CC BY
25УДК 616.594.171: 615.282
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТРИХОФИТИИ НА МОРСКИХ СВИНКАХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИРУЛЕНТНОСТИ ПАТОГЕНА -ВОЗБУДИТЕЛЯ
Васильева Н.В. (директор института), Аравийский Р.А.|(в.н.с.), Выборнова И.В. (н.с.)/ Богомолова Т.С. (завлаб.)*/ Босак И.А. (врач - лабораторный миколог), Чилина Г.А. (зав. коллекцией), Пинегина О.Н. (ассистент кафедры), Степанова А.А. (зав. лаб.), Авдеенко Ю.Л. (с.н.с.), Котрехова Л.П. (доцент кафедры)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Выполнены эксперименты по моделированию трихофитии на морских свинках. В результате отобран наиболее вирулентный штамм-патоген Trichophyton mentagrophytes РКПГ F 1457. Изменена методика подготовки и локального заражения кожи животных. Оценка выраженности инфекции дополнена гистологическим анализом материала из очагов поражения кожи.
Ключевые слова: гистологическое исследование, инфекция, модель, трихофития
EXPERIMENTAL MODELING OF TRICHOPHYTIA ON GUINEA PIGS DEPENDING FROM PATHOGEN’S VIRULENCE
Vasilyeva N.V. (director of institute),
Aravijskiy R.A. (leading scientific
collaborator), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Bogomolova T.S. (head of laboratory), Bosak I.A. (laboratory mycologist), Chilina G.A. (head of collection), Pinegina O.N. (assistant
Контактное лицо: Богомолова Татьяна Сергеевна, Тел.: (812) 303-51-40
of the chair), Stepanova A.A. (head of laboratory), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Kotrekhova L.P. (associated professor of the chair)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, North-Western State Medical University named after l.l. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2013
Experimental model of Trichophyton mentagrophytes skin infection in guinea pigs have been modified. More virulent strain T. mentagrophytes RCPF F 1457 was selected for inoculation. Preparing of animals and infection procedure was changed. Estimation of results included histological examination of skin lesions.
Key words: animal model, infection, histology, pathology, trichophytia
ВВЕДЕНИЕ
Дерматомикозы представляют собой часто встречающиеся инфекционные заболевания человека, обусловленные различными микроскопическими грибами [1] и поражающие до 25% населения земного шара [2]. Основной причиной их признают преимущественно Trichophyton spp., Microsporum spp., Epi-dermophyton spp., а одним из более часто проявляющих себя - Trichophyton mentagrophytes. В настоящее время возникает необходимость проведения доклинических исследований новых отечественных лекарственных препаратов для лечения дерматомикозов с оценкой их эффективности и безопасности in vivo на наиболее близкой к соответствующей патологии человека модели.
Известны модели трихофитии на морских свинках, когда инфицируют участок(-ки) кожи животных грибами рода Trichophyton [3]. Результаты исследования эффективности противогрибковых препаратов на этих моделях выводят на основании микроскопического и культурального исследований шерсти и кожных чешуек животных. При этом не учитывают степень проникновения возбудителя в толщу кожи и влияние применения препаратов на гистологическую картину поражения.
Большое значение имеют также и особенности штамма гриба, применяемого для заражения, его способность вызвать интенсивное поражение кожи и волос.
Цель настоящей работы - отобрать наиболее эффективный заражающий штамм Т. mentagrophytes для создания экспериментальной модели трихофитии на морских свинках с использованием патоморфологических методов исследования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы грибов и их характеристика.
Для исследования были использованы 3 штамма Т. mentagrophytes из Российской коллекции патогенных грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина РКПГ F: 1404, 1425 и 1457. Эти штаммы были выделены из патологического материала паци-
%
ентов с микозами кожи и её придатков и хранились нами на агаре Сабуро. Перед постановкой экспериментов культуры выращивали в течение 14 суток при 28 °С на агаре Сабуро в чашках Петри.
1. Штамм Т. mentagrophytes РКПГ F 1404 Источник: ногтевые пластинки пальцев стоп пациента с онихомикозом.
