CC BY
24УДК 546.72 : 615.099
Экспериментальные данные к оценке пульмонотоксичности и резорбтивной токсичности частиц магнетита (Fe3O4) нано- и микрометрового диапазонов
Проведена сравнительная оценка токсичности частиц магнетита (Ре304) на-нометрового (10 нм и 50нм) и микрометрового (1 мкм) диапазонов по результатам сдвигов клеточного состава жидкости бронхоальвеолярного лаважа через 24 часа после интратрахе-ального введения указанных частиц, а также по ряду показателей состояния организма после повторных внутрибрюшинных инъекций тех же материалов. Найдено, что при равных массовых дозах наночастицы обладают значительно более выраженной биологической агрессивностью, чем частицы микрометрового
диапазона, но вызывают более активную и эффективную защитную реакцию альвеолярного фагоцитоза. В пределах наномет-рового диапазона зависимость между диаметром и резорбтив-ной токсичностью частиц неоднозначна, что может быть связано с различиями токсико-кинетики, которую контролируют как физиологические механизмы, так и прямая пенетрация наночастиц через биологические барьеры и, наконец, неодинаковая растворимость.
Ключевые слова: наночасти-цы, магнетит, реакция альвеолярного фагоцитоза, резорб-тивное действие
Кацнельсон Б.А.1, Привалова Л.И.1, Кузьмин С.В. 1,
[Дегтярёва Т.Д.1, | Сутункова М.П.1, Минигалиева И.А. 1, Ерёменко О.С.1, Киреева Е.П.1, Ходос М.Я.2, Козицина А.Н.2, Малахова Н.А.2, Глазырина Ю.А.2, Шур В.Я.3, Шишкин Е.И.3, Николаева Е.В.3, Валамина И.Е.4
1ФГУН «Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих пром-предприятий» Роспотребнадзора МЗиСР
2ООО «Научно-производственное внедренческое предприятие «ИВА»
3 ГОУ «Уральский государственный университет им. А.М. Горького»
4 ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Росздрава, Екатеринбург
Введение. Развитие нанотехно-логий ведет к появлению множества материалов, содержащих на-норазмерные частицы, к которым условно относят такие, у которых хотя бы один линейный размер не превышает 100 нм. Наночастицы (НЧ) различных материалов находят широкое применение в различных отраслях техники, медицины и науки. В частности, НЧ магнетита (Ре304) всё шире используются в медицине и биологии в качестве избирательных носителей для доставки лекарств к органам и маркёров, управляемых внешним магнитным полем, киллеров раковых клеток (в результате локальной гипертермии, связанной с нагревом этих НЧ в переменном магнитном поле), контрастного материала для магнитно-резонансной томографии и т.п. С позиций развития общей нанотоксикологии на данном этапе, НЧ любых окислов железа являются, с нашей точки зрения, объектом выбора, по-
скольку их изучение приближает к ответу на важный вопрос о том, действительно ли материал, крайне малотоксичный при величине частиц в микрометровом диапазоне, может в нано-состоянии стать настолько токсичным, что создаёт серьёзный риск для здоровья при его производстве и использовании. Наилучшим свидетельством низкой токсичности оксидов железа в «обычном» состоянии может служить то, что почти все они допущены Объединённым Комитетом экспертов по пищевым добавкам (ДЕСТА) в качестве красителей в составе таких добавок как «практически безвредные» при систематическом суточном поглощении до 0,5 мг/кг.
Теоретические предпосылки к ожиданию резкого повышения токсичности любого вещества в виде НЧ освещались многими авторами ([3, 5, 6, 13, 14]), и рассмотрение этих предпосылок не входит в наши задачи. Необходимо подчер-
кнуть, однако, что анализ большого числа опубликованных данных реальных исследований убеждает в справедливости утверждения, что «this common perception of greater nanoparticle toxicity is based on a limited number of studies» (« эта общая репутация более высокой токсичности наночастиц основывается на ограниченном числе исследований») [18], к чему можно добавить, что некоторые из таких исследований эту репутацию не подтверждают [12, 19].
