CC BY
16Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия» Том 17 (56). 2004. Лг» 1. С. 121-126.
УДК 579.6:577.37
ЭКСПРЕСС-ОЦЕНКА МЕМБРАНОАКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ БАВ СИНТЕТИЧЕСКОГО И РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Юркова И. Н.
В настоящее время синтезируются и применяются сотни тысяч химических соединений: одни - в качестве новых лекарственных препаратов, другие попадают в окружающую среду и затем в открытые водоемы и моря со сточными водами промышленных предприятий. Все эти вещества обладают биологической активностью. Объективная оценка действия БАВ лишь на основании результатов химических и физико-химических методов анализа часто бывает затруднена. Для водных сред, содержащих токсичные вещества, это может привести к неправильной оценке экологической опасности.
Разработка и применение биологических методов анализа водных сред связаны с использованием большого спектра тест-объектов с различными тест-функциями [1-4]. Использование с этой целью суспензионных культур клеток (в том числе, бактерий и микроводорослей) имеет преимущества, связанные с тем, что при измерении тест-функций получают интегральный результат миллионов клеток. Большинство известных методов тестирования не отвечают тем или иным требованиям (экспрессность и простота, высокая чувствительность, быстрота развития реакции, автоматизация сбора и обработки результатов), поэтому поиск новых физиологических тесг-функций, отражающих интегральную реакцию организма на воздействие БАВ, является весьма актуальным.
Воздействие БАВ на клетку прежде всего сказывается на изменении проницаемости мембранной системы, что приводит к нарушению концентрационных градиентов и выходу электролитов из клетки [5, 6]. Следствием этого является изменение электропроводности окружающей среды.
Разработанный биокондуктометрический способ контроля биологической активности клеточных суспензий по изменению электропроводности дисперсионной среды [7] ранее был применен при тестировании биологической активности водных сред, содержащих тяжелые металлы [8].
Цель настоящей работы заключалась в исследовании возможности тестирования биокондуктометрическим методом мембраноактивного действия БАВ синтетического и растительного происхождения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Тест-объектом служила альгологически чистая культура Spirulina platensis Geitl., которую выращивали в накопительном режиме в культуральных сосудах при круглосуточном освещении лампами ЛДУ-80 и непрерывном продувании суспензии
воздухом на питательной среде Заррука [9] при 30-32° С в течение 8 суток (конец экспоненциальной фазы роста).
В качестве тестируемых биологически активных веществ использовали фармакологические препараты дибазола, папаверина, строфантина G в концентрации 10"6-10"3 М и водные экстракты лекарственных растений: цикламена Кузнецова, боярышника Поярковой, плюща обыкновенного. Для получения экстрактов клубни цикламена, листья плюща и плоды боярышника измельчали, растирали с кварцевым песком, заливали дистиллированной водой и затем настаивали в течение 2-3 часов, после чего суспензию фильтровали. Концентрацию БАВ определяли по количеству растительного материала, использованного для экстракции, в г сухого вещества на 1 дм3.
Выбор объектов тестирования был связан с тем, что препараты нейротропного действия, к которым относятся дибазол, папаверин и строфантин G, используют в исследованиях электрофизиологических реакций биологических мембран [3,10]. Кроме того, синтез новых препаратов подобного действия представляет большой интерес для современной фармакологии. Не менее важен для создания лекарственных препаратов и пищевых добавок поиск новых источников растительного сырья. В этом отношении выбранные растительные объекты (цикламен Кузнецова, боярышник Поярковой и гшющ обыкновенный) занимают особое место, т.к. содержат ценные БАВ -тритерпеновые гликозиды, флавоноиды, алкалоиды и др. [11].
Для проведения кондуктометрического теста суспензию клеток отделяли от культуральной среды, экспонировали в тестируемых растворах, а затем ресуспендировали в концентрации 1 г а.с.в./дм3 слабо проводящей дисперсионной среды заданного состава [7], электропроводность Ко которой предварительно фиксировали. Через определенные промежутки времени (5, 10, 15 и 20 минут) отбирали пробы и измеряли электропроводность дисперсионной среды К/. Величину кондуктометрического теста определяли по относительному АК=(К\-Ко)/Ко изменению электропроводности среды и выражали в % по отношению к контролю (без БАВ), принимаемому за 100%. Электропроводность растворов определяли с помощью моста переменного тока Р-577 и ячейки со строго фиксированными расстояниями между электродами и фиксированным положением электродов в ячейке [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из результатов, приведенных на рис. 1, исследованные нейротропные препараты: дибазол, папаверин и строфантин G вызывали значительные изменения интегральной проницаемости клеточной мембраны тест-объекта, определяемые по относительному изменению электропроводности дисперсионной среды после экспозиции биомассы, обработанной тестируемыми растворами. Максимальный эффект при равных концентрациях БАВ (Ю 5 М) наблюдался после воздействия строфантина G (рис. 1, в, кривая 2).
