CC BY
47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ГЛУТАТИОНА КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СТРЕССИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ
1 9
Мартусевич А.А. , Дерюгина А.В.
1ФГБУ «Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр» Минздрава России, Нижний Новгород, Россия
ФГАОУ ВПО «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского», Нижний Новгород, Россия;
Abstract
The aim of this paper is estimation of the response of glutathione system on the alteration of organisms' functions under the influence of different exposures (short-time physical exercises, intraperitoneal injections of adrenaline and bee venom). It is stated that level of total, restored and oxidized glutathione was typically increased at all exposures, but the heaviness of stress correlated with elevation of this metabolite concentration.
Key words: stress factors, glutathione, alteration
Целью работы явилось изучение реакции системы глутатиона на альтерацию функций организма животного при помощи различных агентов (кратковременная физическая нагрузка и внутрибюшинное введение адреналина и пчелиного яда).
Установлено, что концентрация общего, восстановленного и окисленного глутатиона однотипно возрастала при всех видах альтерационного воздействия, причем тяжесть альтерации детерминировала степень элевации уровня данного соединения.
Ключевые слова: стрессирующие воздействия, глутатион, альтерация
Одним из значимых компонентов антиоксидантной системы человека и животных является глутатион (гамма-глутамилцистеининглицин), представляющий собой самое распространенное сульфгидрильное соединение в животных клетках [1. 2. 5]. Он может быть синтезирован из L-цистеина, L-глутаминовой кислоты и глицина за две АТФ-зависимые стадии [5]. Глутатион содержит нетипичную гамма-связь между Glu и Cys, причем восстановителем является тиольная группа цистеинового остатка. В клетке тиоловые группы находятся в восстановленном состоянии (SH), присутствуя в концентрации около 5 мМ [4, 5]. Такая высокая концентрация глутатиона в клетке приводит к тому, что он восстанавливает любую дисульфидную связь (S-S), образующуюся между
цистеинами цитозольных белков [2]. При этом восстановленная форма глутатиона (GSH) превращается в окисленную (GSSG).
Функцией глутатиона является также поддержание активного состояния многих ферментов, самопроизвольное окисление которых приводит к образованию дисульфидной группы. Данный механизм реализуется тем, что глутатион восстанавливает сульфгидрильные формы [7].
Окисленный глутатион восстанавливается флавопротеином
глутатионредуктазой, которая утилизирует Н+ из НАДФН+Н. Две молекулы восстановленной формы (GSH) при окислении образуют дисульфид (GSSG).
Восстановленный глутатион - главный антиоксидант эритроцитов, он служит коферментом при восстановлении метгемоглобина в функционально активный гемоглобин [4, 5]. С помощью восстановленного глутатиона также осуществляется детоксикация гидроперекисей, которые образуются при реакции активных радикалов кислорода с ненасыщенными жирными кислотами мембраны эритроцитов. Баланс «восстановленный/окисленный глутатион» в клетке является одним из важнейших параметров, визуализирующих уровень оксидантного стресса [2-4].
Целью работы явилось изучение реакции системы глутатиона на альтерацию функций организма животного при помощи различных агентов (кратковременная физическая нагрузка и внутрибюшинное введение адреналина и пчелиного яда).
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 30 нелинейных белых крысах-самках массой 200 - 250 г. Содержание животных соответствовало правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) [3]. Животных кормили натуральными и брикетированными кормами в соответствии с утвержденными нормами. Животные прошли карантин и акклиматизацию в условиях вивария в течение 14 суток.
Крысы были разделены на 5 групп по 6 животных в группе:
1 группа - интактные крысы;
2 группа - внутрибрюшинное введение 0,9% хлорида натрия (контроль);
3 группа - физическая нагрузка в виде плавания 15 мин. с грузом 10% от массы тела животного при температуре 26-28°С;
4 группа - внутрибрюшинное введение пчелиного яда (0,1мг/кг);
5 группа - внутрибрюшинное введение адреналина (0,1 мг/кг).