В производственных условиях и при загрязнении атмосферного воздуха так называемыми ультратонкими аэрозолями основной путь воздействия НЧ на организм человека связан с их отложением на свободной поверхности глубоких дыхательных путей (то, что в терминологии биокинетики аэрозолей обозначается как «pulmonary region» -пульмонарная область). Ключевым механизмом самоочищения
пульмонарной области является мобилизация на ее свободную поверхность клеток, способных фагоцитировать мельчайшие частицы, тем самым препятствуя их пенетрации в легочный интерсти-циум и способствуя выведению по пути мукоцилиарного транспорта. Основным эффектором фагоцитарного звена пульмонарно-го клиренса являются легочные альвеолярные макрофаги (АМ), а вспомогательным - нейтрофиль-ные лейкоциты (НЛ). Мобилизация нейтрофилов при пылевом повреждении макрофагов играет важную компенсаторную роль, а сама контролируется количеством продуктов макрофагального разрушения и поэтому тем интенсивнее, чем выше повреждающее действие (цитотоксичность) частиц для макрофага [10, 15, 16, 17]. В связи с этим отношение нейтро-филов к макрофагам в клеточной популяции бронхо-альвеолярного лаважа служит косвенным, но достаточно надежным показателем при сравнительной оценке цито-токсичности различных частиц [1, 2, 7, 8, 9, 10].
Предметом дискуссии пока служит то, в какой мере эти закономерности, надежно обоснованные для частиц микрометрового диапазона, справедливы и для НЧ. Высказываются утверждения, согласно которым НЧ плохо распознаются защитными механизмами вообще и, в частности, вызывают слабую аттракцию альвеолярных макрофагов и поэтому неэффективно выводятся из лёгких [13, 14]. Однако эти гипотезы представляются недостаточно убедительными с эволюционных позиций, поскольку все наземные позвоночные столкнулись с ингаляцией наночастиц (вулканической золы, распыляющейся морской воды, дыма лесных пожаров, сульфатов, образующихся в атмосфере в результате окисления ангидрида и т.д.) тогда же, когда и с ингаляцией микрочастиц, а все физиологические механизмы лёгочного клиренса частиц обнаруживаются уже у земноводных [11].
Сказанное не исключает возможности количественных разли-
чий реагирования этих механизмов на частицы разного размера, но такие различия следует искать на пути накопления конкретных экспериментальных данных, а не только теоретических предположений. При этом сопоставлять следует только те экспериментальные результаты, которые получены при действии нано- и микро-частиц одной и той же химической природы и при строгой параллельности тестирования их действия, что не всегда соблюдается.
Материалы и методы исследования. Для нашего исследования были синтезированы три образца химически идентичных частиц магнетита (Ре304) одинаковой намагниченности, но двух разных наноразмеров (10 и 50 нм) и одного микроразмера (1 мкм, т.е. 1000 нм). Для минимизации агрегации, присущей всем НЧ и в особенности магнитным, была отработана техника интратрахеального и внутрибрюшинного введения крысам суспензий, полученных ультразвуковым диспергированием. Процедура набора суспензии в шприц и введения ее в трахею под контролем зрения или в брюшину укладывается во временной интервал (в среднем, 28 сек), характеризующийся минимальной степенью агрегации наночастиц. Кинетика агрегации была предварительно изучена методом динамического рассеяния света на универсальном анализаторе суспензий ВгоокИауеп 2е1аР1ш (США). Все сравниваемые частицы вводились аутбредным лабораторным крысам-самкам:
• однократно интратрахеально в дозе 2 мг в 1 мл стерильной деи-онизированой воды, поскольку было найдено, что в суспензии на физиологическом растворе агломерация происходит слишком быстро;
• или по 3 раза в неделю в течение 5 недель внутрибрюшинно в дозе 500 мг/кг в 4 мл стерильной деионизированой воды.
Животные контрольных групп получали соответствующим путём такую же воду без частиц.
Наряду с оптической микроскопией клеточного осадка после цен-
трифугирования жидкости брон-хоальвеолярного лаважа (БАЛ), исследовалась также топография поверхности клеток БАЛ с нано-метрическим пространственным разрешением методом полуконтактной атомно-силовой микроскопии (пк-АСМ) с помощью зон-довой нано-лаборатории NTEGRA Therma (Россия) с использованием зондовых датчиков NSG01 высотой 10-15 мкм и радиусом закругления острия 10-15 нм. Содержание железа в тканях лёгких, печени и селезёнки и в крови определяли фотометрически, а в тканях печени и селезёнки - также методами атомно-адсорбционной спектроскопии (ААС) с помощью атомно-абсорбционного спектрографа SOLAAR M6, Thermo Scientific (США) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) с помощью спектрометра EMX Plus, Bruker (ФРГ).
