CC BY
45
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 2 (114) 2012
УДК 615.22+615.451.13:611.018.2:616.381-007.274-092.9 С. В. СКАЛЬСКИЙ
Г. А. ШАМРАЙ
Омская государственная медицинская академия
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЕРАПАМИЛА КАК РЕГУЛЯТОРА ФУНКЦИИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ И КЛЕТОК МИКРООКРУЖЕНИЯ
Цель исследования — экспериментальное доказательство наличия у лекарственных средств группы блокаторов медленных кальциевых каналов дозозависимых эффектов в отношении функциональной активности фибробластов. Объектом изучения в исследовании служили спайки между листками брюшины. Спаечный процесс моделировался внутрибрюшинным введением стерильной аутокрови экспериментальным животным (кролики, белые крысы). Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила сопровождалось достоверным снижением общего количества спаек. Полученные данные позволяют разработать способ интраоперационной профилактики перитонеального спайкообразования блокатором медленных кальциевых каналов верапамилом у пациентов хирургического и гинекологического профиля.
Ключевые слова: верапамил, брюшина, спайкообразование, эксперимент, фибро-бласты.
Используемые в настоящее время методы профилактики образования и рецидива послеоперационных спаек (ПОС) (хирургические, связанные с иссечением соединительнотканных образований; физиотерапевтические, реализуемые с использованием методов электро-, свето- и звукотерапии; медикаментозные с использованием глюкокортикостероидов, средств с коллагеназной активностью и др.) способны либо оперативно ликвидировать уже сформированные соединительнотканные образования, либо замедлить их возникновение [1]. В первом случае возникает опасность рецидива, во втором — хронизации процесса из-за удлинения сроков закрытия тканевого дефекта. Инициирующие же механизмы спайкообразования, в частности активность клеточных и гуморальных факторов резистентности, исходом активации которых и является, по сути, образование спаек, в качестве объектов фармакологической регуляции не рассматривались. Благодаря этому возникает возможность поиска новых универсальных (не зависящих от тканевой принадлежности фибробластов), экономичных методов профилактики возникновения ПОС.
Разработке современных эффективных методов профилактики ПОС в немалой степени препятствует отсутствие адекватной экспериментальной модели процесса их формирования. Существующие ныне модели в абсолютном большинстве есть модели экспериментального перитонита бактериальной этиологии, исходом которого является распространенный спаечный процесс в брюшной полости [2]. Адекватная универсальная модель внутрибрюшин-ного спайкообразования могла бы базироваться на представлении о ключевой роли фибрина в составе перитонеальной жидкости и фибробластов, презен-тированных в тканях либо мигрировавших в очаг
повреждения, как определяющих биохимических и морфологических факторах процесса образования ПОС [3]. Функциональная активность фибробла-стов регулируется клетками микроокружения с участием цитокинов и ионизированного Са2+ в качестве вторичного мессенджера. Хорошо изучена группа лекарственных средств, имеющих основным фар-макодинамическим эффектом снижение концентрации Са2+ в цитоплазме активно функционирующих клеток — блокаторы медленных кальциевых каналов (БМКК) или кальциевые антагонисты [4]. В литературе имеются немногочисленные данные, прямо или косвенно свидетельствующие о наличии у БМКК фармакологических эффектов, реализуемых модификацией функциональной активности фибробластов и, соответственно, структуры формирующейся соединительной ткани [5]. Исследований использования БМКК для профилактики перитонеального спайкообразования после оперативных вмешательств на органах брюшной полости проведено не было. Не удалось обнаружить также систематических исследований фармакодинамических эффектов БМКК, лежащих в основе регулирующего воздействия на функцию фибробластов и клеток их микроокружения, а в итоге — на структуру и функцию вновь образуемой соединительной ткани.
