатической стимуляции почки. В этом случае данный механизм может являться причиной формирования стойкой артериальной гипертензии. На основе проведенного исследования появилось больше оснований считать, что именно по такому сценарию идет формирование гипертензивного статуса у крыс линии НИСАГ со стресс-чувствительной артериальной гипертонией.
Работа поддержана грантами Министерства образования и науки № 02.740.11.0705 и грантом РФФИ №11-04-00210-а
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Flaa A., Eide I.K., Kjeldsen S.E., Rostrup M. Sympathoadrenal stress reactivity is a predictor of future blood pressure: an 18-year follow-up study // Hypertension. 2008. 52. S336-S341.
2. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissues // Biotechniques. 1993. 15. S24-S26.
3. Fedoseeva L.A., Ryazanova M.A., Antonov E. V. et al. Expression of the renin angiotensin system genes in the kidney and heart of ISIAH hypertensive rats // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2011. 5. (1). S37-S43.
4. Michel M.C., Kanczik R., Khamssi M. et al. a- And P-adrenoceptors in hypertension: I. Cardiac and renal a1, P1, and P2 adrenoceptors in rat models of acquired hypertension // Cardiovasc. Pharmacol. 1989. 13. S421-S431.
5. Bruckner R., Mugge A., Scholz H. Existence and functional role of alpha1-adrenoceptors in the mammalian heart // J. Mol. Cell. Cardiol. 1985. 17. S639-S645.
6. Lee H.R., Henderson S.A., Reynolds R. et al. a1-Adrenergic stimulation of cardiac gene transcription in neonatal rat myocardial cells. Effects on myo-
sin light chain-2 gene expression // Biol. Chem. 1988. 263. S7352-S7358.
7. Hanna M.K., Khairallah P.A. Alterations of myocardial ^-adrenergic receptors in hypertensive cardiac hypertrophy in the rat // Arch. Int. Pharmaco-dyn. Ther. 1986. 283. S80-S93.
8. Reja V., Goodchild A.K., Pilowsky P.M. Ca-techolamine-related gene expression correlates with blood pressures in SHR // Hypertension. 2002. 40. S342-S347.
9. Eid H., de Champlain J. Increased inositol monophosphate production in cardiovascular tissues of DOCA-salt hypertensive rats // Hypertension. 1988. 12. S122-S128.
10. Handy D.E., Flordellis C.S., Bogdanova N. N., et al. Diverse tissue expression of rat alpha2-adrener-gic receptor genes // Hypertension. 1993. 21. S861-S865.
11. Salomonsson M., Oker M., Kim S. et al. Alpha1-adrenoceptor subtypes on rat afferent arterioles assessed by radioligand binding and RT-PCR // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2001. 281. S172-S178.
12. Blue D.R.Jr., Vimont R.L., Clarke D.E. Evidence for anoradrenergic innervation to alpha 1A-adrenoceptors in rat kidney // Br. J. Pharmacol. 1992. 107. S414-S417.
13. Smyth D.D., Umemura S., Pettinger W.A. Renal nerve stimulation causes alpha1-adrenoceptor-
mediated sodium retention but not alpha2-adreno-ceptor antagonism of vasopressin // Circ. Res. 1985. 57. S304-S311.
14. Intengan H.D., Smyth D.D. Alpha-2a/d adre-noceptor subtype stimulation by guanfacine increase osmolar clearance // J. Pharmacol. Exp. Therap. 1997. 281. S48-S53.
15. Saiz J., Lara B., Torres A., Sanchez A. Hyper-tensinogenic factors and renal alpha-adrenoceptors in young SHR and WKY rats // Life Sci. 1987. 41. S2261-S2268.
16. Parini A., Diop L., Ferrari P. et al. Cerebral and renal alpha-adrenoceptors in Milan hypertensive rat strain // Hypertension. 1986. 4. S213-S215.
17. Parini A., Diop L., Dausse J.P., Ben-Ishay D. Sabra rats as a model to differentiate between Na+ and GTP regulation of alph2-adrenoceptor densities // Eur. J. Pharmacol. 1985. 112. S97-S104.
18. McCaughran J.A.Jr., Juno C.J., O'Malley E., Rosenthal M. The ontogeny of renal alpha1- and alpha 2-adrenoceptors in the Dahl rat model of experimental hypertension // J. Auton. Nerv. Syst. 1986. 17. S1-S20.
19. Dawson R.Jr., Oparil S. Renal catecholamines and alpha2-adrenergic receptors in salt-related and genetic hypertension // Pharmacology. 1987. 34. (23). S131-S142.
20. Guyenet P.G. The sympathetic control of blood pressure // Nat. Rev. Neurosci. 2006. 7. S335-S346.
EXPRESSION OF THE ALPHA1A AND ALPHA2A ADRENERGIC RECEPTOR GENES IN MYOCARDIAL AND KIDNEY TISSUES OF HYPERTENSIVE ISIAH RATS
Marina Anatolyevna RYAZANOVA12
1 Institute of Physiology SB RAMS 630117 Novosibirsk, Timakov str., 4
2 Institute of Cytology and Genetics SB RAS 630090 Novosibirsk, Akademic Lavrentyev av., 10
Myocardial and kidney levels of alphalA and alpha2A adrenergic receptor mRNA have been examined in hypertensive ISIAH and normotensive WAG rats of 1.5 and 7 months of age using real-time PCR. Decreased levels of a2A-AR mRNA in kidneys of both age groups of ISIAH rats have been found. In addition, an increased expression of the alphalA adrenergic receptor gene in the kidneys of 7-month-old ISIAH rats has been revealed. This profile of the renal expression of the a-adrenoreceptor genes in the hypertensive ISIAH rats is indicated as being associated with the increase of sympathetic stimulation of the kidneys and with development and maintenance of the hypertensive status. Development of hypertension is supported by the age independent increase of the alphalA-AR expression in myocardium of ISIAH rats.
Key words: alphalA and alpha2A adrenergic receptors, kidney, myocardium, arterial hypertension, ISIAH rats.
Ryazanova M.A. - junior researcher of the laboratory of evolutionary genetics, e-mail: ocean-2006@yandex.ru