По сравнению с дибазолом папаверин оказывал более выраженное мембранотропное действие, однако кинетика развития реакции была медлее (максимальный эффект наблюдался лишь после 30-минутного контакта, в то время как у дибазола и строфантина G от достигался после 30 мин). Когда речь идет о реакции объекта на присутствие биологически активных веществ, предполагается,
что молекулы последнего вступают во взаимодействие с некоторыми структурами клетки, сорбируясь на них. Поэтому кинетика развития реакции клетки на присутствие в растворе БАВ зависит от кинетики их сорбции.
Время экспозиции, мин
Рис. 1. Влияние дибазола (а), папаверина (б) и строфантина О (в) на относительное изменение электропроводности дисперсионной среды, % после экспозиции биомассы Бр1гиИпа рШет1$. Время контакта биомассы с раствора мидибазола и строфантина О -10 минут, папаверина - 30 минут (максимальный эффект). Дибазол и папаверин: 1 - 10"5 М, 2 - 10"4 М, 3 - 10 М; строфантин в: 1 - 10"6 М, 2 - 10"5 М, 3 - 10'4 М.
5 10 15 20 25 Время экспозиции, мин -♦— 1 -Ш—2 —4—3
5 10 15 20 25 Время экспозиции, мин
—•—1 -Ш—2 —А—3 !
При определении пороговых концентраций исследованных препаратов учитывались относительные изменения электропроводности, превышающие 10% (экспериментально определенная относительная погрешность метода составляла 4-6%). Для дибазола и папаверина пороговые концентрации соответствовали 10"5 М (величина эффекта 10-20%), а для строфантина G - 10"6 М (20-30%). Эти величины были на порядок ниже определенных электроальгологическим методом на клетках харовых водорослей [3]. В случае со строфантином G по величине эффекта можно предположить, что пороговая концентрация, определяемая
биокондуктометрическим методом, менее
В зависимости от времени, необходимого для достижения необратимости связывания молекул БАВ с поверхностными клеточными структурами, биологическая реакция клетки на БАВ может быть необратимой, как после 20-30-минутного контакта микроводорослей с ионами тяжелых металлов [8], так и обратимой. Поэтому при исследовании действия БАВ наряду с определением величины эффекта (в данном случае мембраноактивного), пороговых концентраций и кинетики развития реакции большое значение имеет степень обратимости взаимодействия, о которой в наших экспериментах можно судить по изменению зависимости относительной электропроводности дисперсионной среды от времени экспозиции тест-объекта (кинетеические кривые) после достижения максимальных значений (5-10 минут). Обратимое взаимодействие БАВ с компонентами клеточной мембраны отмечалось при низких концентрациях дибазола - 10"5 М (рис. 1, а, кривая 3) и строфантина G - 10"6 М (рис. 1, в, кривая 3). У папаверина в концентрации 10"5 М (рис. 1, б, кривая 3) оно менее выражено, что объясняется большим временем контакта с БАВ (30 минут), необходимым для достижения максимального эффекта в связи с медленной кинетикой развития реакции.
При всех исследованных концентрациях дибазола, папаверина и строфантина максимальное мембраноактивное действие наблюдалось при экспозиции биомассы в дисперсионной среде в течение 5-10 минут. Поэтому при быстром скрининге большого количества тестируемых образцов достаточно 10-минутной экспозиции.
При сравнении зависимости мембраноактивного действия различных растительных экстрактов от концентрации биомассы видно, что максимальный эффект наблюдался после контакта биомассы тест-объекта с экстрактом, полученным из клубней цикламена Кузнезова (рис. 2, кривая 1). Эффект был заметен уже при концентрации биомассы 0,1 г/дм3, а при 0,4-0,5 г/дм3 достигал максимальных значений - 80-92%. Наибольший эффект от воздействия экстрактов плюща (58%) наблюдался при концентрации биомассы 1,0 г/дм3 (рис.2, кривая 2), однако по ходу кривой видно, что максимальный эффект может соответствовать более высоким концентрациям экстракта. Наименьшее мембраноактивное действие установлено для экстрактов плодов боярышника (рис. 2, кривая 3). Как и в случае с плющем максимальный эффект при концентрации 1,0 г/дм3 не достигнут, однако по сравнению с экстрактом плюща при равных концентрациях величина эффекта экстрактов боярышника в два раза ниже.
