CC BY
21
7. Shilov AM. [Sartans in the practice of primary care physicians in the treatment of hypertension], Farma-teka. 2014;9:17-21. Russian.
8. ACCORD Study Group. Effects of intensive bloo dpressure control in type 2 diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 2010;362:1575-85.
Crana HaAinmna ao peAaKuii 26.04.2016
♦
УДК616.126.5-007.2-056.7:577.218]-053.2
ЕКСПРЕС1Я ГЕН1В НУКЛЕАРНОГО ФАКТОРА АКТИВОВАНИХ Т-КЛ1ТИН У Д1ТЕЙ 3 ДВОСТУЛКОВИМ АОРТАЛЬНИМ КЛАПАНОМ СЕРЦЯ
Запор1зъкий державный медичний утверситет
кафедра госптально'1 nediampiï
кафедра мгкробгологИ] вгрусологи та ШунологП
кафедра пропедевтики дитячих хвороб
пр. Маяковсъкого, 2б, Запоргжжя, 69000, Украта
Zaporizhzhya State Medical University
Department of hospital Paediatrics
Department of Microbiology, Virology and Immunology
Department ofpropaedeutics of children diseases
Mayakovski avenue, 26, Zaporizhzhya, 69000, Ukraine
e-mail: kamenshchyk@mail.ru
Ключов! слова: двостулковий аортальний клапан, dimu, допплерехокардюграф1я, генна експреая, NFATC1, NFATC4
Key words: bicuspid aortic valve, children, dopplerocardiography, gene expression, NFATC1, NFATC4
Реферат. Экспрессия генов нуклеарного фактора активированных Т-клеток у детей с двухстворчатым аортальным клапаном сердца. Каменщик A.B., Камышный А.М., Иванько О.Г. Гены нуклеарного фактора активированных Т- клеток (NFATQ) играют ключевую роль как в формировании клапанов сердца, та и в имуннном ответе. В экспериментальных моделях также показано, что данные гены, относящиеся к факторам транскрипции, могут приводить к развитию гипертрофии миокарда в постнатальном периоде. Целью данного исследования стало определение уровня экспрессии генов NFATC1 и NFATC4 в крови 30 детей с врожденными пороками сердца (ВПС). У 15 из этих детей был диагностирован двухстворчатый аортальный клапан (ДАК), у 15 - ВПС без клапанных аномалий, 15 условно здоровых детей составили группу контроля. У всех больных не отмечалось признаков сердечной недостаточности. На первом этапе исследования методом допплерэхокардиографии у детей с ДАК в сравнении с ВПС без клапанных аномалий и группой контроля было выявлено достоверное утолщение задней стенки левого желудочка и межжелудочковой перегородки. На втором этапе исследования было выявлено достоверное увеличение относительной нормализованной экспрессии гена NFATC1 у больных с ДАК при отсутствии достоверных различий в уровне экспрессии гена NFATC4 в указанных категорий детей. Таким образом, у детей с двухстворчатым аортальным клапаном сердца имеет место формирование ранней гипертрофии миокарда с изменением экспрессии генов нуклеарного фактора активированных Т-клеток при превалировании экспрессии NFATC1. Определение уровня экспрессии указанных генов в крови детей с ДАК может рассматриваться как ранний маркер прогрессирующей гипертрофии миокарда.
A.B. Каменщик, О.М. Камишний , О.Г. 1ванько
1б/ Том XXI/ 3
29
Abstract. Gene expression of nuclear factor of activated T-cells in children with bicuspid aortic valve. Kamenshchyk A.V., Kamyshny A.M., Ivanko O.G. The genes of nuclear factor of activated T-cells (NFATQ) play a key role both in heart valves formation and immune response. The genes belong to transcriptional factors and lead to myocardial hypertrophy in postnatal period that is confirmed by experimental models on animals. The purpose of this study was to reveale NFATC1 and NFATC4 genes expression level in the blood of 30 children with congenital heart diseases (CHD), 15 of them had bicuspid aortic valve, 15 had CHD without valve anomalies and 15 healthy children of the control group. No patients had signs of heart failure. At the first sage of Doppler heart ultrasound study a significant increase of the left ventricle posterior wall and ventricular septum thickness in comparison with CHD and control was revealed in BAV group. At the second stage a significant rise of relative normalized expression of NFATC1 in BAV children compared to CHD and control without differences in the expression of NFATC4 gene were established. Thus, in children with bicuspid aortic valve, formation of early myocardial hypertrophy with changes in nuclear factor of activated T-cells genes expression with prevailing of NFATC1 expression takes place. The detection ofNFATC1 expression level in the blood of children could be considered as an early marker ofprogressive myocardial hypertrophy.
