CC BY
104
Биология и экспериментальная медицина
УДК 615.37.03:616.5-039.77
экспериментальное обоснование к использованию в косметологической практике нового отечественного иммунобиологического препарата с миорелаксантным
действием «релатокс»
Е. В. Плотникова1, В. Д. Елькин1, А. Н. Миронов2, Н. В. Мельников3, Н. В. Загидулин3, И. В. Фельдблюм1
'Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, г. Пермь, 2 ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва, 3Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат», г. Уфа
Проведены доклинические испытания безопасности и фармакологической эффективности нового иммунобиологического препарата «Релатокс». В эксперименте на лабораторных животных изучены острая и хроническая токсичность, аллергизирующие свойства и миорелаксантная активность отечественного ботулотоксина. Полученные результаты характеризуют релатокс как малотоксичный препарат, не вызывающий существенных изменений массы тела, внутренних органов и гематологических показателей. Препарат не обладает аллергизирующим действием. Фармакологическая эффективность и дозозависимость релатокса экспериментально доказана на модели локального паралича и сопоставима с препаратом сравнения «Ботокс».
Ключевые слова: релатокс, доклинические испытания, безопасность, фармакологическая эффективность.
Введение
Коррекция мимических морщин при помощи токсина ботулизма является важным компонентом эстетической омолаживающей терапии. Начало использования ботулотоксина относится к 80-м годам XX века, когда появились первые сообщения об успешном его применении у людей, страдающих нервно-мышечными расстройствами [1, 4]. Официально ботулотоксин был разрешен к применению в США в 1989 году для лечения косоглазия и блефароспазма (препарат «Оку-
линум»), а для коррекции мимических морщин в 2002 году FDA был одобрен препарат «Ботокс». Из других препаратов ботулотоксина типа А, используемых для мышечной релаксации, следует отметить «Диспорт» (Франция, 1991), «Лантокс» (Китай, 1997) и «Ксео-мин» (Германия, 2005) [10].
В последние годы в ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ был разработан первый отечественный иммунобиологический препарат бо-тулотоксина типа А «Релатокс», что и обусловило необходимость проведения экспериментальных исследований этого препарата.
Цель настоящей работы — оценка результатов доклинических исследований реактогенности, безопасности, аллергизи-рующих свойств и фармакологической активности препарата «Релатокс».
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследуемый препарат «Релатокс» представляет собой токсин ботулинический типа А в комплексе с гемагглютинином (лио-филизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 50 ЕД и 100 ЕД). Состав (1 флакон): комплекс ботулиническо-го токсина типа А с гемагглютинином — 50 ЕД, 100 ЕД; желатин — 6 мг; мальтоза — 12 мг.
Препарат отвечает всем требованиям, предъявляемым к инъекционным иммунобиологическим средствам, и в соответствии с ГФ XI стерилен, апирогенен и нетоксичен.
Фармакологическое действие релатокса, как и других препаратов ботулотоксина типа А, заключается в блокаде высвобождения ацетилхолина в нервно-мышечном соединении, что приводит к снятию мышечного спазма в области введения [11, 12]. Восстановление передачи нервного импульса происходит постепенно, по мере образования новых нервных окончаний и возобновления контактов с постсинаптической моторной концевой пластинкой.
Исследования проведены на лабораторной базе Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» Республики Башкортостан.
Изучались острая и хроническая токсичность, аллергизирующее действие и фармакологическая эффективность препарата.
Исследование острой токсичности проведено на 120 белых аутбредных мышах массой тела 18—20 г. Определение LD50 — минимального количества токсина, вызывающего гибель 50% мышей при внутрибрюшинном
введении в течение 4-х суток, производилось методом Кербера [2].
Раствор релатокса с различной концентрацией вводили мышам в объеме 0,5 мл внут-рибрюшинно. Подсчет LD50 проводили по формуле Кербера [2]:
^Ш^^-бх (21,-0,5),
где: DN — максимальная доза токсина, мл; б — десятичный логарифм кратности
разведений; Li — отношение числа животных, погибших от введения данной дозы, к общему количеству животных, которым была введена данная доза.
