CC BY
33
УДК: 619:576.8+616.091:611.018
ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИИА БАЦИЛЛ НА НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ КРОВИ САМЦОВ КРЫС ПРИ СТРЕССИРОВАНИИ ПЛАВАНИЕМ
© 2010 Л.В. Карпунина1, Т.П. Кикалова1, М.Д. Сметанина2
'Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова, г. Саратов 2 Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, г. Саратов
Поступила 21.04.2009
Показано, что бактериальный лектин Л11 РавтЬасШш ро1утуха 1460 влияет на активность глутати-он-8-трансферазы, аспартат- и аланинаминотрансферазы, а также на содержание мочевины, холестерина, церулоплазмина и глюкозы в крови самцов крыс, нормализуя некоторые из этих биохимических параметров при стрессирование плаванием.
Ключевые слова: бактериальные лектины, бациллы, биохимические параметры крови, животные, стресс.
Бактериальные лектины, представляющие собой соединения белковой природы и проявляющие специфическую и обратимую углево-дсвязывающую активность, все шире находят применение в различных медико-биологических исследованиях. Научный и практический интерес к ним обусловлен тем, что многие из них обладают противомикроб-ной, противовирусной и иммуномодулирующей активностью [1, 2].
Одной из серьезных проблем в настоящее время является изучение воздействия на живые организмы различных стрессоров, таких как эмоциональное напряжение, социальные потрясения, болевые раздражения, перегревание, воздействие холода и т.д. Физиологические изменения, которые происходят в организме при стрессах, изучены недостаточно. Однако установлено, что одним из наиболее эффективных способов повышения резистентности организма к различным видам стрессов является применение биологически активных веществ [3], к которым относят и бактериальные лектины.
Работ по влиянию лектинов непатогенных бактерий на метаболизм животного организма не так много [4, 5], и потому исследования воздействия лектинов бактериального происхождения на биохимические параметры животных, как в норме, так и при некоторых нарушениях, являются актуальной задачей.
Исходя из всего сказанного, представляет значительный интерес изучение влияния лек-тинов бактерий и, в частности, лектина Л11 Р.
Карпунина Лидия Владимировна, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии; Кикалова Татьяна Петровна, аспирант той же кафедры, e-mail: t_kikalova@bk.ru. Сметанина Мария Даниловна, кандидат биологических нак, доцент кафедры физиология человека и животных e-mail: pha@rambler.ru.
polymyxa 1460 на некоторые биохимические параметры крови животных в условиях стрес-сирования плаванием.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на здоровых самцах белых беспородных крыс со средней массой 210 г. Во всех опытных группах использовали лектин ËII, выделенный с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий рода Paenibacillus polymyxa 1460 по методу [6]. Препарат лектина вводили в концентрации 4 мкг в 0,5 мл 0,9% NaCl на животное интраперитоне-ально за час до стрессирования. В качестве стрессирующей процедуры применяли тест принудительного неизбегаемого плавания («forced swimming») в воде при температуре 25°С, регистрируя время плавания животных. По характеру воздействия экспериментальные животные были разделены на 4 группы: 1 группа - интактные животные; 2 группа получала инъекцию раствора лектина ËII; 3 группу - подвергали стрессированию плаванием; 4 группу - после инъекции лектина ËII подвергали стрессированию плаванием.
Активность глутатион^-трансферазы (GST) определяли в эритроцитах крови животных [7]. Для определения активности аспартат- (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови применяли набор реагентов для определения активности АСТ и АЛТ «Lachema» (Чешская республика) [8]. Определение содержания мочевины и холестерина в сыворотке крови осуществляли с помощью набора реактивов фирмы "Агат" (г. Москва) и «Диахим» (г. Дзержинск). Концентрацию церулоплазмина (ЦП) и глюкозы в сыворотке крови определяли по методу H.A. Ravin [9] и с использованием набора реагентов «Глюкоза-ФКД» (г. Москва) соответственно.
Результаты экспериментов подвергали статистической обработке по общепринятым методам с использованием t-критерия Стъюдента [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований было обнаружено, что время плавания животных с предварительно, введенным лектином бацилл оказалось в 2 раза больше, чем контрольных и составило 83 мин. Мы предположили, что это может быть связано с активацией каких-либо процессов метаболизма в организме опытных животных после инъекции биологически активного препарата - лектина ЛИ. Поэтому следующим этапом нашего исследования явилось определение активности некоторых ферментов (GST, АЛТ, ACT), а также содержания ЦП, холестерина, мочевины и глюкозы в сыворотке и в крови экспериментальных животных.
