CC BY
35
Канюков В.Н., Стадников А.А., Трубина
О.М., Подопригора Р.Н., Казеннов А.Н. Оренбургский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад.
С.Н. Федорова Росмедтехнологии»
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДОНОРСКОГО МАТЕРИАЛА, КОНСЕРВИРОВАННОГО В УСЛОВИЯХ ВАКУУМА
Представлены результаты экспериментально-гистологического исследования донорского материала и алгоритм технологии консервации донорских тканей. Обосновано использование консервированных трансплантатов в условиях вакуума для целей пластической офтальмохирургии.
Актуальность
Ухудшение экологической, криминальной и социальной обстановки в последние годы привело к увеличению врожденной и приобретенной патологии органа зрения у детей. К тому же технический прогресс, компьютеризация ведут к неуклонному росту зрительных нагрузок, в связи с чем увеличивается число лиц с миопией. Причинами инвалидности у детей являются осложненная миопия, атрофия зрительного нерва, последствия травм глаза, врожденное недоразвитие глаз, кератоконус, кератоглобус и др. (Е.А. Каспарова, 2003; З.Д. Беркен-Хаева, 2006; В.Г. Ермолаев, В.Н. Алексеев, В.Ю. Тегза, А.В. Ермолаев, 2008). Для реабилитации данной категории больных требуется проведение склероукрепляющих и реваскуляризирующих операций, послойных, сквозных кератопластик и др. (Н.Н. Пивоваров, Э.Ф. Приставко, Ю.К. Ширшиков, 1976; Т.П. Малышева, 1985; Э.С. Аветисов, 1999; О.И. Кашура, 2008). Для этих целей требуется наличие достаточного количества пластического материала.
Потребности в трансплантационном материале выполняют созданные Глазные банки. С целью длительного сохранения донорского материала его подвергают предварительной консервации. Наличие множества методик консервации и постоянные исследования в этой сфере свидетельствуют о том, что существующие методы не достаточно отвечают всем требованиям.
Широкое применение вакуума в медицине при лечении ряда заболеваний: инфаркта миокарда, остеохондроза, артрита (А.М. Жиб-риль, 1990), бронхиальной астмы, хронических риносинуситов (С.К. Жуков, 1998), в терапии раневых процессов (Ю.А. Давыдов, 1975; Г.Н. Пономаренко, 2000) и т. д. дало нам основание применить данный фактор в консервации тканей.
В Оренбургском филиале «МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова Росмедтехнологии» предложен альтернативный способ консервации донорских тканей - вакуумная консервация при гипотермии (В.Н. Канюков, 2005).
Цель
Обосновать технологию консервации донорских тканей в условиях вакуума для пластической офтальмохирургии на основании результатов экспериментально-гистологических исследований.
Материал и методы
С целью изучения гистологической структуры донорских тканей, консервированных в условиях вакуума, нами исследованы материалы роговицы, аорты, твердой оболочки головного мозга. Для проведения работы было использовано 24 роговицы, 8 фрагментов аорты и 8 фрагментов твердой оболочки головного мозга. Роговица была подвергнута консервации в сроки 3, 7 и 14 суток, а аорта и твердая оболочка головного мозга в сроки 3, 7, 14 и 30 суток. Затем, в указанные сроки материал дегидратировали в этаноле возрастающей крепости (50°-100° С) и заливали в парафин-целлоидин. Гистологические срезы, толщиной 5-6 мкм, после депара-финирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, перйодатом К и реактивом ШИФФА (контроль с амилазой), пикрофук-сином по Ван - Гизону, а также альциановым синим (рН-7,8) по Стидмену.
Метод консервации, который мы предлагаем, относится к разделу физических. Преимуществами его являются: понижение давления воздуха, отсутствие активной составляющей воздуха - кислорода, что замедляет окислительные процессы, а это, в свою очередь, ведет к уменьшению энергетических затрат в тканях.
Упоминаний о применении вакуума для консервации донорских тканей в офтальмохирургии в литературе нет.
