CC BY
20процесс сенсорного компонента. 3. При регистрации соматосенсорных вызванных потенциалов установлено замедление времени прохождения афферентной волны возбуждения по проводящим путям на различных уровнях от шейного отдела до коркового представительства, что может являться следствием поражения центральных сенсорных проводящих путей у обследованных больных.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Александров Н.Ю. Вызванные потенциалы в диагностике поражений нервной системы: Учебно-методическое пособие / Под ред. проф. Н.А. Белякова.
— С.-Пб., 2001.
2. Антонюженко В.А. // Гиг. труда. — 1980. — № 10. — С. 24—27.
3. Антонюженко В.А. // Там же. — 1991. — № 2. — С. 17—19.
4. Антонюженко В.А., Крашенникова О.И. // Там
же. — 1992. — № 9—10. — С. 42—43.
5. Артамонова В.Г. // Там же. — 1996. — № 5. — С. 17—18.
6. Артамонова В.Г., Шаталов Н.Н. Профессиональные болезни: Учебник. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицина, 1988.
7. Афифи А., Эйди С. Статистический анализ: Подход с использованием ЭВМ. — М.: Мир, 1982.
8. Бадалян Л.О., Скворцов И.А. Клиническая элек-тронейромиография: Руководство для врачей. — М.:
Медицина, 1986. — С. 106.
9. Боровиков В. 51ай8йса: искусство анализа данных на компьютере. — С.-Пб.: ЗАО «Питер Бук», 2001.
10. Думкин В.Н. // Гиг. труда. — 1983. — № 5. — С. 19—22.
11. Думкин В.Н. // Там же. — 1983. — № 8. —С. 12—16.
12. Ефимова Н.В. Ртуть: опасность реальная и мнимая. — Иркутск, 2001.
13. Лизарев А.В. Состояние липидного обмена и функция надпочечников при хроническом воздействии ртути в условиях производства хлора и каустика ртутным методом: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Иркутск,
1987.
14. Маняшин Ю.А., Лизарев А.В., Новохатский Н.К., Потрохов О.И. // Региональные проблемы гигиены и экологии человека: Сб. научно-практ. статей /
НИИ МТ и ЭЧ ВСНЦ СО РАМН, Иркутский областной ЦГСЭН. — Ангарск — Иркутск, 1997. — С. 56—67.
15. Николаев С.Г. Практикум по клинической электронейромиографии / С.Г. Николаев. — Иваново:
ИГМА, 2003.
16. Тарасова Л.А., Думкин В.Н. // Профессиональные заболевания: Руководство / Под ред. Н.Ф. Измеро-ва. — М.: Медицина, 1996. — С. 136—200.
Поступила 04.07.08
УДК 615.9:591.88
Л.М. Соседова, Н.Л. Якимова, Е.А. Титов, Е.А. Капустина ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ТОКСИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ
Ангарский филиал — НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН, г. Ангарск
Статья посвящена проблеме экспериментального биомоделирования токсических энцефалопа-тий. Представлены основные методические подходы к моделированию, критерии и методы оценки патологического состояния в центральной нервной системе (ЦНС), а также приведены результаты собственных исследований по созданию моделей токсических энцефалопатий, вызванных ингаляционным введением паров металлической ртути и винилхлоридом.
Ключевые слова: экспериментальное моделирование, токсическая энцефалопатия, профессиональные нейротоксиканты, центральная нервная система.
L.M. Sosedova, N.L. Yakimova, E.A. Titov, E.A. Kapoustina. Experimental modelling of toxic encephalopathy. The article covers problem of experimental biologic modelling of toxic encephalopathies. The authors represent major methodic approaches to modelling, criteria and methods to evaluate pathologic condition of CNS, present results of own research in creating models of toxic encephalopathies caused by metallic mercury and vinylchloride inhalation.
Key words: experimental modelling, toxic encephalopathy, occupational neurotoxic chemicals,
CNS.
Одним из подходов к познанию сложных механизмов развития патологических процессов в организме является экспериментальное моделирование. Моделирование нейроинтоксикаций профессиональными химическими факторами позволяет выявить сущность и динамику патологического процесса в ЦНС, дает возможность визуализировать повреждение ткани мозга на клеточном и внутриклеточном уровнях, как на ранних стадиях токсического повреждения, так и в течение относительно длительного периода, что в клинических условиях неосуществимо.