Материал и методы исследования. В экспериментах использовано 44 половозрелых кролика-сам-ца породы Шиншилла массой тела 2500 — 3200 граммов и 163 самца беспородных белых крыс массой тела 180 — 200 граммов. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Объектом изучения служили спайки между листками
Таблица 1
Распределение экспериментальных животных по разделам исследования
Раздел исследований Группа Количество эксперимен- тов Вид животного
Моделирование внутрибрюшинно-го спайкообразования Аутокровь 22 кролик
Аутокровь 48 (50)* крыса
Профилактика внутрибрюшинного спайкообразования Аутокровь + верапамил 22 кролик
Аутокровь + верапамил 50 крыса
Оценка кардио-и гемодинамических эффектов верапамила в зависимости от дозы Без верапамила, исходно 27 крыса
Верапамил 0,1 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 20 крыса
Верапамил 0,2 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 20 (23)* крыса
Верапамил 0,4 мг/кг: через 15 мин через 2 часа через 4 часа 23 крыса
Примечание * — в скобках указано общее количество животных, включенных в эксперимент, за скобками — количество выживших
брюшины. Спаечный процесс моделировался однократным инъекционным внутрибрюшинным введением стерильной аутокрови экспериментальным животным (кролики, белые крысы) из расчета 1% массы тела (патент на изобретение № 2260854 от 24.11.2003 г.). Для профилактики образования соединительнотканных спаек верапамил (водный раствор верапамила 0,25% концентрации в ампулах по 2 мл производства ОАО «Биосинтез», г. Пенза, серия № 10203) вводили одновременно с повреждающим фактором (аутокровью) однократно внутрибрю-шинно в дозе 0,001 на 1 кг массы тела (заявка на изобретение № 2003134121 от 24.11.2003 г.). Эффективность изучаемого метода профилактики спайко-образования оценивалась через 7—10 суток.
Иссеченные соединительнотканные спайки подвергались макро- и микроскопическому анализу с использованием стандартных морфометрических методик. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная микроскопия с изучением общего плана строения ткани) и пикрофуксином по ван Ги-зону (выявление коллагеновых волокон).
В клеточном осадке центрифугированной перитонеальной жидкости определяли феномен макро-фагальной трансформации мононуклеарных клеток в культуре лейкоцитов. В надосадочной жидкости определяли содержание фактора некроза опухолей альфа (ФНО-а) и интерлейкина-1 в (ИЛ-1Р) твердофазным иммуноферментным методом с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента стандартным набором реагентов; содержание оксипролина по методике П. Н. Шараева и гиалуроновой кислоты по карбазольной реакции Дише.
В отдельной серии острых опытов на белых беспородных крысах-самцах изучали дозозависимость влияния внутрибрюшинного введения верапами-ла на уровни систолического, диастолического и среднего артериального давления, периферическое сосудистое сопротивление и показатели сердечного выброса в течение 4 часов после инъекции. Диапа-
зон исследуемых доз — 0,1; 0,2; 0,4 мг/кг массы тела животного. За оптимальную дозу, используемую в дальнейшем для внутрибрюшинного введения в основной серии экспериментов (для профилактики спайкообразования), принималась максимальная переносимая доза, не вызывавшая значимых и достоверных изменений кардио- и гемодинамики. Возможные гемо- и кардиодинамические эффекты верапамила регистрировались электроманометри-ческим, электрокардиографическим и реографиче-ским блоками полифизиографа.
Расчетное число экспериментальных животных в выборке, минимально достаточное для получения достоверных данных, было принято равным 12. Распределение экспериментальных животных по разделам исследования и группам представлено в табл. 1.
Результаты и их обсуждение. Профилактическое внутрибрюшинное введение верапамила сопровождалось достоверным (р<0,01) снижением общего количества спаек до 0,22±0,04 на одно животное с явным преобладанием висцеро-париеталь-ной локализации. Число перитонеальных спаек в условиях нашего эксперимента явилось своеобразной характеристикой реактивности брюшины и ее (реактивности) изменений под действием верапамила. Отсутствие спаек у большинства животных в основной группе характеризует снижение реактивности брюшины при воздействии на нее верапамила. Закономерно изменялась и морфология спаек в зависимости от их числа в брюшной полости: единичные спайки представляли собой фибринозные наложения без коллагеновых волокон. Последние не могут быть охарактеризованы как спайки в связи с отсутствием в их микроструктуре упорядоченных, собранных в пучки волокон. У немногочисленных животных с 2 — 3 спайками в брюшной полости встречались единичные хаотично расположенные коллагеновые волокна. На поверхности спаек находилось небольшое количество мезотелиоцитов. Клеточный состав представлен лимфоцитами, гистиоцитами, фибробластами. Определялось большое количество
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 2 (114) 2012 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 2 (114) 2012