Хроническую токсичность изучали на 80 крысах и 80 мышах после предварительной инактивации действующего начала боту-линического токсина путем кипячения в течение 30 минут. Опытных крыс и мышей рандомизировали по 5 групп (одну контрольную и четыре опытных), по 16 животных в каждой. Животным контрольной группы вводился физиологический раствор. В опытных группах для введения использовались терапевтическая и 10-кратная терапевтическая дозы релатокса. Препарат вводился подкожно и внутримышечно ежедневно 1 раз в сутки в течение 7 суток. Время наблюдения — весь период введения препарата и последующие 7 суток. В ходе исследования вели наблюдение за общим состоянием животных. До начала опыта, через 24 часа и спустя 7 суток после окончания курса инъекций регистрировали массу тела, оценивали физиологические показатели: двигательную активность (метод «открытого поля») и особенности поведения (метод «открытой площадки») [6], определяли гематологические показатели: гемоглобин, эритроциты, лейкограмму, билирубин, глюкозу, общий белок по общепринятой методике [8]. Кроме того, через 24 часа и на 7-е сутки после окончания введения ре-латокса проводили патоморфологическое
Пермский медицинский журнал
2011 том XXVIII № 4
изучение кусочков органов (сердца, легких, печени, почек, селезенки, тимуса) и региональных лимфоузлов [5].
Аллергизирующие свойства релатокса оценивали методом активной системной анафилаксии [7]. В опыте использовали морских свинок массой 220—250 г. Учет интенсивности анафилактического шока осуществляли в индексах по
Фармакологическую эффективность препарата изучали по характеру формирования локального паралича у кроликов и мышей. Для этого релатокс и препарат сравнения «Ботокс» вводили 8 кроликам туберкулиновым шприцем в мышцу, поднимающую веко глаза. Дозы введения: 10,0; 5,0; 2,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05 ЕД. Наблюдение за животными производили от момента введения до полного выздоровления, обращая особое внимание на появление птоза и слезотечение. Исследуемым мышам, рандомизированным на 12 групп (по 8 голов в каждой), препараты «Релатокс» и «Ботокс» вводили под верхнее веко глаза в следующих дозах: 1,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05 ЕД. Наблюдение за мышами осуществлялось в том же порядке, что и за опытными кроликами.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием Ькритерия Стьюдента [3]. Результаты считали достоверными при р<0,05 [9].
Результаты и их обсуждение
Для определения острой токсичности ^50) использовали две серии препарата «Релатокс» с активностью 100 ЕД и 50 ЕД, а также одну серию препарата «Ботокс» с активностью 100 ЕД. Для каждой серии готовили исходные растворы (ИР) и различные (соответствующие по активности) степени их разведения. Результаты сравнительных исследований LD50 приведены в таблице 1.
Для серии релатокса с активностью 100 ЕД оказалось: ^50 = -0,4154—0,1139 х
Таблица 1
Результаты определения LD50 релатокса 100 ЕД, релатокса 50 ЕД и ботокса
№ дозы релатокса 100 ЕД Доза/мышь, мл (ИР/0,5 мл) Количество павших Ц
1 0,3842 8 1
2 0,295538 6 0,75
3 0,227337 2 0,25
4 0,174875 1 0,125
5 0,134519 0 0
№ дозы рела-токса 50 ЕД Доза/мышь, мл (ИР/0,5 мл) Количество павших Ц
1 0,3842 8 1
2 0,295538 5 0,625
3 0,227337 2 0,25
4 0,174875 0 0
5 0,134519 0 0
№ дозы ботокса Доза/мышь, мл (ИР/0,5 мл) Количество павших Ц
1 0,0845 8 1
2 0,065 6 0,75
3 0,05 2 0,25
4 0,03845 0 0
5 0,0296 0 0
х (2,125—0,5); LD50 = 0,2508 мл (ИР); количество LD50 во флаконе равно: 25: 0,2508 = 99,66; активность во флаконе — 99,66 ЕД.
Для серии релатокса с активностью 50 ЕД получены следующие результаты: ^^=-0,4154—0,1139 х (1,875—0,5); LD50= 0,2678 мл (ИР); количество LD50 во флаконе равно 60:0,2678:4 = 56,00; активность во флаконе — 56,00 ЕД.
Для серии ботокса: 1^50=-1,0731— -0,1139 ^ (2—0,5); LD50= 0,057 мл (ИР); количество LD50 во флаконе равно 5: 0,057 = = 87,71; активность во флаконе — 87,71 ЕД.
Таким образом, изучение острой токсичности показало идентичность активности препаратов «Релатокс» 100 ЕД и «Ботокс».
