CC BY
81
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА ПРИ РАСПРОСТРАНЕННОМ ПЕРИТОНИТЕ
А.Н. Чмыхова, Е.Б. Артюшкова, О.Б. Сеин, Е.В. Артюшкова
Аннотация. По результатам проведенного экспериментального исследования на модели распространенного перитонита у крыс установлено нарушение микроциркуляции при патоморфологических изменениях в стенке тонкого и толстого кишечника, париетальной брюшине. Введение антиоксиданта растительного происхождения дигидрокверцетина и его комбинации с иммуномодулятором Галавит® нормализует показатели микроциркуляции кишечной стенки, а также снижает выраженность морфологических изменений, вызванных моделированием распространенного перитонита у крыс.
Ключевые слова: перитонит, микроциркуляция стенки кишечника, дигидрокверцетин, антиоксиданты, иммуномодулятор.
До настоящего времени распространенный гнойный перитонит остается одним из самых частых и грозных осложнений в абдоминальной хирургии. Средние показатели летальности при распространенном перитоните удерживаются на уровне 20-30%, достигая при наиболее тяжелых его формах 80-90% (Суковытых Б.С. и др., 2005). Основной причиной летальности является абдоминальный сепсис с тяжелой полиорганной недостаточностью (Савельев В.С. и др.) и синдромом интра-абдоминальной гипертензии (Суковытых Б.С. и др., 2010). Развитие системной воспалительной реакции при перитоните сопровождается активацией целого ряда факторов, влияющих на характер течения и исход заболевания, важное значение среди которых имеют активация процессов свободнорадикального окисления, нарушение синтеза оксида азота, выброс значительного количества медиаторов воспаления, повреждение сосудистого эндотелия, нарушения микроциркуляции. При развитии энтеральных нарушений также страдает местный иммунитет вследствие недостаточности иммунной системы тонкой кишки и формируется или усугубляется вторичный (общий) иммунодефицит организма (Алешин Д.А., 2009).
Поэтому наиболее актуальным в настоящее время является внедрение эффективных и патогенетически обоснованных методов антиоксидантной терапии и им-мунокоррекции при распространенном перитоните. В этой связи определенный интерес может представлять изучение возможности коррекции системной воспалительной реакции при перитоните путем применения антиоксиданта из лиственницы - дигидрокверцетина и иммуномодулятора Галавит® в качестве дополнения к стандартной терапии при распространенном перитоните.
Цель работы: провести комплексное сравнительное изучение эффективности использования дигидроквер-цетина и Галавита® для коррекции нарушений микроциркуляции и морфологических изменений при распространенном перитоните в эксперименте.
Исследование выполнено на половозрелых крысах-самцах линии «Wistar», массой тела 200-250 г. Эксперимент проводился в соответствии с Правилами лабораторной практики (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»).
Этические принципы обращения с лабораторными животными соблюдались в соответствии с «European Convention for the protection of Vertebral Animals Used
for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123». Для выполнения работы использовались животные без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим. Крысы содержались в одинаковых условиях, на стандартном пищевом режиме.
Животные были разделены на 7 групп: интактную, контрольную и опытные (5 групп). Интактную группу составили 10 крыс без моделирования перитонита, у которых измерялся уровень нормального внутрибрюш-ного давления.
Контрольную группу составили крысы, у которых моделировался перитонит и синдром интраабдоми-нальной гипертензии (СИАГ). Распространенный перитонит вызывался путем внутрибрюшного введения 10% каловой взвеси, которая вводилась в разных направлениях в объеме 0,5 мл на 100 г массы тела животного (Лазаренко В.А. и др., 2008). Моделирование СИ-АГ проводили путем создания дубликатуры апоневроза по передней стенке брюшной полости (Суковытых Б.С. и др., 2010).