Описание: на агаре Сабуро: колония плоская, мучнистая, мелкозернистая, беловато-кремового цвета; обратная сторона колонии - светло-коричневая. Мицелий тонкий бесцветный, шириной 2,9-4,0 мкм. Микроконидии многочисленные, округлой формы, диаметром 2,9-3,1 мкм. Макроконидии не обнаружены. По результатам сиквенирования локуса ITS идентифицирован как Т. mentagrophytes (идентичность 100%).
2. Штамм Т. mentagrophytes РКПГ F 1425
Источник: чешуйки с гладкой кожи лица пациента, страдающего микозом кожи.
Описание: на агаре Сабуро: колония плоская по-рошисто-мучнистая, желтовато-белого цвета; обратная сторона колонии -темно-коричневая. Мицелий регулярно септированный, бесцветный, шириной 2,5-3,0 мкм. Микроконидии в значительном количестве, округлой формы, диаметром 2,0-2,3 мкм. Макроконидии не обнаружены. По результатам сиквенирования локуса ITS идентифицирован как Т. mentagrophytes (идентичность 99%).
3. Штамм Т. mentagrophytes РКПГ F 1457
Источник: кожные чешуйки, волосы, гнойное отделяемое из бороды пациента с микозом. Описание: на агаре Сабуро: колония плоская, бархатистая, кремовато-белого цвета; обратная сторона колонии - коричневая. Мицелий септированный, бесцветный, ветвистый, шириной 2,5-3,2 мкм. Микроконидии в значительном количестве, округлой и грушевидной формы, диаметром 1,8-3,0 мкм. Макроконидии не обнаружены. По результатам сиквенирования локуса ITS идентифицирован как Т. mentagrophytes var. erinacei (идентичность 100%).
Заражение животных.
Эксперименты выполняли на морских свинках -самцах.
Животные были распределены в опытные группы (по 4 особи в каждой) после предварительного карантина и осмотра, исключающего включение в эксперимент больных и травмированных животных. В экспериментальные группы были отобраны животные без признаков отклонений их внешнего вида от
нормального.
На боку каждого животного выщипывали шерсть на участке размером 5x5 см. Микологической лопаткой вырезалили кусочки из выращенных культур грибов размерами 5x5 мм в количестве 4-х штук, на-носилиили их на стерильную (стерилизация сухим жаром) наждачную бумагу и втирали в кожу животного.
Животным в контрольной группе втирали в кожу, подготовленную таким же образом, как и для животных в группах исследования, с помощью наждачной бумаги 4 кусочка стерильного агара Сабуро размером 5x5 мм для последующей оценки и исключения раздражения, вызванного применением наждачной бумаги.
Взятие материала для исследований.
Кожные чешуйки, шерсть, корки (после развития характерных признаков заболевания) отбирали скальпелем и пинцетом на границе очага поражения в стерильные чашки Петри.
Микроскопическое исследование биосубстратов.
Из патологического материала (шерсть, кожные чешуйки и корки из очага поражения) готовили препараты для микроскопии в 30% растворе КОН с добавлением калькофлюора белого. Исследовали в микроскопе при увеличении хЮО и х400, отмечали наличие элементов грибов в кожных чешуйках и волосах, проводили микрофотографирование препаратов в световом и флуоресцентном микроскопах. Все наблюдения документировали и описывали.
Культуральное исследование.
Посев шерсти, кожных чешуек и корок из очагов поражения проводили на среду для селективного выделения дерматомицетов DTM-arap Таллина (производство фирмы Merck, Германия). Посев производили в три точки на поверхность подготовленной питательной среды и выдерживали в течение 10-14 дней при 28 °С до появления видимого роста в контроле.
Идентификация выделенной культуры гриба до рода и вида.
Выделенные культуры грибов идентифицировали по морфологическим и физиологическим признакам согласно определителю грибов - G.S. de Hoog et al. «Atlas of clinical fungi», 3-rd ed. 2011. Идентификацию подтверждали методом ДНК-сиквенирования (локус ITS).
Проведение биопсии для гистологического исследования кожи морских свинок.
Анестезия
Перед проведением биопсии выполняли инфиль-трационную анестезию. Внутрикожно вводили раствор анестезирующего препарата (0,5 мл 1% новокаина) так, чтобы образовалась «лимонная корочка».