Результаты и обсуждение. Как видно из таблицы 1, введение НЧ обоих размеров вызвало значительно более интенсивное увеличение общей клеточности брон-хо-альвеолярного лаважа (БАЛ), чем введение микрочастиц, однако, такая реакция на 10-наномет-ровые частицы была несколько слабее, чем на 50-нанометровые. Последнее, вероятно, связано с более быстрым освобождением лёгких от мельчайших частиц, в частности, в силу их большей растворимости.
Эта гипотеза была подтверждена в специально поставленном эксперименте (табл. 2): надфоно-вое (сверх контрольного уровня) содержание железа через 24 часа после введения магнетита было в случае 10-нанометровых частиц вдвое ниже, чем в случае 50-нано-метровых и 1-микрометровых (при отсутствии различия между двумя последними).
Судя по увеличению отношения НЛ/АМ, цитотоксичность наноча-стиц диаметром 10 нм несколько выше, чем у наночастиц диаметром 50 нм, при том что обе эти фракции нанометрового диапазона значительно цитотоксичнее, чем микрометровые частицы того же вещества (табл. 1).
Значками помечены: «*» - статистически значимое различие с контрольной группой;
«•» - то же с группой «10 нм»;
«□» -то же с группой «1 мкм» (Р<0,05);по критерию Стьюдента).
Таблица 2
Содержание железа в лёгочной ткани крыс через 24 часа после интратрахеального введения 2 мг магнетита с разным размером частиц или дистиллированной воды (X±s.e.)
Таблица 1
Основные цитологические характеристики БАЛ через 24 часа после интратрахеального введения крысам суспензии магнетита (2 мг/мл) в различных фракциях (х±Sх).
Диаметр частиц Число клеток, млн. НЛ/АМ
Общее Альвеолярные макрофаги (АМ) Нейтрофильные лейкоциты (НЛ)
- 2,86±0,48 2,30±0,40 0,33±0,06 0,16±0,03
10 нм 20,07±3,86*° 2,83±0,63 16,32±3,06*° 6,39±0,66*°
50 нм 31,86±6,52*° 5,74±1,25*п* 25,40±5,54^ 5,05± 0,69 *□
1 мкм 4,22±0,63* 1,67±0,33* 2,15±0,37** 1,61±0,37**
Группы крыс, которым были введены суспензии частиц диаметром:
10 нм 50 нм 1 мкм Контроль (вода)
Содержание железа (мг/кг сырой ткани)
200 ± 9* 257 ± 8*+ 258 ±15*+ 141 ± 5+
Разность между группой, получившей магнетит, и контрольной
59 ± 10 116 ± 9+ 117 ±16+ _-_1
Значком * обозначены величины, статистически значимо отличающиеся от контрольного показателя; значком + то же от показателя группы крыс, получивших 10-нанометровые частицы (Р<0.01 по критерию, учитывающему стандартную ошибку сложных средних, при котором данные по каждой крысе рассматриваются как выборка, состоящая из 5 определений).
По-видимому, как мельчайшие размеры частиц, так и особенности нано-структуры вещества, делающие его особо биологически агрессивным, могут, с другой стороны, служить и причиной повышенной растворимости отлагающихся в легких частиц, обусловливающей ускоренный пульмонарный клиренс, а потому в конечном итоге - ослабленное развитие патологических изменений. Такое двойственное значение растворимости давно известно по отношению к ультратонким аэрозолям конденсации диоксида кремния в сравнении с кварцевой пылью [4].
Высокая цитотоксичность нано-магнетита подтвержда-
ется и при сравнительном тестировании взвеси 10-наномет-ровых частиц этого вещества с другими минеральными взвесями, имеющими распределение частиц по размерам в широком диапазоне, характерном для обычных промышленных аэрозолей дезинтеграции. Как видно из таблицы 3, оксид железа в нано-состоянии оказался гораздо более агрессивен, судя по показателю НЛ/АМ, не только по сравнению с другим относительно «инертным» веществом, каким является диоксид титана, но и с высоко силикозоопасной кварцитной пылью.