При изучении хронической токсичности релатокса гибели животных в ходе эксперимента отмечено не было. Существенных групповых отличий в общем состоянии, внешнем виде и динамике массы (табл. 2) не наблюдалось.
Результаты проведенных физиологических тестов показали умеренное усиление исследовательского рефлекса крыс опытных групп по сравнению с контролем, а также некоторое снижение двигательной активности опытных мышей по сравнению с контролем,
однако данные различия были статистически незначимы.
Общий и биохимический анализы крови крыс и мышей не выявили статистически значимых различий между контролем и опытными группами.
Микроскопические изменения во внутренних органах крыс и мышей через 24 часа после окончания хронического эксперимента свидетельствовали о том, что введение препарата, особенно в 10-кратной дозе, вызывает некоторое усиление интерстициаль-ной реактивности и инфильтративных процессов в печени и сердце. Данные изменения могут быть отнесены за счет спонтанной патологии, поскольку наблюдались как в опыте, так и в контроле.
Исследование аллергизирующего действия релатокса было проведено с помощью
Таблица 2
Динамика массы животных в ходе эксперимента
Группы животных, доза препарата, способ введения Масса животных, г
до начала опыта по окончании инъекций по окончании опыта
Крысы
1 группа — контроль 261,25±11,38 281,55±14,80 281,66±26,26
2 группа — терапевтическая, подкожно 260,75±8,06 273,20±7,74 272,46±12,09
3 группа — 10-кратная терапевтическая, подкожно 259,13±9,0 272,09±9,99 269,69±16,98
4 группа — терапевтическая, внутримышечно 260,44±7,69 270,63±11,24 276,33±22,01
5 группа — 10-кратная терапевтическая, внутримышечно 260,63±8,0 258,78±11,03 276,97±19,28
Мыши
1 группа — контроль 19,3±0,79 21,19±1,56 21,21±1,34
2 группа — терапевтическая, подкожно 19,11±0,86 20,98±1,35 20,19±0,69
3 группа — 10-кратная терапевтическая, подкожно 19,27±0,43 20,66±1,16 21,30±1,11
4 группа — терапевтическая, внутримышечно 19,13±0,65 21,76±0,78 19,26±1,34
5 группа — 10-кратная терапевтическая, внутримышечно 19,29±0,90 21,3±1,38 19,53±1,03
Пермский медицинский журнал
2011 том XXVIII № 4
активной системной анафилаксии у морских свинок. В опыте использовались 30 морских свинок массой 200—230 г. Животные были разделены на три группы по 10 в каждой: 1 группе (контрольной) вводили раствор натрия хлорида для инъекций 0,9%, 2 группе — терапевтическую дозу исследуемого препарата, 3 группе — 10-кратную терапевтическую дозу исследуемого препарата. На 14-й день после третьей сенсибилизирующей инъекции морским свинкам внутривенно вводили исследуемый препарат в дозе, составляющей суммарную сенсибилизирующую. Во всех трех группах какие-либо аллергические реакции отсутствовали.
Таким образом, исследуемый препарат не обладает аллергизирующими свойствами немедленного действия у морских свинок.
При сравнительном изучении фармакологической эффективности препаратов «Релатокс» и «Ботокс» по их способности вызывать локальный паралич при введении в m. levator palpebralae мышам в различных дозах (от 0,05 до 1,5 ЕД) установлено, что введение исследуемого препарата и препарата сравнения в дозах 0,25 ЕД и выше вызывает снижение двигательной активности животных, в дозах 0,5 ЕД и выше — снижение двигательной активности и слезотечение, а в дозах 1,0—1,5 ЕД, кроме вышеуказанных симптомов, — выраженный птоз (т. е. локальный паралич мышцы, поднимающей веко), причем степень выраженности проявления эффектов препаратов «Релатокс» и «Ботокс»® идентична. Развитие локального паралича фиксировалось на 2—3-е сутки после инъекций препаратов, а выздоровление наступало на 7—8-е сутки.
Сравнительное изучение фармакологической эффективности релатокса и ботокса по их способности вызывать локальный паралич при введении в m. levator palpebralae кроликам в дозах от 0,5 до 10 еД показало, что введение этих препаратов во всех указанных дозах вызывает снижение двигатель-
ной активности и отказ животных от пищи и воды, а также дозозависимое развитие птоза. Развитие паралича фиксировалось на 2—3-е сутки, а восстановление функциональной способности мышцы, поднимающей веко, происходило на 45—50-е сутки после инъекции.