Биопсия кожи
Пункционную биопсию кожи выполняли панчем
- полой стерильной трубкой, которую слегка вдавливали в кожу. При нажатии вниз инструмент поворачивали, чтобы прорезать кожу на необходимую глу-
бину (5-6 мм). Затем биоптат приподнимали пинцетом и отрезали скальпелем. После взятия биоптата остается округлой формы дефект, который обрабатывали 3% перекисью водорода. Из очага поражения каждого животного брали по 3 биоптата.
Гистологическое исследование.
Биопсийный материал кожи из очагов поражения дерматомицетами фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, проводили через серию изопропилового спирта и гистомикса с помощью гистологического процессора марки Tissue-Tek@ VIP. Затем материал, пропитанный гистомиксом, переносили в заливочную станцию для изготовления парафиновых блоков, с которых на санном микротоме Slide 2003 получали серийные срезы толщиной 3 мкм. Срезы расправляли на водяной бане и удаляли гистомикс ксилолом, окрашивали гематоксилин-эозином и PAS-методом. После заключения срезов в среду Bio Mount их исследовали в световом микроскопе.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Внешний вид и результаты микологического исследования контрольных и зараженных животных в период наблюдений.
Группа 1. Животные, зараженные Т. mentagro-phytes РКПГГ1404.
Через сутки после заражения отмечали покраснение в очаге поражения у всех свинок и образование корок - у трех. Корка, образовавшаяся в результате скарификации, начала отслаиваться на третьи сутки после заражения, а к пятым суткам отслоилась у всех животных группы; в очаге отмечали наличие небольшого количества шелушащихся корочек. К седьмым суткам после заражения корочки отпали (Рис.1).
Рис. 1. Внешний вид боковой стороны животного на 7-е сутки после заражения Т. тегИадгорЬуТез РКПГ Р 1404
При микроскопии кожных чешуек и волос из очага поражения на 7-е сутки только у двух животных в группе удалось обнаружить единичные фрагменты мицелия гриба в кожных чешуйках (Рис. 2).
Рис. 2. На фоне воздушных пузырьков видны единичные фрагменты мицелия Ц) в кожной чешуйке из очага поражения на коже морской свинки. 7-е сутки после заражения Т. тепґадгорЬуіеі РКПГ Р 1404 (люминесцентная микроскопия). Ув.Х 400
На 13-е сутки после заражения в местах инфицирования появились шелушащиеся корочки, количество которых постепенно возрастало.
Через 17 суток после заражения при микроскопии кожных чешуек и волос элементы грибов не обнаружены. При посеве патологического материала через 7 и 17 суток роста дерматомицета выявлено не было (Рис. 3).
Рис. 3. Внешний вид боковой стороны животного на 17-е сутки после заражения Т. тепХадгорЬу1е$ РКПГ Р 1404
Группа 2. Животные, зараженные Т. mentagro-рУ^еэ РКПГ Г142$.
Через сутки после заражения отмечали покраснение в очаге поражения у всех свинок. Корки после скарификации у животных отслоились к четвертым суткам после заражения, к этому моменту уже наблюдали характерные для поражения дерматомице-том проявления (гиперемию, образование корочек, заметное шелушение) на очаге размером 40 мм. К 6 суткам после заражения очаг инфекции достигал 50 мм, а проявления инфекции постоянно нарастали. На 8 сутки у одного из животных в группе очаг инфекции увеличился до 90 мм, а у другого животного характерные для трихофитии поражения (гиперемия, шелушение, коркообразование) возникли и
распространились на коже головы. При дальнейшем наблюдении за животными группы отмечали нарастание степени коркообразования (Рис.4, 5).
Рис. 4. Внешний вид боковой стороны животного на 7-е сутки после заражения Т. теМадгорЬ^ев РКПГ Р 1425
Рис. 5. Внешний вид боковой стороны животного на 17-е сутки после заражения Т. тепЩгорЬу1е5 РКПГ Р 1425
При микроскопии материала из очага поражения, через 7 суток после заражения культурой гриба, у всех животных группы наблюдали умеренное количество мицелия гриба в кожных чешуйках и волосах (Рис. 6).