При подсчете частиц, видимых внутри фагоцитирующих их клеток с помощью иммерсионной
оптической микроскопии с увеличением х1000 (табл. 4), установлено, что мало «нагруженные» частицами макрофаги и нейтрофилы составляют в 1,7-2,0 раза меньший процент от общего числа соответствующих клеток в бронхо-альвеолярном лаваже тех легких, в которые были введены 10-на-нометровые частицы, по сравнению с теми, в которые были введены 50-нанометровые. Таким образом, фагоцитоз последних был менее активен. При этом НЧ обоих размеров поглощались и макрофагами, и нейтрофилами заметно активнее, чем микрометровые. Особо активный фагоцитоз 10-нанометровых частиц является ещё одной вероятной причиной менее существенной
Таблица 3
Основные цитологические характеристики БАЛ через 24 часа после интратрахеального введения крысам суспензии 10-нанометровых частиц магнетита (10 нм) или полидисперсных суспензий Т102 и 8102 (2 мг/мл) (х±8х).
Введенный материал Число клеток, млн. Отношение НЛ/АМ
общее АМ НЛ
- 2,86±0,48 2,30±0,40 0,33±0,06 0,16±0,03
Нано-магнетит 8,09±2,84 1,31±0,41 6,70±2,48** 5,10±0,65*^
Диоксид титана 3,34±1,60 2,34±1,12 0,79±0,40 0,32±0,02*^
Кварц 3,68±1,00 1,68±0,48 1,8±0,53* 1,12±0,15**
Значками помечены: «*» - статистически значимое различие с контрольной группой; «•» - с группой «ТЮ2» «□» - с группой «кварцит»
Таблица 4
Процентное распределение фагоцитоспособных клеток с разной степенью нагрузки частицами магнетита сравниваемой дисперсности.
Альвеолярные макрофаги (АМ) Нейтрофильные лейкоциты (НЛ)
% АМ с 0 - 20 частицами % АМ с >20 частицами % НЛ с 0 - 20 частицами % НЛ с >20 частицами
Через 24 часа после введения частиц 10 нм.
9,38±0,25% □ 90,62±0,35% □ 42,66±0,28% □ 57,34±0,38% □
Через 24 часа после введения частиц 50 нм.
19,09±0,21% •□ 80,91±0,21% •□ 72,55±0,18% •□ 27,45±0,19% •□
Через 24 часа после введения частиц 1000 нм.
64,00±0,16% • 36,00±0,16% • 97,75±0,08% • 2,25±0,08% •
Значками помечены: «•» - статистически значимое различие с группой «10 нм»
«□» - с группой «1 мкм» (Р<0,001 по критерию, учитывающему стандартную ошибку сложных средних, при котором данные по каждой крысе рассматриваются как выборка, состоящая из п клеток).
задержки введенного материала в лёгких. Известно, что продукты макрофагального разрушения стимулируют как аттракцию АМ и особенно НЛ, так и фагоцитарную активность макрофагов по отношению к 1-микрометровым полистирольным тест-частицам [1]. Это позволяет объяснить прямое соответствие между цито-токсичностью разных по размеру частиц магнетита и «жадностью» их поглощения жизнеспособными фагоцитами.
Микро-вдавления, обнаруживаемые с помощью пк-АСМ на поверхности клеток БАЛ (рис. 1), могут быть интерпретированы как следы инвагинации клеточной мембраны в процессе фагоцити-
рования частиц. Визуальная оценка зависимости числа и диаметра этих вдавлений от размера введенных в лёгкие частиц магнетита была подтверждена измерениями указанного диаметра и статистическим анализом результатов (рис. 2). Мы вновь видим, что активность фагоцитоза оказалась максимальной при действии частиц 10 нм и минимальной - при действии частиц 1 мкм. При этом число наиболее крупных микровдавлений на единицу клеточной поверхности, естественно, наиболее велико при действии 2-микрометровых и наименее - при действии 10-нанометровых частиц.
После субхронической вну-трибрюшинной затравки, судя по
большинству изученных функциональных показателей, приведенных в таблице 5, частицы магнетита размером 10 нм и 50 нм вызывают более существенные статистически значимые отрицательные сдвиги, чем частицы 1 мкм, причем при затравке магнетитом 10 нм они, как правило, выражены наиболее значительно. Большинство сдвигов носит неспецифический характер, являясь интегральными показателями интоксикации, но реакция со стороны красной крови может быть предположительно связана со специфической ролью железа в кроветворении. При этом только при введении мельчайших НЧ магнетита увеличение содержания
гемоглобина в крови было статистически значимым при значимом же (и наибольшем) повышении числа эритроцитов и особенно -доли ретикулоцитов в них.