Наиболее часто последствием воздействия нейротоксикантов является токсическая энцефалопатия, характеризующаяся значительной вариабельностью по локализации, степени охвата патологическим процессом тех или иных структур мозга, механизмами повреждения. Поэтому для систематического изучения токсической энцефалопатии необходимо иметь в наличии высоковоспроизводимую модель, адекватную клинической ситуации и задачам исследований. Среди методических трудностей экспериментального моделирования важным является не только вопрос адекватного приближения создаваемой модели к патологии человека, но и информативность, доступность методов оценки патологического процесса в ЦНС и функционального состояния организма животных.
Целью нашей работы являлась разработка экспериментальных методов моделирования ней-роинтоксикаций, вызванных профессиональными факторами, и обоснование критериев оценки формирования поражений ЦНС.
Методические подходы к моделированию токсической энцефалопатии. Для изучения токсических поражений ЦНС экспериментаторы отдают предпочтение грызунам, в частности белым крысам, поскольку молекулярная и клеточная биология их нервных клеток имеет высокую степень гомологии с высшими млекопитающими, а имбридинг мелких животных гарантирует относительную гомогенность особей [13, 15]. Важным преимуществом грызунов являются их относительно низкая себестоимость и возможность проведения экспериментов на достаточно большом количестве животных, что значительно повышает статистическую значимость полученных результатов.
Существующие модели токсической энцефалопатии основаны на однократном либо подо-стром введении токсичных веществ (фенилги-дразин, ацетат свинца в сочетании с сульфатом аммония) и, как правило, не учитывают естественный путь поступления профессиональ-
ных промышленных нейротоксикантов [4, 14]. Следует констатировать, что данные способы посвящены созданию острой токсической энцефалопатии. Вместе с тем в клинической практике в отдаленном периоде, в том числе и после прекращения экспозиции токсикантов, нередко наблюдается прогрессирование нервно-психических нарушений с развитием хронически текущего нейродегенеративного процесса [7].
В собственных исследованиях нами воспроизводилась модель хронической токсической энцефалопатии при длительном ингаляционном введении вредных веществ: паров металлической ртути и винилхлорида. При этом аналогично производственным были воспроизведены режим воздействия и способ поступления нейротокси-канта в организм экспериментальных животных, в то время как выбранные действующие концентрации превышали среднесменные в реальных условиях по ртути в 72,4, а по винилхлори-ду в 1224 раза. Высокие уровни воздействия определялись необходимостью формирования выраженного патологического процесса в ЦНС с возможностью выявления и объективной регистрации патологических изменений в относительно позднем постконтактном периоде, а также изучения патофизиологических механизмов прогредиентного течения. Эффекты нейроток-сичности должны были сохраняться в течение длительного времени, в том числе и через 2 мес после окончания воздействия, соответствующего 8—10 годам жизни человека. Хроническое ингаляционное воздействие изучаемыми веществами проводили в 200-литровых газовых камерах при динамической подаче винилхлорида из баллона через систему редукторов и смесителей, а паров ртути путем сдувания током воздуха через гусек, заполненный металлической ртутью. Воздействие ксенобиотиков на 256 белых крысах-самцах массой 180—230 г продолжалось в течение 8 нед, по четыре часа ежедневно, исключая выходные дни, в зимний период. Средняя концентрация винилхлорида в затравочных камерах, определяемая ежедневно через 60 и 200 мин после начала подачи газа с использованием газохроматографического метода, составляла 1224 ± 99,49 мг/м3 (всего проанализировано 165 проб воздуха). Содержание ртути определяли с помощью серийного отечественного анализатора ртути «Юлия-2М» с расширенным диапазоном измерений и цифровым отсчетом показаний [8]. Соблюдали следующие условия отбора проб: воздух из камеры со скоростью 0,2 л/мин протягивался через два последовательно соединенных поглотительных прибора, запол-
ненных 8 мл 8 % раствора йода в йодистом калии, объем отобранного воздуха составлял 3 л. Анализировали пробы через 2 ч от начала и в конце ингаляционного воздействия, полученные результаты усредняли. Средняя концентрация паров ртути в затравочных камерах составляла — 0,362 ± 0,02 мг/м3 (всего проанализировано 140 проб воздуха). Животным контрольной группы в том же режиме воздействия в камеры подавался воздух без исследуемого вещества. Обследование экспериментальных животных проводили непосредственно после окончания ингаляционного воздействия и спустя 9 недель после окончания экспозиции.