Мультифункциональные белки глутатион-S-трансфераз являются универсальным дезинток-сикационным ферментом и осуществляют метаболическую защиту организма, как от экзогенных, так и от эндогенных токсических метаболитов [11]. Было показано, что введение экс-
периментальным животным бактериального лектина Л11 само по себе снижало активность GST на 25%, при этом стрессирование плаванием также достоверно снижало активность фермента GST в эритроцитах крови крыс на 58% - до 9,19 мкмоль/мин-л относительно ин-тактных животных, активность фермента которых составила 19,90 мкмоль/мин-л. При предварительном введении бактериального лектина ЛII ферментативная активность GST эритроцитов крови крыс повышалась относительно группы плавания на 48% (до 18,79 мкмоль/мин-л) и приближалась к норме, то есть к значениям активности фермента животных интактной группы (19,90 мкмоль/мин-л) (табл. 1).
Таким образом, приведенные экспериментальные данные, позволяют говорить о том, что лектин бацилл Л11, вводимый в организм крыс перед действием стрессового фактора, оказывает нормализующее воздействие на активность GST в организме крыс.
Таблица 1. Влияние лектина Л11 на время плавания и активность ферментов и содержание церулоплазмина в норме и при стрессе
Характер воздействия GST, мкмоль/ мин-л АЛТ, мкмоль/ мин-л АСТ, мкмоль/ мин-л Коэф-т Де Ритиса ЦП, мг/л
(М ± m)
Интактные животные 19,90±0,63 1,73±0,02 1,99±0,02 1,15±0,01 595,90±5,02
Лектин ЛИ 15,12±0,42* 0,82±0,02* 2,12±0,09* 2,58±0,11* 469,80 ± 5,87*
Плавание 9,19±1,70* ° 2,39±0,13* 3,34±0,03* 1,38±0,01* 739,87±1,28*
Лектин ЛИ + плавание 18,79±0,41д 1,57±0,09 д ° 1,23±0,06* д ° 0,78±0,04* д ° 727,71±5,23* °
Примечание. * — р < 0,05 относительно значений животных интактной группы; л — р < 0,05 относительно значений группы животных после стрессирования плаванием; ° — р < 0,05 относительно значений животных с инъекцией лектина Л11.
В ходе дальнейших экспериментов было показано, что введение крысам лектина Л11 без воздействия стрессора, понижало активность АЛТ на 50%, в то время как воздействие стрессового фактора в виде принудительного плавания повышало активность этого фермента в сыворотке крови крыс на 40%, которая составила 2,39 мкмоль/мин-л относительно 1,73 мкмоль/мин-л у интактных животных, как это было показано в табл. 1. Уровень активности ACT достоверно не изменялся относительно контрольных значений. При стрессировании животных плаванием активность ACT повышалась относительно исходных значений на 70% и составляла 3,34 мкмоль/мин-л против 1,99 мкмоль/мин-л у группы интактных животных. Коэффициент Де Ритиса в группе животных с инъекцией лектина ЛII и в группе плавания повышался относительно контрольных значений, что говорит об увеличении синтеза ACT митохондриями. Из литературных данных
известно, что при различных стрессорных и патологических состояниях в организме животных изменяется способность клеток вырабатывать аминотрансферазы [12].
При предварительном введении крысам лек-тина ЛИ было отмечено снижение активности ACT более чем в 2 раза относительно животных, стрессированых плаванием. Tакже происходило снижение уровня активности ACT на 40% относительно интактных животных. При этом активность AЛT достоверно снижалась относительно животных группы плавания. Значение коэффициента Де Ритиса в группе животных, подвергнутых стрессу при предварительном введении лектина ЛИ, понижалось относительно всех экспериментальных групп. Можно предположить, что это явилось следствием затрудненного выхода AЛT и ACT из клеток в кровяное русло. Причиной этого может быть стабилизация структуры мембран клеток под влиянием бактериального лектина
Л11, либо ингибирование синтеза этих ферментов лектином Л11.
Далее нами было рассмотрено влияние лек-тина Л11 и стресса в виде принудительного плавания на содержание церулоплазмина. Показано, что у интактных животных содержание ЦП в сыворотке крови составило 595,9 мг/л (табл. 1). Введение биологически активного вещества лектина ЛII понижало активность данного фермента. Стрессирование плаванием вызывало увеличение содержания ЦП в сыворотке крови крыс на 24% и составило 739,87 мг/л против 595,90 мг/л в контроле. Предварительное введение лектина ЛII не повлияло на содержание ЦП.