Гени нуклеарного фактора активованих Т-кттин {NFATC), з одного боку, вщом1 своею участю у формуванш клапанного апарату серця на еташ ембрюгенезу \ в реатзацп ¿мунно! вщ-повщ1 [4]. Ц1 гени представлен! у вигляд! 5 модифшацш {NFATC1-NFATC5), що належать до транскрипцшних фактор1в та мають найбшьший р1вень експресп у хондроцитах, мюцитах, ади-поцитах, кератиноцитах, ендотел1альних кл1ти-нах при диференщацп та розвитку клапашв серця \ судин, а також при гшертроф1чних реакщях юсток та серцевих м'яз1в [10]. 3 шшого боку, при ¿мунних реакщях при учасп цих гешв вщбуваеться активащя Т - кттин теля взаемодп 1х з штерлейкшом - 2. Вважають, що експрес1я вщповщних гешв щшьно асоцшована з ¿мунною вщповщдю [7]. Також була продемонстрована провщна роль NFATC1 у розвитку стрес - шду-ковано! гшертрофп мюкарда [5, 8, 9], а саме асощацп пол1морф1зм1в NFATC ¿з потовщенням стшки та вщповщним збшьшенням маси л1вого шлуночка [3, 11]. Суттеве значения цього пол1-морф1зму виявлено в розвитку патолопчно! спортивно! гшертрофп з асиметричним збшь-шенням л1вих камер серця [2]. Пщтвердження зазначених факпв мае мюце також 1 в експе-риментальних моделях [12]. Слщ зазначити, що, на вщмшу вщ вивчення пол1морф1зм1в, дослщжеиия експресп цих генетичних маркер1в при серцево-судиииш патологи в людини у зв'язку з певними труднощами забору бюпсш-ного матер1алу можна зробити лише при про-ведеиш оперативних втручань на серщ, вони мають поодинокий характер та стосуються безпосередньо тканини мюкарда [1].
Завдяки очшуваиш високш пре- та постна-тальиш траискрипщйиш активност! та систем-ним ефектам щодо вальвулогенезу, ¿муноре-гуляцп та розвитку патолопчно! гшертрофп серця, можна вважати перспективним дослщжеи-ня експрес!! ген!в нуклеарного фактора акти-
вованих Т-кл!тин, таких як NFATC1 та NFATC4, у кл1тинах кров! в якосп маркер1в раишх мюкард!альиих змш у д1тей з аиоматями серцевих клапашв.
Виходячи з вищенаведеного, метою нашого дослщжеиия стало визначення р!вшв вщиосио! иорматзоваио! експресп гешв NFATC1 та NFATC4 у кров! хворих д1тей з двостулковим аортальним клапаном серця.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНБ
Для реал!зацп поставлено! мети на першому еташ дослщжеиия була проведена д1агностика вроджених вад серця (ВВС) за допомогою ультразвукового допплерограф1чного дослщжеи-ня серцево! гемодииамши сканером "Medison -8000" датчиком 2,5 МГц з визначенням стан-дартних ехокардюскошчиих параметр1в у 45 д1тей вшом вщ 7 до 15 роюв, у 30 з яких мали мюце ВВС. При цьому в 15 д1тей був д1агно-стований двостулковий аортальний клапан серця (ДАК). В шших 15 хворих, яю склали групу пор1вняння, мали мюце вроджеш вади серця (ВВС), що не супроводжувалися аноматями клапанного апарату. 3 них дефект м1жпередсердно1 перетинки (ДМПП) спостерпався в 7 хворих, дефект м1жшлуночково1 - у 5, шфуцщбуляриий стеноз вихщиого тракту л1вого шлуночка - в 1, коарктащя аорти - в 1, стеноз легеиево! артерп -в1.У вс1х цих 30 хворих не було виявлено ознак серцево! недостатност!. Контрольну групу скла-ли15 умовно здоровихд!тей в!дпов!дного вшу.