Методы оценки патологического процесса в ЦНС. Для объективной визуализации токсического действия в нервной ткани применяют различные методические подходы — физиологические, биохимические, морфологические, гистохимические и другие [5]. Высшая нервная деятельность животных ярче всего раскрывается во врожденном ориентировочно-исследовательском поведении, благодаря которому животные получают знания об окружающей среде и осуществляют психологическую адаптацию к меняющимся внешним условиям. Специально разработанные тесты позволяют адекватно оценить двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, эмоциональное состояние, агрессивность животных, рабочую и долговременную память, а также их когнитивные способности по результатам выработки условных рефлексов.
В качестве критериев и методов оценки патологического процесса в ЦНС при моделировании токсической энцефалопатии применялся комплексный подход, включающий в себя изучение у животных общей структуры поведения, неврологического статуса, состояния ВНД, нейрофизиологических показателей и морфофунк-циональные повреждения нервной ткани. При этом информативность тех или иных тестов весьма существенно менялась в различные сроки с момента создания модели токсической энцефалопатии, в связи с чем верификацию отдаленной токсической энцефалопатии после окончания ингаляционного воздействия нейротоксикантом проводили дважды в динамике, оценивая вектор изменений поведенческой активности и неврологического статуса.
Ориентировочно-исследовательскую, двигательную активность, уровень негативно-эмоциональных реакций оценивали широко используемым методом «открытое поле» [3]. В течение 3 мин у животных регистрировали количество, длительность и последовательность
поведенческих актов: норка, локомоция, вертикальная стойка, стойка с упором, движение на месте, обнюхивание — ориентировочно-исследовательская активность; груминг, движение на месте, вертикальная стойка — эмоциональное поведение; изменение суммарного количества и времени всех актов — неспецифическая активация или подавление движения. На основании вероятности появления того или иного акта и вероятностей достоверных взаимопереходов между ними строили граф поведения [1]. Важным моментом являлось перед проведением исследований предварительное тестирование белых крыс по методу «открытое поле», с целью исключения из экспериментов животных с пассивным типом поведения.
Рабочую память животных и эмоциональное состояние анализировали при помощи приподнятого «крестообразного лабиринта», основанного на естественной боязни открытого пространства и падения с высоты [3]. Животное помещали в центр пересечения рукавов и фиксировали период первого выхода в открытый рукав, число переходов из светлого и темного рукавов, длительность пребывания в них, число и время актов свешивания в открытых рукавах и выглядывания из закрытых рукавов. Наблюдение вели в течение 3 мин. По существующим представлениям у крыс формируется «когнитивная карта», позволяющая им не повторять заходы в уже обследованные рукава, поэтому возрастание количества переходов может свидетельствовать о нарушениях процессов кратковременной памяти. Идентификацию в этографе «открытое поле» и «крестообразном лабиринте» отдельных поведенческих паттернов, проводили при помощи специально разработанной математической программы на основании вероятности появления и времени выполнения того или иного акта [1].
Тест «чужак-резидент» позволяет оценить внутривидовое зоосоциальное поведение животных. Резидент — животное из опытной или контрольной групп — помещали в отдельную клетку на 40 мин, после чего к нему подсаживали другое животное, не относящееся ни к одной из этих групп. Учитывали количество общений, инцидентов агрессии — нападений, угрожающих поз резидента в течение 5 мин.
Неврологический статус и координационные расстройства анализировали по результатам теста «вращающийся стержень» при скорости вращения — 8 об./мин [12]. Состояние мышечного тонуса и равновесия оценивали по результатам трех попыток. Когнитивную способность и состояние памяти опытных и контрольных белых
крыс изучали по времени выработки условного пищедобывательного рефлекса дифференциров-ки освещенности в течение 9 дней. При этом ежедневно учитывали 20 пробежек. Условный рефлекс считали выработанным, если животное устойчиво в течение двух суток выполняло правильно не менее 75 % пробежек. Обучаемость и память оценивали по числу животных (%), достигших критерия обученности.