Известно, что основная физиологическая роль церулоплазмина определяется его участием в окислительно-восстановительных реакциях, а именно в острофазовом ответе, инактиви-руя свободные радикалы - высокореактивные химические агенты с неспаренными электронами, образующиеся из кислорода и способные вызывать повреждение ткани. Концентрация ЦП в крови повышается при острых воспалительных процессах, инфаркте миокарда, ишемии и других заболеваниях, связанных с повреждением тканей [13]. Поэтому повышение его уровня в крови в данном случае рассматривается нами как компенсаторная реакция организма, направленная на ферментативное окисление биогенных аминов и других медиаторов.
При изучении азотистого и липидного об-
менов, было обнаружено, что содержание мочевины в сыворотке крови животных достоверно увеличивалось при стрессировании плаванием в 2,5 и составило 8,74 ммоль/л против 3,76 ммоль/л в контроле (табл. 2). Полученные нами данные подтверждаются литературными источниками, согласно которым уровнь мочевины повышается после физических нагрузок
[14].
Введение в организм крыс лектина ЛИ не влияло на уровень мочевины и холестерина в сыворотке крови экспериметальных животных. Однако уровень холестерина в сыворотке крови животных, подвергшихся стрессированию, повышался до 6,54 ммоль/л против 1,03 ммоль/л в контроле, что оказалось в 6,5 раз выше нормы (значений интактных животных). Повышение концентрации холестерина в сыворотке крови крыс может быть следствием увеличения активности синтеза общего холестерина печенью и повышенного расходования его на уплотнение клеточных мембран, проницаемость которых нарушается под действием продуктов перекисного окисления липидов во время стресса.
Предварительное введение бактериального лектина вызывало снижение уровня мочевины у животных после плавания контрольной группы животных, в то время как содержание холестерина в сыворотке крови крыс оставалось повышенным.
Таблица 2. Влияние лектина Л11 на концентрацию мочевины, холестерина и глюкозы в сыворотке крови крыс в норме и при стрессе
Характер Мочевина, ммоль/л Холестерин, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л
воздействия (М ± т)
Интактные животные 3,76±0,19 1,03±0,13 7,18±0,65
Лектин ЛИ 3,46 ± 0,31 1,42 ± 0,12 9,64±1,04
Плавание 8,74±0,21* 6,54±0,37* 18,22±1,55*
Лектин ЛИ + плавание 7,65±0,30* д е 6,35±0,31* е 18,24±2,15* е
Примечание. Обозначения см. в табл. 1.
При исследовании концентрации глюкозы в сыворотке крови опытной группы животных с введенным препаратом лектина ЛИ показано, что количество данного углевода достоверно не отличалось от значений интактной группы животных. Результаты наших исследований согласуются с литературными данными [15]. Содержание глюкозы у животных группы плавания оказалось в 2,5 раза больше, чем в группе интактных животных (табл. 2). При этом содержание глюкозы в группе плавания с предварительным введением лектина ЛИ не отличалось от показателей группы плавания.
Таким образом, представленные исследования свидетельствуют о том, что лектин бацилл ЛИ Р. ро1утуха 1460 оказывает влияние на ме-
таболизм животного организма, регулируя активность АСТ и АЛТ, содержание холестерина и церулоплазмина в условиях стрессовых воздействий, приводя показатели активности некоторых важных биохимических показателей к норме. Тем самым лектин бацилл ЛИ мобилизует метаболизм, способствуя быстрой адаптации организма к различным неблагоприятным воздействиям. Возможно, такая регулирующая физиологическая функция бактериального лек-тина бацилл объясняется его протекторным действием на мембраны клеток. Важно отметить, что лектин ЛИ Р. ро1утуха 1460 обладает сходным действием на различные биохимические параметры крови животных в условиях различных видов стресса (холодовой, этаноло-
вый стрессы, иммобилизация, принудительное плавание), что говорит о его широком спектре действия [16, 17].
Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание природы и свойств биологическиактивных соединений - лектинов, расширяют наши представления о влиянии лектинов бактериального происхождения на метаболизм животного организма и их регуля-торную роль.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Карпунина Л.В. и др. Изучение бактерицидных и фунгицидных свойств белков агглютининов (лектинов) почвенных азотфиксирующих бактерий // Биотехнология. 1997. Т. 3. С. 10-13.