Вакуумная система изготовлена фирмой Zepter в Menfe Jndustria, Sp.A (Италия), основана на современных высоких промышленных технологиях. Это уникальная, всемирно известная система нашла широкое применение в пищевой промышленности для подготовки, хранения и быстрого здорового приготовления любого вида продуктов. При сроке хранения от 10 дней до года в продуктах сохраняются все питательные вещества (белки, минеральные вещества и т. д.), сохраняется их внешний вид и органолептические свойства.
Это дало основание полагать, что в условиях вакуума возможна длительная сохранность и донорских тканей, что обеспечивается предотвращением размножения бактерий и замедлением процессов аутолиза и перекис-ного окисления липидов цитологических структур.
Система представляет собой вакуумный насос для откачивания воздуха и контейнера для хранения материала. Эргономичная форма насоса удобна в обращении, он имеет легко переносимую удобную подставку. Контейнер представляет собой стеклянную емкость, он снабжен специальной сеткой, изготовленной из эластомера. Сетка выполняет не только функцию подставки для размещения емкостей с донорскими тканями, но и служит для отделения влаги из тканей. Максимальное разряжение, которое можно получить при использовании данной системы 0,5 атм (низкий вакуум). Герметичность емкости контейнера обеспечивается клапаном в центре крышки и силиконовой прокладкой, проходящей по ее краю. Крышка универсальна, изготовлена из ударопрочного нетоксичного поликарбоната LEXAN. Она имеет календарное кольцо для установки даты ва-куумирования.
Емкость практична, безопасна, удобна в обращении, легка, устойчива к нагреванию и холоду, легко моется. Ее можно стерилизовать, она не взаимодействует с химическими веществами.
Лаборатория Глазного банка Оренбургского филиала ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» оснащена несколькими видами
вакуумных систем. Системы отличаются моделями контейнеров. Они разные по своей емкости и основанию. Имеются варианты контейнеров с квадратной основой, с прямоугольной и круглой.
Используемые модели контейнеров зависят от вида консервированной ткани.
Емкости контейнеров не только практичны, но и имеют привлекательный дизайн, что способствует оптимальному процессу работы.
Способ консервации донорского материала в вакууме осуществляли в следующей последовательности:
1. Донорский материал (трансплантат) укладывали на дно стерильного бюкса, который устанавливали на сетку, расположенную на дне пластмассового контейнера с крышкой с силиконовой прокладкой. В центре крышки имеется отверстие с клапаном, к которому присоединяется вакуумный насос.
2. Откачивали воздух из контейнера до 0,5 атм.
3. Отсоединяли контейнер от насоса и помещали его в бытовой холодильник, где поддерживали температуру порядка (+)20- (+)40С.
Получена приоритетная справка «Способ консервации донорских тканей в офтальмохирургии» (В.Н. Канюков, 2006 г.).
Развитие новых технологий в пластической офтальмохирургии тесно связано с изучением особенностей пролиферации и цитодифферен-цировок трансплантируемых объектов. Для успешной трансплантации ведущим является сохранение фибриллоархитектоники в трансплантатах.
Результаты и обсуждение
Результаты гистологических исследований роговицы, подверженных экспозиции в вакууме в течение 3-х суток не показали существенных структурных изменений ее эпителиальных и соединительнотканных элементов. Передний эпителий, собственное вещество роговицы, передняя и задняя пограничные мембраны, а также эндотелий сохранили типичную структурную организацию. Через 7 суток консервации определены признаки дискомплексации десцеметовой мембраны (оболочки) роговицы, что проявилось в ее разрыхлении и локальной складчатости. Это сочеталось с эрозивными изменениями клеток «заднего» эпителия. Боуменова мембрана при этом была не повреждена на всем протяжении.
Через 14 суток указанные явления деструкции десцеметовой оболочки нарастали. К ним добавились процессы некробиоза и лизиса многослойного плоского неороговевающего эпителия и боуменовой мембраны. Было установлено, что оптимальным сроком консервации роговицы следует считать 3 суток.