Забор крови производили из подъязычной вены через 15, 30, 60, 120 минут и через сутки после воздействия. Исследовали изменение концентрации общего, окисленного и восстановленного глутатиона в крови по методике Sedlak и Lindsey (1968) [6].
Концентрацию глутатиона (А) в колбах №1 и №2 определяют по формуле:
А=Р 100/3,26 мг%,
где I - количество 0,00Ш раствора йодноватистого калия (мл), израсходованного на титрование пробы;
3,26 - число, соответствующее объему йодноватистого калия (мл), идущего на титрование 1 мг глутатиона;
100 - коэффициент пересчета на 100 мл крови.
Глутатион колбы №1 - восстановленный, колбы №2 - общий. Окисленный глутатион определяют по разнице между общим и восстановленным.
Полученные данные были обработаны статистически в программном пакете Statistica 6.1 for Windows. Нормальность распределения значений параметров оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка. С учетом характера распределения признака для оценки статистической значимости различий применяли Н-критерий Краскала-Уоллеса.
Результаты исследований Учитывая структурные и биохимические маркеры окислительной альтерации мембран эритроцитов, важно изучить и состояние антиоксидантной системы и описать характер ее реагирования на изучаемые стрессогенные воздействия.
С этих позиций, а также с учетом того, что большинство сведений об воздействиях различных форм системной альтерации на биомембраны касаются оценки ферментных комплексов (глутатионредуктаза и глутатионпероксидаза), представляло интерес уточнить непосредственную концентрацию глутатиона в эритроцитах крыс сформированных групп.
250
200
о и <D
EJ
ю Ч
о ^
к cf 150
^ к
к £
о
к §
к £ 0)
я к о и
и
100
50 --
0
15 мин 30 мин 60 мин 120 мин 1 сутки время после альтерации
□ интактные
□ контроль
□ плавание □яд
□ адреналин
Рис. 1. Динамика концентрации общего глутатиона в эритроцитах крыс при различных стрессирующих воздействиях («*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05; «#» -статистическая значимость различий с животными, получавшими физиологический раствор р<0,05)
Исследование концентрации общего глутатиона позволило установить наличие единой для животных всех групп тенденции к нарастанию его уровня в динамике эксперимента (рис. 1).
В то же время каждый стрессогенный фактор обуславливал проявление специфических черт реагирования данного показателя.
Так, введение животным физиологического раствора сопровождалось относительно слабым, но статистически значимым увеличением концентрации в эритроцитах данного вещества с максимумом на 60-й минуте наблюдения (136%
по отношению к интактным животным; p<0,05) с последующей редукцией уровня параметра, начиная со 120-й минуты эксперимента, что по истечении суток с момента нанесения воздействия нивелировалось до исходных значений ф>0,05 по сравнению с интактными крысами). Аналогичная динамика концентрации глутатиона в эритроцитах была зарегистрирована в отношении кратковременной физической нагрузки в форме плавания. Вышеописанная тенденция в полной мере касается и внутрибрюшинного введения пчелиного яда, однако важно подчеркнуть, что в этом случае амплитуда отклонения показателя от исходных цифр была выше, причем различия уровня параметра в период с 15-й по 120-ю минуты наблюдения статистически значимы как относительно крыс интактной, так и контрольной группы ф<0,05). При воспроизведении адреналовой токсемии отклонения от нормы содержания общего глутатиона в эритроцитах также отмечались в ранние сроки после альтерации, сохраняясь на практически неизменном высоком уровне на протяжении всего эксперимента ф<0,05 относительно крыс интактной и контрольной групп).