В опытные группы вошли животные, которым после моделирования распространенного перитонита, осложненным синдромом интраабдоминальной гипер-тензии, вводились ежедневно в течение 10 суток следующие препараты: дигидрокверцитин (ДГК) перо-рально в дозе 7,7 мг/кг/сут, Галавит® внутримышечно (в/м) в дозе 8,6 мг/кг/сут, Мексикор® в/м в дозе 60 мг/кг/сут, комбинация Мексикор® 60 мг/кг/сут + Галавит® 8,6 мг/кг/сут, комбинация ДГК 7,7 мг/кг/сут + Галавит® 8,6 мг/кг/сут. Через 48 часов от начала эксперимента в контрольной и опытных группах выполнялась повторная операция - релапаротомия, санация брюшной полости антисептическим раствором (0,02% раствор фурациллина), устранение дубликатуры передней брюшной стенки, путем закрытия лапаротомной раны «край в край».
Операции и все манипуляции с животными проводились с использованием общего обезболивания, а эвтаназия - путем передозировки средств для наркоза в соответствии с п.8 «Правила гуманного обращения с лабораторными животными». В качестве средства для наркоза использовали хлорал гидрат 300 мг/кг внутри-брюшинно.
Рисунок 1 - Измерение показателей микроциркуляции у лабораторной крысы
Рисунок 2 - Динамика микроциркуляции в стенке тонкой кишки крыс в сравниваемых экспериментальных группах
Измерение объемного кровотока в микроциркуля-торном русле производилось с помощью лазерного до-плеровского флоуметра (ЛДФ) фирмы «Biopac Systems .Inc.» МР-100 с датчиком TSD-144 и программы Acqknowledge 3.8.1 (Артюшкова Е.Б.,2009). Измерение показателей микроциркуляции выполнялось в стенке тонкой кишки, в 3-х точках, на расстоянии 2 см, 5 см и 7 см от илеоцекального угла в проксимальном направлении в стенке тонкой кишки (рисунок 1). Показатели микроциркуляции имели вид ЛДФ-грамм и выражались в перфузионных единицах (п.е.).
Для морфологического подтверждения развития патологических процессов исследовали тонкий, толстый кишечник, париетальную брюшину. Кусочки органов фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятым методикам (Меркулов Г.А., 1969).
Среднее значение уровня микроциркуляции в стенке тонкой кишки интактных крыс составляет 285,22±7,64 п.е. Данный результат не имеет значимых отличий от результатов, полученных другими авторами, применявшими модель перитонита для исследования микроцир-куляторных нарушений (Фролова О.Г., 2011).
При микроскопическом исследовании тонкой кишки интактных животных показано, что слизистая оболочка, подслизистый слой и серозная оболочка имеют обычное гистологическое строение, дегенеративные и воспалительные изменения отсутствуют.
После моделирования распространенного перитонита уровень микроциркуляции в стенке тонкой кишки резко снижается, восстановление его начинается лишь после 4-х суток, однако до 10-х суток остается достоверно ниже значения, зарегистрированного в группе интактных животных (рисунок 2).
В контрольной группе животных на 2-е сутки после моделирования перитонита в париетальной брюшине отмечается слабая воспалительная инфильтрация (рисунок 3).
В слизистой и подслизистой оболочке тонкого и толстого кишечника развивается воспаление, наиболее выраженное на 4-е сутки. Также отмечаются выраженные расстройства микроциркуляции в виде капиллярного полнокровия и стазов эритроцитов (рисунок 4). На 10-е сутки
воспалительная реакция в строме ворсин кишечника еще значительно выражена, при этом в части ворсин начинают развиваться атрофические изменения (рисунок 5).
Рисунок 3 - Слабая воспалительная инфильтрация в париетальной брюшине в контрольной группе на 2-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 4 - Капиллярное полнокровие и стаз эритроцитов в стенке тонкого кишечника в контрольной группе на 4-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 5 - Воспалительная реакция в строме ворсин кишечника, атрофические изменения ворсин в контрольной группе на 10-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
При оценке уровня микроциркуляции в опытных группах было выявлено, что введение экспериментальным животным в качестве монотерепии препаратов Галавит , Мексикор , дигидрокверцетин приводит к эффективному повышению уровня регионарного кровотока в стенке тонкой кишки (рисунок 2). Показатели ЛДФ в этих группах были достоверно выше (р<0,05) таковых в контрольной группе на соответствующем сроке эксперимента.