Анализ гистопрепаратов показал, что оптимальным режимом консервации для аорты является 14-30 суток. В эти сроки аорта (ее средняя оболочка) имеет сохранный эластический каркас, без признаков разволокнений, разрыхлений и деструкции. Гладкие мышечные клетки с пикноморфными ядрами и узким ободком цитоплазмы единичны. Аморфный матрикс, расположенный между эластическими мембранами содержит амилазоустойчивые гликопротеины и сульфатированные фракции гликозами-ногликанов. В более ранние сроки консервации гистоструктура эластического каркаса и гистохимический состав аорты аналогичны. Однако между мембранами располагается значительное число гладких миоцитов. Они имеют крупные ядра с деконденсированным хроматином, большой ободок базофильной цитоплазмы, что свидетельствует об их цитофизиологической сохранности, а, следовательно, и о высокой им-муногенности.
Твердая оболочка головного мозга имеет оптимальную гистоструктуру в сроки 7-10 дней консервации. В эти сроки она состоит из плотной волокнистой соединительной ткани, с сохранением преимущественно эластических волокон. Основная масса пучков соединительнотканных волокон ориентирована продольно, меньшая часть -косопоперечно. Клеточные элементы (типа фиброцитов) единичны. В аморфном межклеточном веществе идентифицированы гликопротеины и гликозаминогли-каны, количество которых визуально начинает значительно снижаться через 10 суток консервации. Следует особенно подчеркнуть, что через 14 и особенно 30 суток консервации в твердой оболочке головного мозга происходят процессы дискомплексации волокнистых структур, а углеводные биополимеры не определяются. Это в свою очередь приводит к разрыхлению пучков соединительнотканных волокон, их микроповреждениям, разволокнени-ям с формированием значительных дефектов стромы.
Заключение
Результаты проведенных нами исследований показали, что предложенный нами альтернативный способ консервации донорских тканей в вакууме обеспечивает их длительную сохранность. Отсутствие дестабилизирующих расстройств в консервированных тканях рассматриваются как критерии оценки доказательства возможности использования подобных аллотрансплантатов для целей офтальмохирургии.
Консервация донорских тканей в условиях вакуума при гипотермии - проста, экономична и позволит иметь достаточный запас трансплантационного материала.
Список использованной литературы:
1. Аветисов Э.С. Близорукость. М.: Медицина, 1999. - 286 с.
2. Малышева Т. П. Эффективность аллосклеропластики заднего полюса глаза при быстро прогрессирующей миопии у детей и подростков. Автореф. дис... канд. мед. наук // М. - 1985. - 184 с.
3. Пивоваров Н.Н., Приставко Э.Ф., Ширшиков Ю.К. Простой метод хирургической профилактики прогрессирования близорукости // Материалы 1-й Всесоюз. конф. по вопросам детск. Офтальмол. - М., 1976. - С. 141-146.
4. Жибриль А.М. Вакуумфонофорез соединений лития в комплексном лечении больных ревматоидным артритом // Одес. НИИ курортологии и мед. реабилитации. -Одесса, 1990. - С. 16.
5. Жуков С.К. Лечение хронических риносинуситов у больных бронхиальной астмой методом вакуумного дренажа синус - катетером «Ямик» // Яросл.обл. клинич. больница. - СПб., 1998. - С. 21.
6. Давыдов Ю.А. с соавт. Вакуум - терапия ран и раневой процесс. - М.: Медицина, 1999. - 140 с.
7. Пономаренко Г. Н. Вибровакуумтерапия. Сб. статей науч.-прак. общ-ва врачей-косметологов С.-Петербурга. -СПб., 2000. - Вып. 1. - С. 83-86.
8. Ермолаев В.Г., Алексеев В.Н., Тегза В.Ю, Ермолаев А.В. Структура первичной глазной инвалидности у детей с офтальмопатологией // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Федоровские чтения»: Сборник научных статей. - М., 2008. - С. 30-31.
9. Кашура О.И. Детское отделение в структуре Хабаровского филиала ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза»: итоги и перспективы // Юбилейная научно-практическая конференция «Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний органа зрения»: Сборник научных статей. - Хабаровск, 2008. - С. 70-77.
10. Каспарова Е.А. Ранняя диагностика, лазерное и хирургическое лечение кератоконуса Автореф. дис.. док. мед. наук. - М., 2003. - 44 с.
11. Беркен-Хаева З.Д. Медико-социальный анализ офтальмопатологии у детей Республики Ингушетии // Проблемы офтальмологии. - 2006. - №2. - С. 30-31.