о 1-
ё к
о
ч и о
£ £
о о о и
и
о
§
03
К
0
1
н
ЁЛ 1-
200 150 100 50 0
# *# Й *# -т *4+ -
15 мин 30 мин 60 мин 120 мин 1 сутки время после альтерации
□ интактные
□ контроль
□ плавание
□ яд
□ адреналин
Рис. 2. Динамика изменения концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при различных стрессирующих воздействиях («*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05; «#» -статистическая значимость различий с животными, получавшими физиологический раствор р<0,05)
Подобные сдвиги концентрации общего глутатиона эритроцитов как одного из основных компонентов антиоксидантной системы клетки могут носить адаптивный характер, являясь отображением реакции эритрона на оксидативный стресс как составляющую стресс-адаптации организма, причем тяжесть альтерации детерминирует степень элевации уровня данного соединения.
Рассматривая динамику изменения содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс сформированных групп, необходимо отметить, что в целом тенденция его вариации практически идентична обнаруженной для общего глутатиона, что свидетельствует о максимальном вкладе данного компонента в
формирование сдвигов общего пула данного вещества в изучаемых клетках (рис. 2).
К некоторым особенностям реагирования восстановленного глутатиона на воспроизведенные варианты альтерации можно причислить сравнительно быстрое и стойкое нарастание уровня данного показателя при внутрибрюшинном введении пчелиного яда. На наличие подобной тенденции указывает выявление статистически значимых различий по оцениваемому параметру во всех точках наблюдения относительно животных как интактной, так и контрольной групп Ф<0,05).
§ 40
15 мин 30 мин 60 мин 120 1 сутки
мин
время после альтерации
П интактные
□ контроль
□ плавание
□ яд
П адреналин
Рис. 3. Динамика изменения концентрации окисленного глутатиона в эритроцитах
крыс при различных стрессирующих воздействиях («*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05; «#» -статистическая значимость различий с животными, получавшими физиологический раствор р<0,05)
Изучение содержания в эритроцитах окисленного глутатиона показало, что его концентрация несущественно отклоняется от уровня таковой у крыс интактной и контрольной групп во всех точках наблюдения ф>0,05) (рис. 3).
Обсуждение результатов Проведенные исследования позволяют заключить, что концентрация общего, восстановленного и окисленного глутатиона однотипно возрастала при всех видах альтерационного воздействия (физическая нагрузка, введение пчелиного яда и адреналина), причем тяжесть альтерации детерминировала степень элевации уровня данного соединения. Поэтому, с учетом данных изучения содержания в эритроцитах общего глутатиона и его фракций, все примененные виды альтерации способствуют нарастанию оксидантного потенциала клеток, что согласуется с данными литературы [4] и нашими предшествующими результатами [3], а также верифицирует наличие оксидативного стресса как компонента общего адаптационного синдрома при воспроизведенных вариантах воздействия.
При рассмотрении феномена структурной дезорганизации и функциональных нарушений плазматических мембран как универсальной реакции клеточных систем при патологических процессах разного генеза закономерен интерес к развитию синдрома генерализованной молекулярной модификации плазматических мембран различных клеточных систем, являющихся как мишенью непосредственного действия патогенных факторов, так и вовлеченных в каскад патологических изменений в условиях развития болезни [4].
Интерпретация феномена дезорганизации молекулярной структуры как мембраны эритроцитов, так и плазматических мембран других клеточных систем при патологических процессах разного генеза заставляет затронуть некоторые общепатологические проблемы, традиционно возникающие при изучении повреждений клеток. Речь в данном случае идет об общих закономерностях реагирования клеток на различные патогенные воздействия, а также о развитии типовых патологических процессов, реализуемых по единому алгоритму практически независимо от первичного инициирующего агента. Предполагается, что воздействие на клетки тканей и органов разных повреждающих факторов (токсические соединения, свободные радикалы, продукты липопероксидации, гипергликемия и т.д.) вызывает запуск универсального ответа вследствие действия сходных молекулярных механизмов повреждения при различных причинах, его вызвавших [3, 7]. К их числу относятся, прежде всего, интенсификация ПОЛ, окислительная модификация белковых молекул, активация эндогенных фосфолипаз и протеаз, снижение активности системы антиоксидантной защиты клетки. Инициация этих механизмов сопровождается неспецифическими изменениями структуры и функции клеточных мембран [7].