Эффективность релатокса и ботокса по способности вызывать локальный паралич в месте введения в одинаковых дозах оказалась идентичной.
Выводы
1. При изучении острой токсичности релатокс 100 ЕД оказался сопоставим по единицам активности с препаратом сравнения «Ботокс».
2. Изучение токсикологической безвредности релатокса в хроническом эксперименте показало, что исследуемый препарат относится к классу малотоксичных веществ и не вызывает признаков интоксикации в организме подопытных животных.
3. Изучение влияния релатокса на внутренние органы при длительном применении терапевтических доз существенных структурных изменений в исследуемых органах не выявило. Возникающие под влиянием высоких доз препарата реактивные изменения в различных органах закономерны и имеют обратимый характер.
4. Исследуемый препарат не обладает ал-лергизирующим действием.
5. Фармакологическая эффективность релатокса и дозозависимость его эффекта экспериментально доказана на модели локального паралича m. levator palpebralae кроликов и мышей, а также локального паралича m. rectus lateralis кроликов.
6. Показана сопоставимость фармакологического действия релатокса с препаратом сравнения «Ботокс».
7. Проведенное в рамках доклинического исследования изучение безопасности и эф-
фективности нового миорелаксантного препарата «Релатокс» позволяет рекомендовать его к проведению клинических испытаний на ограниченном контингенте из числа добровольцев с мимическими морщинами.
Библиографический список
1. Артемьев Д. В. Использование ботокса в медицинской практике/Д. В. Артемьев, О. Р. Орлова, А. Э. Моренкова//Неврологический журнал.— 2000.— Т. 5.— № 4.— С. 46—51.
2. Ашмарин И. П. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ И. П. Ашмарин, А А. Воробьев.— Л.: Медгиз, 1962.— 180 с.
3. Беленький М. Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффек-та/М. Л. Беленький,—Л., 1963.— С. 81—106.
4. Майорова А. В. Данные клинических и доклинических исследований препаратов ботулинического токсина/А. В. Майо-рова//Экспериментальная и клиническая дерматокосметология.— 2009.— № 5.— С. 45—53.
5. Меркулов Г. А Курс патогистологической техники/Г А Меркулов.— Л.: Медицина, 1969.— 423 с.
6. Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования.— Киев, 1980.— С. 16—18.
7. Методические рекомендации по оценке аллергенных свойств фармакологических средств.— М., 1999.— 15 с.
8. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования/Под ред. Е. А. Кост.— М.: Медицина, 1975.— 389 с.
9. Трахтенберг И. М. Проблемы нормы в токсикологии/И. М. Трахтенберг и др.— М., 1991.— 208 с.
10. Эрнандес Е. И. Новая косметология/ Е. И. Эрнандес,— М.: ООО «Клавель», 2007.— С. 278—301.
11. Dressier D. Botulinum toxin: mechanismus of action/D. Dressier, A. F. Saberi//Eur. J. Neurol.- 2005.- Vol. 53.- № 3.- P. 3-9.
12. The use of botulinum toxin treatment in children with movement disorders//. Autti Ramo, T. A. Larsen, J. Peltonen et al.//Eur. J. Neurol.- 1997.- Vol. 4.- № 2.- P. 2326.
E. V. Plotnikova, V. D. Elkin, A. N. Mironov, N. V. Melnikov, N. V. Zagidulin, I. V. Feldblyum
EXPERIMENTAL GROuNDING of using NEW NATIVE immunobiological drug with
MYORELAXATION EFFECT RELATOX IN COSMETOLOGICAL PRACTICE
Preclinical trials of safety and pharmacological efficiency of new immunobiological drug «Relatox» were carried out. In laboratory animal experiment, acute and chronic toxicity, allergenic properties and myorelaxation activity of native botulotoxin was studied. The obtained results characterize relatox as a low-toxic drug that does not induce essential changes in the body weight, internal organs and hematological indices. This drug has no allergenic effect. Pharmacological efficiency and dose-dependence were experimentally proved on the model of local paralysis; they are comparable with the drug of comparison «Botox».
Keywords: relatox, preclinical trials, safety, pharmacological efficiency.
Контактная информация: Плотникова Елена Владимировна, канд. мед. наук, ассистент кафедры дерматовенерологии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 298-30-54 Материал поступил в редакцию 06.04.2011