Последний из названных сдвигов свидетельствует о стимуляции эритропоэза, которая в слу-чаевоздействия10-нанометровых частиц явно достигает степени, проявляющейся значимым повышением общего числа эритроцитов и содержания гемоглобина. Можно предположить, что возросшая потребность в железе для синтеза гема приводит к тому, что его содержание в сыворотке повышено по сравнению с контрольным при введении магнетита 10 нм значимо меньше, чем при введении магнетита 50 нм, несмотря на то, что первый из них обладает более высокой растворимостью и, очевидно, в большей мере проникает в кровь из первичного депо на месте введения. Тот факт, что магнетит 1 мкм дал наименьшее и при том статистически не значимое повышение этого показателя, вполне соответствует наименее высокой растворимости этой фракции.
Однако трактовка хемо-био-кинетики железа при внутри-брюшинном введении частиц магнетита разного размера усложняется тем обстоятельством, что в кровь, а через неё в паренхиматозные органы может проникать из первичного депо не только железо, резорбированное в ионо-молекулярной форме, но и не растворившиеся НЧ, причём эта способность к прямой пенет-рации, характерная для всех НЧ, по всей вероятности, тем выше, чем они мельче. Задержавшись же из крови в органах, богатых клетками ретикуло-эндотелиаль-ной системы, НЧ продолжают растворяться уже в них, причём и этот процесс должен быть особенно характерен для мельчайших НЧ в силу их наиболее развитой суммарной поверхности, что может ограничить итоговую задержку железа в ткани данного органа.
Результаты измерения содержания железа в тканях печени и
Рис. 1. Типичная топография поверхности клеток БАЛ приполуконтактной атомно-силовой микроскопии:
г [цт]
(Ь)
Ко
'40 г [цт]
Г30
г25 0
г20
10—г-
15 _
„. . 20 -„_
х [Цт] у [цт]
35
40 0
0
X [цт] 6
(С)
(а), (Ь) контрольная группа
г [цт] 0.0
5.0
7510.0 X [цт] 12.5
22.5 0
12 ^0
(е)
(с), (ф после введения магнетита 10 нм
г [цт]
1.1
1.5
1.0 у [цт]
25 0
3.0 о.о
(ё)
(е), (1) после введения магнетита 50 нм (И)
X 10
16^0
(И) после введения магнетита 1 мкм
селезёнки вполне согласуются с этими гипотезами. Как видно из рис. 3, определяемая методом ААС концентрация суммарного железа в печени и в селезёнке при в/б введении НЧ магнетита намного выше, чем при введении микрометровых частиц, при котором лишь слегка и при том
статистически не значимо выше, чем в органах контрольных крыс. В обоих органах (но особенно в селезёнке) оно несколько ниже при введении НЧ 10нм по сравнению с НЧ 50 нм. Такие же ранговые соотношения получены при параллельном фотометрическом определении содержания железа
10
10
3.5
в аликвотных порциях тканевых гомогенатов, результаты которого здесь не приводятся. Железо в исходной химической форме магнетита (который может оказаться в ткани только при переносе в неё не растворившихся частиц), определяемое методом ЭПР, практически отсутстсвует как у контрольных крыс, так и у получавших магнетит 1 мкм, но при введении НЧ обоих размеров его содержание очень велико в печени и особенно в селезёнке, при чём и там, и там оно несколько ниже в случае НЧ 10 мкм.