Регистрацию ритмической электрической активности коры головного мозга белых крыс проводили на 3—4-й день после вживления электродов в височно-затылочную и теменную зоны на электроэнцефалографе DX — NT 32. V 19 (производитель «DX-Complexes» LTD, г. Харьков). Определяли мощность отдельных диапазонов (5, 0, a, pi, Р2), Рассчитывались коэффициенты К1 — отношение мощностей 0/5-ритмов, К2 — отношение мощностей 0/а-ритмов, отношение мощности 5-ритма к суммарной мощности a-, Р1- и Р2-ритмов. Оценивали изменение мощности ритмов в ответ на фотостимуляцию частотой 2 и 7 Гц, случайную фотостимуляцию и зрительные вызванные потенциалы.
Для оценки функции периферической нервной системы проводили стимуляционную элек-тронейромиографию (ЭНМГ) с использованием игольчатых электродов (электронейромиограф «Нейро-ЭМГ-Микро» производства фирмы «Нейрософт», г. Иваново). Анализировали следующие ЭНМГ-показатели: амплитуда мышечного ответа (М-ответа), латентный период (латентность), длительность М-ответа, площадь вовлечения [2]. Референтный и стимулирующий электроды вводили в m. biceps femoris, заземляющий электрод закрепляли на стопе. При проведении исследования животных фиксировали на столике. Параметры стимуляции задавались методикой проведения стимуляционной
ЭНМГ.
Для выполнения патоморфологических исследований после декапитации животных быстро извлекали головной мозг, легкие, почки и печень. Головной мозг фиксировали в 70 % растворе спирта, а остальные органы в 10—12 % растворе нейтрального формалина, с последующей заливкой в парафин. Приготовленные срезы толщиной 15 мкм окрашивали по общепринятым методам: гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону, а головного мозга — дополнительно по Нисслю. В нефиксированных срезах, изготовленных в криостате при температуре -20 °С, гистохимическими определяли содержание липидов, гликогена, активность сукцинатдегидрогеназы и щелочной фосфатазы [6, 9].
К высокоинформативным методам анализа относятся иммуногистохимические исследования нервной ткани с помощью антител к вимен-тину, нейронспецифической енолазе, глиофи-бриллярному кислому протеину, белку Б-100, синаптофизину с помощью набора реагентов для иммуногистохимического окрашивания срезов тканей с использованием мышиных антител и пероксидазной метки [6].
Электронно-микроскопические исследования позволяют изучить ультраструктурные нарушения морфологии нервной ткани. Материалом для исследования служили сенсомоторная кора больших полушарий, мозжечок, гипоталамная область головного мозга.
Р е з у л ь т а т ы. Анализ полученных экспериментальных данных биомоделирования токсической энцефалопатии позволил подтвердить правильность выбранных методов воздействия изучаемых профессиональных факторов и критериев оценки формирования патологического процесса в ЦНС [3, 9]. У экспериментальных животных наблюдали стойкое нарушение нормального соотношения между процессами возбуждения и торможения в коре головного мозга. При интоксикации парами ртути первоначально преобладали процессы возбуждения с последующим развитием процессов торможения, в то время как длительное воздействие винилхлоридом вызывало стойкое ослабление в первую очередь тормозных процессов [10, 11].
Структура поведения белых крыс непосредственно после воздействия исследуемыми химическими соединениями в целом характеризовалась следующими однотипными проявлениями: общим двигательным возбуждением, повышенной ориентировочно-исследовательской активностью, негативно-эмоциональным состоянием, нарастанием тревожности и внутривидовой агрессивности. Неврологические расстройства характеризовались мышечным гипертонусом и координационными нарушениями (при ртутной интоксикации). Развитие токсической энцефалопатии, формирующейся в отдаленный период после ингаляционного воздействия металлической ртути, сопровождалось снижением мотивации к ориентировочно-исследовательскому поведению, эмоционально негативным состоянием, возрастанием зоосоциальной агрессии и длительной сохранностью неврологических нарушений. Структура поведения белых крыс в отдаленном периоде после воздействия ви-нилхлорида сохраняла все особенности, наблюдавшиеся сразу после окончания воздействия. О наличии когнитивного дефицита и снижении
памяти животных свидетельствовали результаты выработки условного пищедобывательного рефлекса дифференцировки освещенности.