Изменение биохимических показателей функции перитонеальных фибробластов кроликов под действием верапамила
Параметры Оксипролин, мкмоль/л Гиалуроновая кислота, ммоль/л
без верапамила с верапамилом без верапамила с верапамилом
Среднее 7,57 6,58 1,01 0,82
^а1ие 8,79 8,17
df 36 36
Р 1,71Е-10 1,01Е-09
п 19 19 19 19
СКО ± 0,36 0,34 0,09 0,04
F-ratio 1,15 4,71
Р 0,77 0,002
моноцитов, макрофагов, многоядерных клеток типа гигантских клеток инородных тел. Уменьшение числа перитонеальных спаек, возникавших как исход аутогемоперитонеума, под влиянием верапамила является основным интегративным показателем действия препарата на коллагенсинтезирующую функцию фибробластов. Введение верапамила одновременно с моделированием аутогемопери-тонеума предотвращало чрезмерную активацию клеток моноцитарно-макрофагального ряда перитонеальной жидкости. Сопоставление показателей макрофагальная трансформация моноцитов (МТМ) в группах экспериментальных животных без лечения и на фоне введения варапамила показало, что количество моноцитов перитониальной жидкости, способных к трансформации в макрофаги, при профилактическом введении препарата было в 2 раза ниже, чем в группе сравнения и составило в среднем 37,9±2,6% (р<0,01), Исследование уровней ФНО-а и ИЛ-1Р в группах сравнения выявило, что введение верапамила предотвращало повышение содержания данных цитокинов, останавливая наработку ФНО-а в среднем на уровне 104,1±42,2 пг/л (р<0,01), ИЛ-1Р 3,3±1,2 пг/л (р<0,01), что было соответственно в 2 и 3 раза ниже, чем в экспериментальной группе без лечения. Таким образом, под действием верапамила происходила нормализация активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов, модулирующих коллаген-синтезирующую функцию перитонеальных фибробластов, что внесло свой вклад в предотвращение перитонеального спайкообразования. Это подтверждается также наличием прямой корреляционной связи между долей трансформированных моноцитов и спаек в брюшной полости (г>0,6; р<0,01). Биохимические маркеры образования соединительной ткани также претерпевали существенные изменения при профилактическом введение верапамила: отмечалось достоверное снижение содержания оксипролина и гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости к 7—10 суткам после моделирования аутогемоперитонеума (табл. 2).
Выявлен более низкий коэффициент корреляции между исследуемыми биохимическими показателями и числом перитонеальных спаек у животных, подвергшихся воздействию верапамила. Это может быть объяснено дискретностью показателя, характеризующего интенсивность спайкообразования (число спаек, а не их масса, площадь), и потому — преобладанием его нулевых (незначимых) значений
у большинства экспериментальных животных группы. Несмотря на невысокий коэффициент корреляции, можно заключить, что в условиях нашего опыта уровни оксипролина и гиалуроновой кислоты в перитонеальной жидкости кроликов характеризовали выраженность анаболической активности фибро-бластов и ее снижение под действием верапамила. На основании наших исследований можно сделать вывод, что антипролиферативная и антианаболиче-ская активность верапамила при внутрибрюшин-ном введении в отношении перитонеальных фибро-бластов реализуется угнетением их двигательной, пролиферативной и метаболической активности, а также подавлением функциональной (цитокин-про-дуцирующей и фагоцитарной) активности клеток микроокружения, прежде всего моноцитарно-ма-крофагального ряда. Классический БМКК недиги-дропиридинового ряда верапамил оказывает прямое воздействие на активность фибробластов, клеточную и гуморальную регуляцию их функций, эффективно профилактирует процессы внутрибрюшин-ного спайкообразования. Полученные данные могут служить экспериментальной базой для разработки фармакологических методов профилактики послеоперационного спайкообразования в клинике.
Заключение. Эффективность интраперитоне-ального введения БМКК верапамила для профилактики спайкообразования определяется как прямым воздействием БМКК верапамила на перитонеальные фибробласты и клетки их микроокружения, оптимизируя их функциональную активность с приведением ее в соответствие с возможностями микроциркуляторного русла, так и опосредованным влиянием — уменьшением выраженности тканевой гипоксии и метаболического ацидоза в зоне повреждения брюшины. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием внутрибрюшин-ного введения верапамила в качестве способа профилактики перитонеального спайкообразования и позволяют разработать и внедрить способ интрао-перационной профилактики перитонеального спай-кообразования блокатором медленных кальциевых каналов верапамилом у пациентов хирургического и гинекологического профиля.
Библиографический список
1. Савельева, Г. М. Настоящее и будущее эндоскопической хирургии в гинекологии / Г. М. Савельева, Г. Н. Бреусенко,
Л. М. Капиушева // Эндоскопия и альтернативные подходы в хирургическом лечении женских болезней : материалы международного конгресса. — М., 2001. — С. 24 — 29.