Наиболее тяжелые последствия для клетки вызывает повреждение липидного бислоя мембраны вследствие активации процессов ПОЛ, действия мембранных фосфолипаз, механического (осмотического) растяжения мембраны, адсорбции на липидном слое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды. При этом ПОЛ отводится роль механизма, обеспечивающего доступность липидных и белковых компонентов для действия фосфолипаз и протеаз. Активация ПОЛ затрагивает важнейшие физико-химические свойства мембран (проницаемость, вязкость, фазовое состояние) [4]. Усиление ПОЛ клеточных мембран приводит к уплотнению либо деструкции липидного бислоя, повышению его микровязкости, сокращению площади белок-липидных контактов, нарушению функциональной активности ферментов, изменению мембранной проницаемости и поверхностного заряда, нарушению функционального состояния мембрано-рецепторного комплекса. Процесс ПОЛ играет роль механизма, обеспечивающего доступность липидно-белковых компонентов мембран клеток для фосфолипаз и протеаз соответственно. Возникает «порочный круг»: патогенный фактор (например, недостаток О2) нарушает энергетический обмен и стимулирует свободнорадикальные процессы в клетке, а активация свободнорадикального окисления приводит к повреждению мембран и усугубляет дефицит энергии,
таким образом, отмечается уменьшение уровня макроэргов, накопление в клетках
2+
ионов Са , так как снижение уровня АТФ приводит к выключению ионных насосов и поступлению ионов кальция из межклеточной среды, а также активация
мембраносвязанных фосфолипаз, гидролиз части ФЛ, увеличение проницаемости мембран [7].
Таким образом, очевидно, что развитие различных по механизму альтерирующих процессов и состояний сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток, являющихся как непосредственной мишенью повреждающего действия патогенных факторов, так и вовлеченных в патологический процесс в связи с инициацией универсальных механизмов повреждения клетки (дефицит энергопродукции, интенсификация процессов свободнорадикального окисления, активация фосфолипаз, протеаз, нарушение ионного гомеостаза и др.). Сложность установления причинно-следственных связей между различными параметрами, характеризующими состояние мембран и метаболизм клеток, а также оценки удельного веса отдельных молекулярных механизмов в реализации мембранодеструктивных процессов обусловлены тесной взаимосвязью данных факторов между собой. Однако получение обобщающих положений о базисных механизмах и общих закономерностях реагирования разнообразных клеточных систем при патологии разного генеза не только сулит успех для понимания общебиологических законов развития патологических процессов, но и позволяет по-новому взглянуть на методологию их коррекции [4].
Список литературы
1. Иванов В.В., Шахристова Е.В., Степовая E.A. с соавт. Перекисное окисление липидов с система глутатиона в жировой ткани крыс с аллоксановым диабетом // Бюллетень СО РAMН. 2010. Т. 30, №6. С. 101-104.
2. Кузник Б.И. Физиология и патология системы крови. М.: Вузовская книга, 2004. 296 с.
3. Мартусевич A.K., Соловьева A.r., Мартусевич A.A., Перетягин П.В. Особенности функционально-метаболической адаптации организма в условиях травматического стресса // Медицинский альманах. 2012. №5. С. 175-178.
4. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В. Структурная дезорганизация мембраны эритроцитов как универсальная типовая реакция целостного организма при болезнях дизрегуляции // «Дизрегуляционная патология» / Под ред. Г.Н. ^Б^атов^ого. М.: Медицина, 2002. С. 395-405.
5. Little C., O'Brien P.J. An intracellular GSH-peroxidase with a lipid peroxide substrate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. Vol. 31. N 2. P. 145-150.
6. Sedlak J., Lindsey R.H. // Anal. Biochem. 1968 №2. P. 192-205.
7. Sushil J.K. Evidence for membrane lipid peroxidation during the in vivo aging of human erythrocytes // Biochim. Biophys. Acta: Biomembranes. 1988. V. 937. № 2. P. 205-210.