Не было выявлено достоверных отличий (р>0,05) от контрольной группы в группе животных, получающей Галавит® на 2-е сутки - р=0,06, 3-е сутки - р=0,08 и 5-е сутки - р=0,23 эксперимента.
Комбинированное применение Мексикора® с Гала-
®®
витом® и дигидрокверцетина с Галавитом® привело к равнозначному увеличению показателей ЛДФ до значений, достоверно отличающихся от таковых в контрольной группе на соответствующих сроках и не имеющих достоверных отличий от показателей интакт-ных животных (Мексикор®+Галавит®: 7-е сутки -р=0,16, 10-е сутки - р=0,09; дигидрокверце-тин+Галавит®: 5-е сутки - р=0,88, 7-е сутки - р=0,38, 10-е сутки - р=0,55).
Таким образом, можно говорить о том, что компенсаторное восстановление регионарного кровообращения после моделирования распространенного перитонита в стенке тонкой кишки в большинстве опытных групп произошло к 10-м суткам эксперимента. В контрольной серии восстановление исходного значения к данному сроку не наблюдалось.
При микроскопическом исследовании тонкого и толстого кишечника опытной группы крыс, получающей Галавит®, выявлено, что морфологические изменения париетальной брюшины, кишечника были близки к таковым у крыс контрольной группы.
В то время как на фоне введения дигидрокверцети-на на 2-е сутки после моделирования перитонита в париетальной брюшине отмечается очаговая невыраженная воспалительная инфильтрация (рисунок 6). На 410-е сутки воспалительные изменения в слизистой и подслизистой оболочке выражены заметно слабее, чем у крыс контрольной группы (рисунок 7, 8). Помимо этого отмечается выраженная гиперплазия лимфоидно-го аппарата кишечника, что может быть обусловлено иммуномодулирующим действием дигидрокверцитина (рисунок 9). В толстом кишечнике на 10-е сутки патологические изменения не выявляются (рисунок 10).
Морфологические изменения париетальной брюшины и кишечника в группе животных, получающих комбинацию дигидрокверцетина с Галавитом , были в
целом аналогичны таковым у крыс предыдущей группы. В частности, следует отметить значительную гиперплазию лимфоидной ткани тонкого кишечника на 10-е сутки (рисунок 11). Как и в предыдущей группе это, по-видимому, связано с иммуномодулирующим действием испытуемых препаратов.
Рисунок 6 - Очаговая невыраженная воспалительная инфильтрация в париетальной брюшине в опытной группе ДГК на 2-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 7 - Невыраженные воспалительные изменения в слизистой и подслизистой оболочке тонкого кишечника в опытной группе ДГК на 4-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 8 - Невыраженные воспалительные изменения в слизистой и подслизистой оболочке тонкого кишечника в опытной группе ДГК на 4-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 9 - Выраженная гиперплазия лимфоидного аппарата кишечника в опытной группе ДГК на 4-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 10 - Толстый кишечник без патологических изменений в опытной группе ДГК на 10-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Рисунок 11 - Выраженная гиперплазия лимфоидной ткани тонкого кишечника в опытной группе ДГК+Галавит® на 10-е сутки после моделирования перитонита. Окраска гематоксилином и эозином. х56
Таким образом, экспериментально показано, что введение антиоксиданта растительного происхождения - дигидрокверцетина, а также его комбинации с имму-номодулятором Галавит® позволяет добиться прерывания каскада патологических процессов, развивающихся при распространенном перитоните. Полученные данные по изучению уровня микроциркуляции и патомор-фологических изменений свидетельствуют о сопоставимом фармакологическом эффекте монотерапии ди-
гидрокверцетином и комбинации дигидрокверцетина с иммуномодулятором Галавит®, что может предположить использование дегидрокверцетина в качестве дополнительного патогенетически оправданного подхода в коррекции распространенного перитонита.