На другому еташ дослщжеиия був визначений р1вень експрес!! ген!в NFATC1 та NFATC4 у клггинах кров! в зазначених 3 трупах пащенпв за допомогою видшення тотально! РНК з вико-ристанням набору «РНК-экстраи» («Синтол», Рос1я). При цьому в 15 з них спостерпався двостулковий аортальний серцевий клапан (ДАК). РНК видшяли в!дпов!дно до протоколу до набору. Для проведения зворотно! транскрипцп й
отримання кДНК використовували Ha6ip ОТ-1 ф1рми "Синтол" (Рос1я). Для визначення р1вня експресп дослщжуваних гешв використовували амптфшатор CFX96™Real-Time PCR Detection Systems («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) i Ha6ip реактивАв Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific, США). Oi-нальна реакцшна сумш для ампл1фшацп включала барвник SYBR Green, ДНК - пол1меразу Maxima Hot Start Taq DNA Polymerase, по
0,2 мкл прямого i зворотного специф1чних прай-Mepiß, 1 мкл матрищ (кДНК). Реакцшну сумш доводили до загальиого об'ему 25 мкл додаван-иям деюшзовано! води. Специф1чш пари прай-Mepiß (5'-3') для анатзу дослщжуваних i рефе-реисиого гешв були пщбраш за допомогою програмного забезпечення Primer Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) та виго-товлеш ф1рмою Thermo Scientific, США (табл.).
Ген Праймер Температура Довжина Екзон-екз онний
плавления продукту ПЛР,
Со (П.Н.)
NFATC1
NFATC4
GAPDH
F:5'TGCAAGCCGAATTCTCTGGT-3' R: 5GAACGGGGCTGGTTATCCTC-3' F:5'GGGGATTGGGGGAAGAACTG -3 R: 5-GCTCTCCCAAGGCCAGAC -3' F: 5CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3 R: 5-CGATGTGGCTCGGCTGG-3
59.96 60.18 60,03 59,73 59,83 60,58
67
66
63
2412/2413
433/434
165/166
Пюля початково! денатурацп протягом 10хв при 95°С ампл1фшащя складалася з 45-50 циктв та проводилася за таких умов: денатуращя -95°С, 15 сек., вщпал - 59-61°С, 30-60сек., елон-гащя - 72°С, 30 сек. В якосп референт - гена для визначення вщносного значения змши р1вня експресп дослщжуваних гешв був використаний ген глщеральдепд-З-фосфат депдрогенази (GAPDH). Вщносну норматзовану кшьюсть кДНК таргетних гешв визначали за методом AACt [6]. Статистичний анатз даних ПЛР проводили за допомогою програмного забезпечення CFX Manager ™ (Bio-Rad, США). Узагальнена статистична обробка Marepiany проводилась за допомогою стандартного програмного пакету Statistica 6.0
РЕЗУЛЬТАТА ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
При проведенш ультразвукового допплерехо-кардюскошчного дослщження в д1тей з ДАК нами було виявлене достов1рне збшьшення тов-щини задньо! стшки nieoro шлуночка, пор1вняно як з групою хворих на ВВС без залучення кла-панних аномалш (8,43±0,41 мм та 7,44±0,27 мм вщповщно, р<0,05), так i з контрольною групою (8,43±0,41 мм та 7,21±0,27 мм вщповщно, р<0,05). У той же час, у rpyni хворих на ВВС, що не супроводжувалися аноматями серцевих кла-пашв, вщмшност1 товщини задньо! стшки nieoro
шлуночка порАвняно з контролем не були достов1рними (7,44±0,27 мм та 7,21±0,27 мм вщповщно, р>0,05). Така сама тенденщя спосте-рпалась стосовно розм1р1в мАжшлуночково! пе-ретинки (8,44±0,41 мм та 7,23±0,28 мм, р<0,05; 7,44±0,23 мм та 7,23±0,28 мм, р>0,05 вщповщно).
При визначенш вщносно! норматзовано! експресп у кттинах кров1 хворих обох дослщжу-ваних груп виявилось, що вона значно переви-щувала референтш значения в контрольнш груш, яю приймалися за базовий р1вень, що дорАвнював умовнш одинищ експресп. Так, для гена-^К4ТС1 у дп"ей з ДАК та при так званих «неклапанних» ВВС вщносна норматзована експрешя пщви-щувалася в 56 та 18 раз1в вщповщно, а для гена ЫЕЛТС4, вщповщно, в 14 та 24 рази. дат наведет на рисунку.