О том, что такое накопление железа в тканях может быть избыточным и приводить к его хорошо известным патологи-
ческим последствиям (гиперсидерозу), в проведенном нами эксперименте свидетельствуют гистопатологические изменения в печени и селезёнке. В печени крыс, получавших НЧ, строение долек нарушено; имеет место дискомплексация печеночных балок за счет отложения в большом количестве железосодержащего пигмента в виде конгломератов в перипортальных зонах, интралобулярно, местами центрилобулярно и в виде отдельных частиц в синусоидах. Железосодержащий пигмент определяется также в цитоплазме клеток Купфера. Гепатоциты находятся в состоянии глубокой вакуольной дистрофии, местами
отмечается их цитолиз. При этом выраженность и распространённость патологических изменений при действии магнетита 50 нм несколько выше, чем при действии магнетита 10 нм. Таким образом, более высокая гепатотоксич-ность первого соответствует более высокому накоплению на-ночастиц в органе. Изменения же в печени крыс, получавших магнетит 1 мкм, минимальны, что можно связать как с незначительным переходом этого материала в печень, так и с меньшей его тканевой токсичностью. Балочное строение печени не нарушено, лишь в части гепатоцитов отмечается гиалиново-капельная дистрофия; портальные тракты
Таблица5
Показатели Группы крыс, которым вводились суспензии частиц диаметром:
Контроль (вода) 10 нм 50 нм 1 мкм
Масса тела исходная, г 184,2±1,1 184,6±1,5 186,2±1,2 185,4±1,3
Масса тела после затравки, г 215,4±3,8 213,5±2,9 218,5±2,9 219,6±4,3
Гемоглобин в крови, г/л 130,1±2,9 140,7±4,1* 134,1±3,7 126,7±3,2
Эритроциты, 1012 г/л 5,4±0,1 5,8±0,1**ф 5,5±0,1* 5,4±0,1
Ретикулоциты, %% 11,3±0,7 53,6±1,9**ф 36,7±1,1** 14,7±2,0*
Число тромбоцитов х 10 3 /мкл 567,1 ± 10,65 547,0 ± 20,1 565,7 ± 5,5 563,6 ± 10,1
Лимфоциты,% 54,4±2,0 44,1±1,7** 43,7±2,9* 51,0±2,4
Сегментоядерные нейтрофилы, % 28,9±2,1 41,2±1,8** 40,8±2,7** 30,7±3,2
Общий белок в сыворотке крови, г/л 78,2±1,6 60,6±2,1** 65,7±2,1** 76,7±1,7
Альбумины в сыворотке крови, г/л 44,1±1,4 41,2±2,2 36,9±1,8* 38,9±1,3*
Глобулины в сыворотке крови, г/л 34,1±1,3 19,4±1,5**ф 28,8±2,2** 37,8±1,7
А/Г индекс 1,32±0,07 2,355±0,31**^ 1,47±0,23 1,07±0,08*
Активность сукцинатдегидрогеназы, число гранул на 50 лимфоцитов 764,7 ± 14,5 692,7 ± 8,1** 703,6 ± 7,9** 762,3 ± 10,5
Коэффициент де Ритиса 1,29±0,056 1,70±0,14*ф 1,33±0,06 1,41±0,1
Общее железо мкмоль/л 77,1 ± 5,12 168 ± 18,7 **ф 263 ± 16,9 *• 92 ± 7,73
МДА в сыворотке крови, нмоль/л 4,4±0,11 6,01±0,34** 6,3±0,3** 4,42±0,12
Церулоплазмин 23,7±2,1 31,5±1,95** 27,8±1,8 24,8±2,1
Активность Г-глутаминтрансферазы в сыв. крови, нмоль/(с*л) 1889,12 ± 121,5 2408,8 ± 136,8** 2294,5 ± 126,2** 1982,8 ± 68,3
Активность щел. фосфатазы в сыв. крови, нмоль/ (с*л) 928,2 ± 127,0 1244,9 ± 213,4* 1144,7 ± 138,3* 700,5 ± 73,9
Копропорфирин в моче, нмоль/л 71,1±8,5 127,5 ± 23,2* 121,2 ± 15,8* 142,8 ± 20,8*
Креатинин в моче, ммоль/л 0,12 ± 0,01 0,16 ± 0,02^ 0,24 ± 0,03** 0,12 ± 0,01
Примечание «*» - изменение статистически значимо в сравнении с интактным контролем; «•» - с группой 1 мкм; «ф»-с группой 50 нм (Р < 0,05)
Некоторые показатели состояния организма крыс после внутрибрюшинного введения магнетита с размером частиц 10 нм, 50 нм, 1 мкм в течение 5 недель в суммарной дозе 7500 мг/кг
Рис. 2. Средняя поверхностная плотность на поверхности клеток БАЛ (а) микро-вдавлений всех поперечных размеров и (б) микро-вдавлений поперечного размера > 1мкм в зависимости от размерности введенных частиц магнетита (х^Б).
(а)
1 0,830±0,009 1 Г
_1_
контроль 10нм
0,553±0,004
0,422±0,004
50нм
1 мкм
(б)
0,02
: 0,01
0,0
Т-1-
0,0215±0,0005
0,0099±0,0002
0,0052±0,0004 0,0045±0,0002
_1_
_1_
контроль 10нм
50нм
1 мкм
Рис. 3. Среднее значение суммарной концентрации железа в тканях (а) печени и (б) селезенки крыс по группам крыс, получавших магнетит с частицами разного размера. Метод ААС.