При посеве на среду Ш'М-агар Таллина был получен рост Т. mentagrophytes (Рис. 7).
Рис. 7. Рост Т. теМадгорЬу1е$ РКПГ Р 1425 во всех точках посева материала из очагов поражения (ОТМ-агарТаллина)
При микроскопии патологического материала через 17 суток наблюдали обилие мицелия в волосе, однако в кожных чешуйках элементы гриба обнаружены не были. При посеве патологического материала на среду Ш’М-агар Таллина у всех животных была получена культура Т. теМа£ГорИу1ех, что подтверждено и ДНК-сиквенированием.
Группа 3. Животные, зараженные Т. mentagro-ркуЬез РКПГП457.
Через сутки после заражения отмечали покраснение кожи у трех свинок и шелушение у всех свинок. Характерные для трихофитии проявления (гиперемия, шелушение, образование корочек) у животных этой группы были выявлены уже на 4-е сутки после заражения в очаге размером 40 мм. На 6-е сутки после заражения шелушение и образование корочек были ярко выражены в очаге размером 50 мм. К 17-ти суткам наблюдения коркообразование в очаге заражения нарастало, однако с 11-ых суток после заражения корки растрескивались и к 17-ти суткам очаги заражения у 3-х животных были лишены корок (частично или полностью) (Рис. 8,9).
Рис. 6. Мицелий гриба (1) в волосе из очага поражения на коже морской свинки. 7-е сутки после заражения Т. теШад горЬуіе5 РКПГ Р 1425 (люминесцентная микроскопия). Ув. х400
Рис. 8. Внешний вид боковой стороны животного на 7-е сутки после заражения Т. тегМадгорИ^а РКПГ? 1457
Рис. 9. Внешний вид боковой стороны животного на 17-е сутки после заражения Т. тегПадгорЬу1е$ РКПГ Р 1457
11ри микроскопии материала из очага поражения, через 7 суток после заражения культурой гриба, у всех животных группы наблюдали большое количество мицелия гриба в кожных чешуйках и волосах (Рис. 10).
11ри посеве на среду ОТМ-агар Таллина был получен рост Т. mentagюphytes. При микроскопии патологического материала через 17 сугок наблюдали обилие мицелия в волосе, однако в кожных чешуйках элементы гриба обнаружены не были. При посеве патологического .материала на среду ОТМ-агар Таллина у всех животных была получена культура Т. тепШ§горку1ез (Рис. 11), что подтверждено и ДНК-сиквенированием.
Рис. 11. Рост Т. теп(адгорЬу1е$ РКПГ Р1457 во всех точках посева материала из очага поражения (ОТМ-агар Таллина)
Группа 4. Контрольная группа 11ри наблюдении за животными контрольной группы не выявили ответных реакций сразу после скарификации кожи. В течение 17 дней признаков воспаления кожи не отмечали. При микроскопическом исследовании волос и кожных чешуек из скарифицированного участка на теле животных через 7 и 17 суток элементов грибов не обнаружено. При посеве волос и кожных чешуек роста дерматомицетов не было получено.
Сравнительная характеристика клинико-лабораторных особенностей модели трихофитии в зависимости от штамма Т. mentagrophytes.
Таблица 1
Клинико-лабораторные особенности модели
трихофитии, вызванной Т. тепіадгорЬуіеї
№ штамма Клинические признаки трихофитии Микологическое исследование патологического материала из очагов поражения
МИКРОСКОПИЯ посев
7 сут. 17 сут. 7 сут. 17 сут. 7 сут. 17 сут.
1404 - + + - - -
1425 +++ +++ +++ ++ + +
1457 +++ ++ +++ +++ ++ ++
контроль - - - - - -
Примечание 1:
- отсутствие признака + небольшое наличие признака ++ заметное наличие признака +++ наличие ярко выраженного признака В таблице 1 приведены данные о выраженности клинических и лабораторных признаков трихофитии при использовании различных штаммов Т. mentag-горку1еа. Так, Т. mentagwphytes РКПГ Г 1404 не вызвал яркой картины трихофитии у морских свинок. Другие штаммы - Т. mentagrophytes РКПГ Г 1425 и Т. mentagmphytes РКПГ Г 1457 вызвали сходную клиническую картину инфекционного процесса на всех сроках наблюдения, однако при микологическом исследовании патологического материала на сроке 17 суток элементы гриба были обнаружены в большем количестве у животных, зараженных штаммом Т. mentagюphytes РКПГ Г 1457.