2. Пономарева Е.Г. и др. Иммуномодулирующие свойства лектина Azospirillum brasilense Sp7 // М1жнародна Наукова конференщя Odesa, 2006. С. 148.
3. Франц X. Лектины: свойства, функции и возможности применения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1996. № 3. С. 3-6.
4. Кикалова Т.П. и др Определение активности глутати-
он^-трансферазы эритроцитов крови самцов крыс в условиях кратковременного и продолжительного холодового стресса на фоне введения лектинов бацилл // Современные наукоемкие технологии. 2008. № 1. С. 93.
5. Неверова H.H. и др. Влияние лектина Paenibacillus polymyxa на активность глутатион^-трансферазы в крови крыс при стрессе // Вестник Оренбургского гос. ун-та. 2008. № 80. С. 117-120.
6. Карпунина Л.В. Роль агглютинирующих белков азотфиксирующих бацилл и ризобий в жизнедеятельности бактерий и при взаимодействии с растениями: Дис...док. биол. наук. Саратов, 2002. 315 с.
7. Habig W.H., Jacoby W.B Assays for differentiation of glutathione-S-transferases // Methods in Enzymol. 1981. V. 77. P. 398-402.
8. Reitman, S., Frankel S. A calorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glu-
tamic pyruvic transaminases // Amer.J.Clin.Pathol. 1957. V. 28. P. 56.
9. Ravin H.A. An improved colorimetric enzymatic assay of ceruloplazmin // J. Lab. Clin. Med. 1961. V. 7, N 2. Р. 161-168.
10. Зайцев Т.Н. Математический анализ биологических данных. М.: Наука, 1991. 268 с.
11. Limdi, J.K., Hyde G.M. Evaluation of abnormal liver function tests // Postgrad. Med. J. 2003. V. 79. P. 307-312.
12. Jung K., Pergande M., Rej R. Mitochondrial Enzymes in Human Serum: Comparative Determinations of Glutamate Dehydrogenase and Mitochondrial Aspar-tate Aminotransferase in Healthy Persons and Patients with Chronic Liver Diseases // Clin. Chem. 1985. V. 31. P. 239-243.
13. Емельянов Д.Н. и др. Влияние внутреннего лазерного облучения крови на общую активность церуло-плазина у больных хроническими дисфузными заболеваниями печени // Гепатология. 2004. № 3. C. 37-39.
14. Ленкова Р.И. Изменение содержания мочевины в крови и тканях при мышечной деятельности в зависимости от адаптированности организма // Физиологический журнал CCCP им. Cеченева. 1973. T. 59, №7. C. 1097-1107.
15. Гаврилова, М.Г., Сметанина М.Д., Карпунина Л.В. Инсулиноподобный эффект лектина Bacillus polymyxa у самок крыс с экспериментальным гипотиреозом // Материалы II конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» ^мск, 2001. C. 48-49.
16. Неверова Н.Н. и др. Влияние лектина на активность глутатион^-трансферазы эритроцитов крови самцов крыс в условиях этанолового стресса / / ^временные наукоемкие технологии. 2007. № 5. C. 73.
17. Неверова Н.Н. и др. Изменение активности глутати-он^-трансферазы и церулоплазмина в крови крыс при стрессе на фоне введения лектина Paenibacillus polymyxa// Огратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Tез. третьей межрегиональной конференции молодых ученых, Cаратов, 10-12 октября, 2006. C. 33.
INFLUENCE OF BACILLUS LECTIN ON SOME BIOCHEMICAL PARAMETERS OF BLOOD OF MALE RATS IN CONDITIONS OF SWIMMING STRESS
© 2010 L.V. Karpunina1, T.P. Kikalova1, M.D. Smetanina2
1 Saratov state agrarian university name of N.I. Vavilov
2 Saratov state university name of N.G. Chernishevsky
The bacterial lectin LII Paenibacillus polymyxa 1460 is shown to affect activity of glutathione-S-transferase, aspartate aminotransferase and alanin aminotransferase, as well as the content of urea, choles-terine and concentrations of ceruloplasmin and glucose in the blood of male rats, normalizing some of these biochemical parameters in combination with swimming stress. Key words: bacterial lectin, bacillus, blood biochemical parameters, animals, stress.
Karpunina Lidiya Vladimirovna, Doctor of Biology, professor of chair of microbiology, virusology, immunology; Kikalova Tat'yana Petrovna, post-graduate student of the chair, t_kikalova@bk.ru. Smetanina Mariya Danilovna, candidate of Biology, reader of chair of human and animal physiology pha@rambler.ru.