(а)
5000
4000 3000 2000 1000 0
10нм
50нм
1 мкм
контроль
(б)
12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
10нм
50нм
1 мкм
контроль
Рис. 4. Среднее значение концентрации железа в форме магнетита в тканях (а) печени и (б) селезенки крыс по группам крыс, получавших магнетит с частицами разного размера. Метод ЭПР.
4000
3000
1 2000 -
1000
(а)
10000
8000
г Е
6000
• 4000
<3 2000
10нм
50нм
1 мкм
контроль
(а)
10нм
50нм
1 мкм
контроль
интакты. Синусоидальные пространства свободны, единичные мелкие гранулы железосодержащего пигмента содержатся только в клетках Купфера. В селезёнке также видны значительно более выраженные изменения при действии НЧ обоих размеров (обширные отложения глыбок железосодержащего пигмента в красной пульпе, а иногда и в сдавленных фолликулах белой пульпы, в которых от-
мечаются светлые реактивные центры) по сравнению с действием микрометровых, при котором гистологическая картина этого органа мало отличается от контрольной.
Заключение. Проведенное исследование свидетельствует в пользу существующих представлений о более высокой токсичности в нано-состоянии даже тех веществ, которые при действии частиц микрометрово-
го диапазона являются относительно биологически инертными. Вместе с тем, в пределах нанометрового диапазона зависимость токсичности от размера частиц является неоднозначной в связи со сложными и нередко противонаправленными соотношениями между биологической агрессивностью наночастиц, с одной стороны, и сложными механизмами, контролирующими их биокинетику, с другой.
Что же касается не менее распространённой гипотезы о якобы неспособности защитных физиологических механиз-
мов распознавать наночастицы и адекватно реагировать на их поступление в организм, то по крайней мере, в отношении фа-
гоцитарной реакции самоочищения глубоких дыхательных путей эта гипотеза должна быть отвергнута.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кацнельсон Б.А., Алексеева О.Г., Привалова Л.И., Ползик Е.В. Пневмокониозы: патогенез и биологическая профилактика. Екатеринбург: УрО РАН, 1995.- 325 с.
2. Методические рекомендации.// Использование клеточных систем «ин виво» и «ин витро» для ускорения гигиенической регламентации малорастворимых промышленных аэрозолей. Екатеринбург, - 1995.- 28 с.
3. Онищенко Г.Г., Арчаков А.И., Бессонов В.В., Бокитько Б.Г., Гинцбург А.Л. и др. Методические подходы к оценке безопаст-ности наноматериалов. «Методологические проблемы изучения и оценки био- и нано-технологий (нановолны, частицы, структуры, процессы, биообъекты) в экологии человека и гигиене окружающей среды». Материалы пленума. Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды РАМН и Минздравсоцразвития Российской Федерации. Под ред. Рахманина Ю.А. Москва, 2007. С. 4-25.
4. Петин Л.М. К обоснованию предельно допустимой концентрации кремнезёмсо-держащих аэрозолей конденсации. Гигиена труда. 1978.- № 6.- С. 28-33.
5. Bastus NG, Casals E, Socorro V-C and Puntes V. Reactivity of engineered inorganic nanoparticles and carbon nanostructures in biological media. Nanotoxicology. 2008.-№2.-Р. 99-112.
6. Donaldson K, Stone V, Tran CK, Kreyling W and Borm PJ. Nanotoxicology (editorial). Occupat Environm Med. 2004.- V.61.- Р. 727-728.
7. Katsnelson B.A., Konysheva L.K., Privalova L.I., Morosova K.I.. Development of
a multicompartmental model of the kinetics of quartz dust in the pulmonary region of the lung during chronic inhalation exposure of rats. Brit J Industr Med.- 1992.- V.49.- P. 172-181.
8. Katsnelson B.A., Konysheva L.K., Privalova L.I., Sharapova N.Y. Quartz dust retention in rat lungs under chronic exposure simulated by a multicompartmental model: further evidence of the key role of the cytotoxicity of quartz particles. Inhalation Toxicol.- 1997.- V.9.- P. 703-715.