Таким образом, из 3-х изученных ш таммов в ка-
Рис. 10. Мицелий гриба Ц) в кожных чешуйках из очага поражения на коже морской свинки. 7-е сутки после заражения Т. тШадгорЬу{е$ РКПГ Р 1457 (люминесцентная микроскопия). Ув. х400
честве тест-культуры, при воспроизведении модели трихофитии путем инфицирования ими кожи морских свинок, наиболее вирулентным оказался штамм Т. тепищгорку1еи РКПГ Ь' 1457. Следует отмстить, что наиболее ярко выраженная клиническая картина трихофитии у животных, зараженных данным штаммом, подтверждаемая лабораторными микологическими исследованиями, развивается к седьмым суткам после заражения.
Предлагаемая нами модель трихофитии отличается от методики, рекомендованной другими авторами [1], в части подготовки кожи и заражения животных (скарификация наждачной бумагой с одновременным нанесением культуры гриба в виде 4-х кусочков колоний гриба с питательной средой размером 5x5 мм).
В результате проведенного исследования можно заключить, что для культуральной оценки наличия дерматомицетов в очаге поражения целесообразно использовать среду для селективного выделения дерматомицетов - Ш'М-агар Таллина, что исключает рост плесневых грибов — контаминантов шерсти животных.
Гистопатологическая оценка поражения кожи на модели трихофитии морских свинок
Для изучения гистопатологической картины экспериментальной трихофитии на следующем этапе исследования было проведено заражение группы из 5 животных отобранным штаммом Т. mentagrophytes РК1II' Р 1457. Клинические и микологические показатели инфекции соответствовали ранее полученным данным. На 7-е сугки после заражения всем животным были проведены биопсии кожи.
В результате гистопатологического исследования тканей было установлено, что через 7 суток после инфицирования свинок во всех случаях отмечали альтеративно-экссудативные изменения со стороны эпидермиса и дермы в виде утолщения рогового слоя, инфильтрации его нейтрофильными лейкоцитами, экзоцитоза, местами с образованием микроабсцессов под роговыми массами. В гиподерме — воспалительная инфильтрация из нейтрофилов, эозино-филов и лимфоцитов, отек и полнокровие сосудов в области сосочков дермы. В глубоких отделах воспалительная инфильтрация отсутствует либо слабо выражена. При РЛБ-окраске в роговых массах и волосяных фолликулах выявили септированный мицелий в значительных количествах (Рис. 12,13).
Рис.12. Мицелий гриба в волосяном фолликуле Ц). Окраска РАБ-методом. Ув. х400
Рис. 13. Мицелий гриба в роговом слое кожи Ц). Окраска РАБ-методом. Ув. х400
Таким образом, на основании гистопатологического исследования пат. материала из очагов поражения при моделировании трихофитии получена дополнительная информация об инфекционном процессе, что может иметь важное значение при выборе эффективных антимикотиков и, прежде всего, против трихофитии.
выводы
1. Выявлены различия между штаммами Т. теп-tagrophytes по способности вызывать экспериментальную трихофитию у животных; отобран наиболее вирулентный штамм Т. mentagrophytes РК11Г Р 1457, позволяющий получить воспроизводимую экспериментальную трихофитию у морских свинок.
2. Модифицированная экспериментальная модель трихофитии, дополненная гистопатологиче-ским исследованием очагов поражения кожи, обеспечивает проведение более объективной оценки ожидаемой эффективности соответствующего противогрибкового препарата.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Блинов Н.П. Дерматомицеты (лекция). Учебное пособие. — СПб.: «Коста», 2010. — 48 с.
2. Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматомикозы. Руководство для врачей. — СПб: из.дом СПбМАПО, 2006. - 183 с.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (под ред. Р.У. Хабриева). - 2-е изд.. - М.: Медицина, 2005. - 832 с.
Поступила в редакцию журнала 28.03.2013 Рецензент: К.И. Разнатовский