В показателях биоэлектрической активности головного мозга преобладала патологическая медленноволновая активность, выявлялись нарушения корково-подкорковых взаимосвязей, проявляющиеся в изменении коркового зрительного ответа в виде отставания по времени реакции коры, увеличении латентности Р200 и длительности всего ответа. По данным ЭНМГ-исследования выявлялись достоверные изменения состояния нервного ствола, соответствующие аксональному типу поражения. Патомор-фологическая верификация поражения нервной ткани промышленными нейротоксическими соединениями свидетельствовала о наличии пе-риваскулярного и перицеллюлярного отеков, дистрофии нейронов коры головного мозга и клеток Пуркинье; структурном нарушении слоев коры и гиппокампа, нарушении метаболической активности нервных клеток, наличии выраженного спонгиоза и гибели клеток в отдельных случаях по апоптозному типу. Иммуногисто-химическая идентификация выявила снижение содержания кислого глиального белка, Б-100 и повышение активности нейронспецифической енолазы [12, 13].
З а к л ю ч е н и е. Экспериментальные модели токсической энцефалопатии позволяют исследовать и обобщить представления о пато- и морфогенезе токсических энцефалопатий в разные периоды развития патологического процесса в центральной нервной системе, начиная от острого периода нарушений, с формированием в последующем хронических очагов, приводящих к ишемии и органическим повреждениям структуры головного мозга с возможным развитием прогредиентной нейродегенерации. Далеко не исчерпаны возможности использования экспериментальных моделей для доклинического испытания новых лекарственных препаратов, в том числе и нанокомпозитов на основе природного материала, а также разработки новых средств восстановления нарушенных функций ЦНС. Научно обоснованное сопоставление результатов экспериментального моделирования и правильная экстраполяция
приблизят нас к пониманию общих механизмов и закономерностей формирования патологии центральной и периферической нервной системы при воздействии профессиональных нейроинтоксикаций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Авалиани Т.В., Циркунов С.Г., Белорбокова Н.К. // Ж. эволюционной биохимии и физиологии. — 2005.
— Т. 41, № 5. — С. 436—441.
2. Бадалян Л.О. Клиническая электронейромиогра-фия: Руководство для врачей. — М.: Медицина, 1986.
3. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения.
— М.: Высшая школа, 1991.
4. Горбунова Н.Б., Лукашевич В.С., Калюнов В.Н. // Сб.: Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности / Под ред. В.Н. Гурина,
B.А. Кульчицкого, В.Н. Никанорова. — Минск: По-либег, 1999. —С. 46—47.
5. Квитницкий-Рыжов Ю.Н. / /Фармакол. и ток-сикол. — 1990. — Т. 53, № 4. —С. 77—82.
6. Коржевский Д.Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов.
— С.-Пб.: Кроф, 2005.
7. Лахман ОЛ, Колесов В.Г., Андреева О.К. и др. // Мед. труда. — 2003. — № 3. — С. 46—48.
8. Маняшин Ю.А., Зусман Б.Л. // Гиг. труда. —
1981. — № 1. — С. 48—49.
9. Ракитский В.Н., Николаева Н.И. Морфофунк-циональные критерии действия на организм факторов окружающей среды. — М.: Медицина, 2001.
10. Соседова Л.М., Капустина Е.А., Титов Е.А. // Мед. труда. — 2008. — № 1. — С. 24—29.
11. Соседова Л.М., Хамуев Г.Д., Якимова К.Л., Носатова В.А. //Там же. — 2007. — № 6. — С. 36—40.
12. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Володин Н.Н. и др. // Бюл. экспер. биол. — 2003. — Т. 136, № 6. —
C. 629—633.
13. Чехонин В.П., Лебедев С.В., Петров С.В. и др. // Вестн. РАМН. — 2004. — № 3. — С. 47—54.
14. Явербаум. Общие вопросы токсического действия свинца. — Иркутск, 2006.
15. Takizawa S., Hakins A.N. // Cerebrovasc. Dis. — 1991. — Suppl. 1. — Р. 16—21.
Поступила 04.07.08