9. Katsnelson B.A., Konysheva L.K., Sharapova N.Y., Privalova L.I. Prediction of the comparative intensity of pneumoconiotic changes caused by chronic inhalation exposure to dusts of different cytotoxicity by means of a mathematical model. OEM.- 1994.- V. 51.- P. 173-180.
10. Katsnelson B.A. and Privalova L.I. Recruitmant of pagocytizing cells into the respiratory tract as a response to the cytotoxic action of deposited particles. Environm. Health Perspect. 1984. - V.55.- P. 313-325.
11. Kilburn K.H. Alveolar clearance of particles. A bullfrog lung model. Arch Environm Health. 1969.- V.18.- P.556-563.
12. Klarisson H.L., Gustaffson J., Cronholm P. and Moller L. Size-dependent toxicity of metal oxide particles - a comparison between nano- and micrometer size. Toxicol Lett. 2009.-V.- 188.- P.112-118.
13 . Li, N., Xia T. and Nel A.E. The role of oxidative stress in ambient particulate matter-induced lung diseases and its implications in the toxicity of engineered nanoparticles. Free Rad. Biol. Med. 2008.- V.- 44.- P.1689-1699.
14. Oberdorster G., Oberdorster E., Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studied of ultrafine particles. Environm. Health Perspect. - 2005. - V.113. - P.823-839
15. Privalova L.I, Katsnelson B.A, Osipenko A.B, Yushkov B.H and Babushkina L.G. Response of a phagocyte cell system to products of macrophage breakdown as a probable mechanism of alveolar phagocytosis adaptation to deposition of particles of different cytotoxicity. Environm Health Perspect. 1980.- V.- 35.- P. 205-218.
16. Privalova L.I, Katsnelson B.A, Sharapova N.Ye and Kislitsina N.S. On the relationship between activation and the breakdown of macrophages in pathogenesis of silicosis. Medic Lavoro. 1995.- V.- 86.-P.511-521.
17. Privalova L.I, Katsnelson B.A and Yelnichnykh L.N. Some peculiarities of the pulmonary phagocytotic response, dust kinetics, and silicosis development during long term exposure of rats to high quartz levels. Brit J Ind Med. 1987.- V.- 44.- P.228-235.
18. Warheit D.B, Reed K.L, Sayes C.M. A role fore surface reactivity in TiO2 and quartz-related nanoparticle pulmonary toxicity. Nanotoxicology. Published online on 26 June 2009.
19. Warheit D.B., Webb T.R., Colvin V.L., Reed K.L., Sayes C.M. Pulmonary bioassay studies with nanoscale and fine-quartz particles in rats: toxicity is not dependent upon particle size but on surface characteristics. Toxicol Sci. 2007.- V.- 95.- P.270-280.
Katsnelson B.A.1, Privalova L.I.1, Kuzmin S.V.1, Degtyaryova T.D.1. Sutunkova M.P.1, Minigaliyeva I.A.1, Yeryomenko O.S.1, Kireyeva Ye.P.1, Khodos M.Ya.2 , Kozitsina A.N.2, Malakhova N.A.2, Glazyrina Yu.A.2, Shur V.Ya.3, Shishkin Ye.I.3, Nikolayeva Ye.V.3, Valamina I.Ye.4
Experimental data pertaining to the assessment of pulmotoxicity and absorptive toxicity of particles of magnetite (Fe3O4) within nano- and micrometric ranges
1Ekaterinburg Medical Scientific Center for Health Promotion and Protection of Industrial Workers
2Scientific and Production Commissioning Enterprise «ИВА»
3A.M. Gorkiy Ural State University
4Ural State Medical Academy, Ekaterinburg
A comparative assessment of toxicity of magnetite (Fe3O4) particles within the nanometric (10 nm and 50 nm) and micrometric (1 nm) ranges was conducted basing on shifts in the cell composition of the bronchioalveolar lavage liquid 24 h after intratracheal administration of these particles as well as on a number of indicators of the organism status after repeated intraperitoneal injections of the same materials. Mass doses being equal, nanoparticles show a significantly more expressive biological aggressiveness than particles within the micrometric range, but induce a more active and effective protective response of alveolar phagocytocis. The relationship between the diameter and absorptive toxicity of particles is ambiguous within the nanometric range which could be linked to toxicokinetic differences controlled both by physiological mechanisms and direct penetration of nanoparticles through biological barriers and eventually by different solubility.
Материал поступил в редакцию 18.01.2010 г.