Большинство фармакологических эффектов дигидрокверцетина - флавоноида растительного происхождения, по-видимому, связано с его антиоксидантными свойствами. Антиоксидантное действие дигидроквер-цетина основано на том, что его химическая структура содержит ароматическое кольцо и присоединенные к нему ОН-группы, которые способны тормозить процессы перекисного окисления липидов на стадии кислородной инициации и передачи электронов с одной активной формы на другую (Middleton E. et al., 2000). Флавоноиды, в том числе и дигидрокверцетин, повышают активацию Т-лимфоцитов путем стимулирования выработки интерферонов. Дигидрокверцетин активирует макрофаги - клетки тревоги иммунного аппарата, при этом ограничивая агрессию кислородного взрыва свободных радикалов, что позволяет активно бороться с чужеродными агентами, не переходя на разрушение собственных тканей (Schwartz A, Middleton E., 1984). Таким образом, обладающий высокой степенью активности дигидрокверцетин оказывает целую гамму положительных эффектов (антиоксидантное, иммуномоду-лирующее, противовоспалительное, гемореологиче-ское, гиполипидемическое и др.) на обменные реакции и динамику различных патологических процессов, что, по-видимому, способствует замедлению прогрессиро-вания экспериментального перитонита.
Выводы:
1. Введение экспериментальным животным ди-гидрокверцетина и его комбинации с Галавитом® выявило позитивное влияние фармакологической коррекции нарушений процессов микроциркуляции кишечной стенки и патоморфологических изменений в тканях тонкого кишечника и брюшины.
2. Результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать антиоксидант растительного происхождения дигидрокверцетин для проведения дальнейших клинических исследований в качестве дополнения к стандартному лечению у больных с распространенным перитонитом.
Список использованных источников
1 Алешин Д.А. Роль нарушений микроциркуляции стенки тонкой кишки в развитии острой энтеральной недостаточности при распространенном перитоните: автореф. дис. ... канд. мед.наук. - Астрахань, 2009. - 23 с.
2 Синдром интраабдоминальной гипертензии (обзор литературы) / Б.Р. Гельфанд, Д.Н. Проценко, О.В. Игнатенко и др. // Хирургия - приложение к Consilium medicum. - 2005. -Т. 7. - № 1. - С. 58-66.
3 Лазаренко В.А., Липатов В.А., Блинков Ю.Ю. Экспериментальная модель распространенного калового перитонита // Курский науч.-практич. вестн. «Человек и его здоровье». - 2008. - № 4. - С. 128-132.
4 Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. -Л.: Медицина, 1969. - 423 с.
5 Савельев В.С., Гельфанд Б.Р., Филимонов М.И. Перитонит - М.: Литтера, 2006. - 206 с.
6 Влияние мексикора на течение синдрома интраабдо-минальной гипертензии при экспериментальном распространенном перитоните / Б.С. Суковытых, Е.Б. Артюшкова, О.Г.Фролова и др. // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2010. - Т.3, № 3. - С. 222-226.
7 Суковытых Б.С., Блинков Ю.Ю., Фролова О.Г. Механизмы развития распространенного перитонита // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2012. - Т.5, № 2. - С. 470-478.
8 Middleton E. et al. The effects of plant flavonoids on mammalian cells. Implications for inflammation, heart disease and cancer // Pharmacological reviews. - 2000. - Vol.52, Issue 4. - P. 673-751.
9 Schwartz A, Middleton E. Comparison of the effects of quercetin with those of other flavonoids on the generation and effector function of cytotoxic T lymphocytes // Immunopharmacology. - 1984. - 7(2): 115-26.
Информация об авторах
Чмыхова Анастасия Николаевна, соискатель ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».
Артюшкова Елена Борисовна, доктор биологических наук, директор научно-исследовательского института экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, тел./факс: 51-40-36.
Сеин Олег Борисович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой терапии и акушерства ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. 53-15-55.
Артюшкова Екатерина Вячеславовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник научно-исследовательского института экологической медицины ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.