Як можна побачити на рисунку, при пор1внян-ш вщносно! експресп гешв ЫЕЛТС1 та ЫЕЛТС4 у двох вищезазначених трупах хворих д1тей було встановлено статистично достов1рне збшьшення р1вня експресп ЫЕЛТС1 у д1тей з ДАК (56,42±16,93 та 16,98±6,17 вщповщно, р<0,05). У той же час, експрешя ЫЕЛТС1 була в цш груш також достов1рно вищою за експресда ЫЕЛТС4 (56,42±16,93 та 14,02±3,57, р<0,05). Водночас достов1рних розб1жностей щодо вщносно1 нормаль зовано! експресп Ь[ГЛТС4 при пор1внянш и в дп-ей з ДАК та при ВВС, що не супроводжувалися
16/ Том XXI/ 3
31
аиоматями серцевих клапашв, отримано не було (14,02±3,57 та 24,17±7,80 вщповщио, р>0,05).
Таким чином, у д1тей з двостулковим аорталь-ним клапаном серця, що перебпае без ознак серцево! недостатност1, пор1вняно з хворими ¿з вроджеиими вадами серця без залучеиия серцевих клапашв та в контрольнш груш, мають мюце потовщения задиьо! стшки л1вого шлу-иочка та м1жшлуночково! перетинки разом ¿з зиачиим збшьшеииям вщиосио! експресп гена
NFATC1, що може бути шдтверджеииям форму-ваиия ранньо1 гшертрофп мюкарда в ще! категорп хворих. 3 урахуваииям того, що зазна-чеш змши експресшио! активност! мають мюце в клггинах кров! хворих, тобто вщбуваються на системному piBHi, можна також передбачати наявшсть певиих мутацш цих гешв, яю впли-вають як на ембрюгенетичне формуваиия серцевих клапашв, так i на розвиток мюкард1аль-hoï гшертрофп.
100
NFATC1 ДАК
NFATC1 ВВС
NFATC4 ДАК
NFATC4ВВС
Вщносна нормал!зована експремя гешв NFATC у д1тей ¡з вродженими захворюваннями серця
ВИСНОВКИ
1. У д1тей з двостулковим аортальним клапаном серця мае мюце г1пертроф1я м1окарда з1 збшьшенням товщиии задиьо! ст1ики л1вого шлуночка та м1жпередсердио1 перетинки, яка не залежить в1д суттевих зм1и внутршньосерцево! гемодииам1ки.
2. У д1тей з двостстулковим аортальним клапаном серця, що перебпае без ознак серцево! недостатносп, мае м!сце значне шдвищення експрес!! у кров! генетичиого фактора ОТАТС1,
яка перевищуе показиики хворих з ¿ишими вроджеиими вадами серця.
3. У д!тей з двостулковим аортальним клапаном серця та при ВВС без залучеиия серцевих клапашв вщносна норматзована експреая гена КБАТС4 за !нтенсиви!стю не вщр!зняеться.
4. Визиачеиия в!диосио! експрес!! фактора КБАТС1 у кров! хворих дпей з двостулковим аортальним клапаном серця може розглядатись як раии!й маркер прогресуючо! г!пертроф!! м!окарда.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Половкова О.Г. Роль генов сигнального пути кальцинеурина в развитии ремоделирования миокарда у больных ишемической болезнью сердца: автореф. дис. на соискание учен, степени канд. мед. наук: спец. 03.02.07 / Половкова О.Г. -Томск, 2013. -23 с.
2. Клинико-генетические аспекты формирования «патологического спортивного сердца» у высококвалифицированных спортсменов / А.Г. Федотова, И.В. Ас-тратенкова, Е.В. Линде [и др.] // Вестник спортивной науки. - 2009. -№2,- С. 32-37.
3. Association of NFATc 1 gene polymorphism with ventricular septal defect in the Chinese Han population / L. Shen, Z.Z. Li, A.D. Shen, [et al ] // Chin. Med. J. -2013.-Vol. 126, N 1. - P. 78-81.
4. Fernando Macian. Nfat proteins: key regulators of T-cell development and function / Fernando Macian // Nature Reviews. Immunology. - 2005. - N 5. - P. 472-484.
5. Ida Gjervold Lunde. Molecular mechanisms of heart failure; Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) signaling in myocardial hypertrophy and dysfunction: dissertation for the degree of Philosophiae Doctor (PhD) / University of Oslo, Norway. Series of dissertations submitted to the Faculty ofMedicine. Oslo, 2011. -N 1307.
6. Kenneth J. Livak. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2- AACT Method / Livak Kenneth J., Thomas D. Schmittgen // METHODS. - 2001. - Vol. 25. - P. 402-408.