2. Состояние системы нейтрофильных фагоцитов в модели экспериментального перитонита / Е. А. Чагина [и др.] // Современные наукоемкие технологии. — 2005. — № 10. — С. 69.
3. Мынбаев, О. А. Этиология, патогенез и принципы профилактики послеоперационных спаек у гинекологических больных : дис. ... д-ра мед. наук : 14.00.01, защищена 25.05.1997 в НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН / О. А. Мынбаев. — М., 1997. — 365 с.
4. Pahor, M. Health outcomes associated with calcium antagonists compared with other first-line antihypertensive therapies: a metaanalysis of randomized controlled trials / M. Pahor, B. Psaty, M. Alderman // Lancet. — 2000. — № 356. — Р. 1949- 1954.
5. Ranganathan, S. / Effect of calcium-blocking drugs on lysosomal function in human skin fibroblasts / S. Ranganathan, R. L. Jackson // Biochem. Pharmacol. — 1984. — № 8. — P. 15.
СКАЛЬСКИЙ Сергей Викторович, кандидат медицинских наук, доцент (Россия), заведующий кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии.
ШАМРАЙ Галина Анатольевна, лаборант кафедры фармакологии с курсом клинической фармакологии.
Адрес для переписки: e-mail: [email protected]
Статья поступила в редакцию 12.09.2012 г.
© С. В. Скальский, Г. А. Шамрай
УДК 616.9-06:595.421+614.89 Л. В. ТРУБИНА
Омская государственная медицинская академия
ФАКТОРЫ, МОТИВИРУЮЩИЕ НАСЕЛЕНИЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ СРЕДСТВА ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОТ НАПАДЕНИЯ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ
Рассмотрен возможный экономический ущерб пострадавшего от присасывания клеща, описаны возможные исходы и осложнения, к которым способны привести инфекции, переносимые иксодовыми клещами. Показаны преимущества средств индивидуальной химической защиты от нападения иксодовых клещей.
Ключевые слова: альфациперметрин, инфекции, переносимые иксодовыми клещами.
Заболеваемость инфекциями, переносимыми иксодовыми клещами (ИПК), ежегодно увеличивается, несмотря на расширение программы вак-цинопрофилактики клещевого энцефалита (КЭ). Это обусловлено как ростом численности клещей и частоты их нападения на людей, так и отсутствием вакцин, защищающих от заболевания иксодовыми клещевыми боррелиозами (ИКБ) и другими бактериальными ИПК. Кроме того, как установлено в ходе проведенного нами в г. Омске анкетирования, население очень редко пользуется средствами индивидуальной химической защиты (ИХЗ) от присасывания иксодовых клещей либо в силу незнания о существовании и эффективности подобных препаратов, либо в силу нежелания расходовать собственные денежные средства. Последнее, в свою очередь, объясняется низкой информированностью об ИПК и наносимом ими экономическом ущербе не только обществу в целом, но и конкретному человеку, пострадавшему от присасывания клеща.
Цель исследования — определение экономической составляющей мотивации на затраты личных денежных средств для профилактики инфекций, переносимых иксодовыми клещами, средствами индивидуальной химической защиты.
Для достижения данной цели проведено изучение потенциального ущерба для личного финансового благополучия человека, пострадавшего от присасывания клеща, а также затрат на профилактику ИПК с помощью средств ИХЗ.
В случае присасывания клеща каждый пациент должен пройти процедуру исследования клеща на наличие вируса КЭ и бактерий рода боррелий. Проведение данных исследований осуществляется за счет личных средств пострадавшего. Стоимость исследования клеща на наличие вируса КЭ методом иммуноферментного анализа в лабораториях г. Омска составляет 180 — 200 рублей, стоимость микроскопии клеща на боррелии — 130 рублей. Рационально проводить исследование клеща на наличие всех ИПК. Стоимость же данного исследования высокоспецифичным и чувствительным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораториях г. Омска составляет 700 рублей. Помимо исследования клеща можно проводить анализ биологических сред пациента — крови, ликвора. Такая необходимость возникает в ситуациях, когда, в силу различных причин, пациент не смог сохранить укусившего его клеща. Стоимость исследования биологических жидкостей методом ПЦР на ИПК — 700 рублей [1].
ОМСКИЙ НАУЧНЫЙ ВЕСТНИК № 2 (114) 2012 МЕДИЦИНСКИЕ НАУКИ