Сильное мембраноактивное действие очень малых концентраций экстракта клубней цикламена Кузнецова можно объяснить большим содержанием БАВ мембраноактивного действия - тритерпеновых гликозидов цикламина, мирабилина, цикламинорина и др. [13]. Как видно из кинетики развития мембраноактивного действия экстрактов цикламена (рис. 3), максимальный эффект наблюдался после экспозиции биомассы в дисперсионной среде в течение 10-20 минут. При минимальной концентрации 0,05 г а.с.в./дм3 было отмечено незначительное снижение эффекта после 20-минутной экспозиции, что, возможно, объясняется десорбцией молекул БАВ.
Рис. 2 Влияние концентрации биомассы в экстрактах, полученных из клубней цикламена Кузнецова (1), листьев плюща обыкновенного (2) и плодов боярышника Поярковой (3) на относительное изменение электро-проводности
дисперсионной среды, % после 30-и минутной экспозиции биомассы 5рггиИпа р1а1ет1$. Время контакта биомассы с экстрактами - 10 минут.
Рис. 3 Влияние концентрации экстракта клубней цикламена Кузнецова на относительное изменение электропроводности дисперсионной среды в %. После различной экспозиции биомассы БрггиНпа р1мепш. Время контакта биомассы с экстрактами - 10 минут. Концентрация биомассы в экстракте: 1 - 0,05 г а.с.в./дм3; 2 - 0,1 г а.с.в./дм3; 3 - 0,4 г а.с.в./дм3.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования разработанного биокондуктометрического метода для экспресс-скрининга новых БАВ мембраноактивного действия.
Список литературы
1. Дятлов С.Е., Петросян А.Г. Phaeodactylum tricornutum Bohl. (Chrysophyta) как тест-объект. Общие положения // Альгология. -2001. - Т. 11, №1. - С.145-155.
2. Методы биоиндикации и биотестирования природных вод / Гос. комитет СССР по гидрометеорологии и контролю природных вод. - Л.: Гидрометиздат, 1987. - 152 с.
3. Юрин В.М., Соколик А.И., Кудряшов А.П. Регуляция ионного транспорта через мембраны растительных клеток. - Мн.: Навука i технша, 1991. - 271с.
4. Архипчук В.В., Гончарук В.В. Влияние обессоленной воды на жизнедеятельность организмов животных и растений и функционирование их клеток // Химия и технология воды - 2003. - Т. 25, №2 - С. 191-200.
5. Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Хасанова Л.А. Токсическое действие гидроксилированных ионов
тяжелых металлов на цитоплазматическую мембрану бактериальных клеток // Микробиология. -1997.-Т.66,№5.-С.89-91.
6. Приходько И.В. Изменение проницаемости клеточных мембран как общее звено механизмов
неспецифической реакции растения на внешнее воздействие //Физиол. и биохимия культур, раст.
- 1977. - Т.9, № 3. - С.ЗО 1-309.
7. Пат. 2002108456 Украины, МКИ5 С 12 М 1/36, С 12 М 1/38, С 12 Q 3/00. Способ контроля
изменений активности микроорганизмов /И.Н.Юркова, В.Р.Эстрела-Льопис, Т.И.Бородинова. -Опубл. 16.06.2003. Бюл. №6.
8. Юркова И.Н., Эстрела-Льопис В.Р. Кондуктометрический альготест качества водной среды
//Ученые записки ТНУ. Серия «Биология, Химия». - 2003. - №1. - С. 113-118.
9. Пиневич В.В., Верзилин H.H., Михайлов A.A. Изучение Spirulina platensis - нового объекта для
высокоинтенсивного культивирования // Физиология раст. - 1970. - Т. 17,, вып.5. - С.1037-1047.
10.Юрин В.М., Иванченко В.М., Галактионов С.Г. Регуляция функций мембран растительных клеток.
- Мн.: Навука i техшка, 1979. - 215с.
11.Энциклопедический словарь лекарственных растений и продуктов животного происхождения. -С.-Петербург «Спец.Литература», 1999. - 358с.
12.Лопатин Б.А. Концуктометрия. - Новосибирск:Изд-во СО АН СССР, 1964. — 112с.
13.Galis Т., Satana М.Е., Yuruker A. Triterpene saponins from Cyclamtn mirabile and their biological activities // J. NatProd. - 1997. - Vol.60, №3. - P. 315-318.
Поступила в редакцию 18.12.2003 г.