7. NFATcl/aA: The other Face of NFAT Factors in Lymphocytes / Edgar Serfling, Andris Avots, Stefan
Klein-Hessling, [et al.] // Cell Communication Signaling. -2012.-P. 10:16.
8. NFATc3 contributes to intermittent hypoxia-induced arterial remodeling in mice / S.de Frutos, E. Caldwell, C.H. Nitta [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 2010. - Vol. 299, N 2. - H356-363.
9. NFATc3 is required for intermittent hypoxia-induced hypertension / S. de Frutos, L. Duling, D. Alô [et al.] // Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. - 2008. -Vol. 294, N5. - H2382-2390.
10. Partitioning the heart: Mechanisms of cardiac septation and valve development / C.J. Lin, C.Y. Lin,
C.H. Chen [et al.] // Development. - 2012. - Vol. 139. -P. 3277-3299.
11. Polymorphisms of genes of the cardiac calci-neurin pathway and cardiac hypertrophy / O. Poirier, V. Nicaud, T. McDonagh [et al.] // Eur. J. Hum. Genet. -2003,- Vol. 11,N 9. -P. 659-664.
12. Requirement of Nuclear Factor of Activated T-cells in Calcineurin-mediated Cardiomyocyte Hypertrophy. / Eva van Rooij, Pieter A. Doevendans Chiel C. de Theije, Fawzi A. Babiker [et al.] // J. Biological Chemistry. - 2002. - Vol. 277, N 50. - P. 48617.
REFERENCES
1. Polovkova OG. [The role of calcineurin signal pathway genes in myocardium remodeling of patients with ischemic heart disease]. Avtoref. cand. med. nauk. Tomsk. 2013;23. Russian.
2. Fedotova AG, Astratenkova IV, Linde EV, Or-dzhonikidze ZG, Akhmetov II. [Clinical and genetic aspects of the "pathological athlete's heart" formation in highly skilled athletes]. Vestnik sportivnoy nauki. 2009;2:32-37. Russian.
3. Shen L, Li Z.Z, Shen A.D, Liu H, Bai S, Guo J, Yuan F, Li XF. Association of NFATcl gene polymorphism with ventricular septal defect in the Chinese Han population. Chin Med J (Engl). 2013;126(1):78-81
4. Fernando Marian. Nfat proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature reviews. Immunology. 2005;5:472-84.
5. Ida Gjervold Lunde. Molecular mechanisms of heart failure; Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT)signaling in myocardial hypertrophy and dysfunction. Dissertation for the degree of Philosophiae Doctor (PhD), University of Oslo, Oslo, Norway. Series of dissertations submitted to the Faculty of Medicine, University of Oslo, 2011;1307.
6. Kenneth J, Livak and Thomas D. Schmittgen, Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 2- AACT Method. METHODS. 2001;25:402-8.
7. Edgar Serfling, Andris Avots, Stefan Klein-Hessling, Ronald Rudolf, Martin Vaeth and Friederike Berberich-Siebelt Cell Communication and Signaling NFATcl/aA: The other Face of NFAT Factors in Lymphocytes. 2012;10:16.
8. de Frutos S,Caldwell E,Nitta CH,Kanagy NL, Wang J, Wang W, Walker MK, Gonzalez Bosc LV. NFATc3 contributes to intermittent hypoxia-induced arterial remodeling in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2010;299(2):356-63.
9. de Frutos S, Duling L, Aló D, Berry T, Jackson-Weaver O, Walker M, Kanagy N, González Bosc L. NFATc3 is required for intermittent hypoxia-induced hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008;294(5):2382-90.
10. Lin CJ, Lin CY, Chen CH, Zhou B, Chang CP. Partitioning the heart: Mechanisms of cardiac septation andvalve development. Development. 2012;139:3277-99.
11. PoirierO, NicaudV, McDonaghT, DargieHJ, Desnos M, Dorent R, Roizés G, Schwartz K, Tiret L, Ko-majdaM, Cambien F. Polymorphisms of genes of the cardiac calcineurin pathway and cardiac hypertrophy. Eur JHum Genet. 2003;ll(9):659-64.
12. Eva van Rooij, Pieter A Doevendans, Chiel C de Theije, Fawzi A Babiker, Jeffery D Molkentin, Leon J. De Wind Requirement of Nuclear Factor of Activated T-cells in Calcineurin-mediated Cardiomyocyte Hypertrophy. The Journal Of Biological Chemistry. 2002;277(50):48617.
Crarra Ha^mm^a ao pe^aRnii 06.05.2016
♦
16/ Tom XXI/ 3
33
