CC BY
1УДК 661.178.1 : 577.3
Экспериментальное изучение методов оценки поведенческих реакций животных на воздействие малых доз фосфорорганических отравляющих веществ
Доктор медицинских наук, профессор В. Р. Рембовский, кандидат медицинских наук В. И. Попович, кандидат медицинских наук В. П. Кривокорытов, доктор биологических наук П. А. Скибарко
Разрабатываемые технологии уничтожения химического оружия предполагают полную безопасность производственных циклов деструкции отравляющих веществ для персонала объектов уничтожения (хранения) химического оружия. Вместе с тем данное положение не исключает в ряде ситуаций возможности появления в атмосфере производственных помещений малых количеств как самих отравляющих веществ, так и продуктов их деструкции. В этой связи экспериментальная оценка физиологической активности малых доз отравляющих веществ приобретает актуальное значение.
Для оценки физиологического воздействия внешних факторов малой интенсивности используются интегральные и специфические методы исследования функционального состояния организма [1—3]. Интегральные методы направлены прежде всего на оценку главной «функции» организма — его работоспособности в различных негативных условиях, в частности, при воздействии химических веществ в малых дозах (на уровне пороговых и ниже) [4, 5]. Немаловажным положительным качеством этих методов является их возможность улавливать неспецифические изменения в умственной и физической работоспособности целостного организма под влиянием различных факторов. Известно, что некоторые элементы трудовой деятельности человека и поведения животных имеют одну биологическую базу. В качестве таковой можно назвать ориентировку в ситуации, восприятие и запе-чатление (память) информации, различные виды условно-рефлекторной деятельности, элементарные рассудочные акты [6—8].
В настоящей работе представлены исследования поведенческих реакций животных (собак) на воздействие фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ) с применением комплекса интегральных методов оценки состояния организ-98
ма: теста на краткосрочную память, теста на условно-рефлекторную побежку в большом лабиринте и метод определения индекса PWC2oo [1—3, 6, 9]. Первые два теста условно отражают «умственную» работоспособность животных, третий тест характеризует физическую работоспособность.
Для справки укажем, что сущность последнего теста состоит в определении мощности работы, выполняемой собакой при беге на третбане, при частоте сердечных сокращений 200 ударов в 1 мин, по изменению параметров сердечного ритма под воздействием двух нагрузок разной мощности с промежуточным отдыхом. Методика моделирует и оценивает физическую работоспособность (аналогичный тест PWC170 применяется в медицинской практике и при исследованиях в физиологии труда).
В качестве критериальных величин, характеризующих состояние работоспособности, использовались количество правильных реакций (выборов) в тесте на краткосрочную память, время (скорость) побежки в лабиринте и расчетная величина PWC2oo. Эксперименты проводились на собаках в условиях острого (однократного), повторного и подострого воздействия зарина, зомана и вещества VX в малых дозах. Тяжесть поражения животных оценивали на основании клинической картины интоксикации и степени угнетения активности ацетилхолинэстеразы цельной крови.
Общая схема и объем экспериментальных исследований по оценке состояния работоспособности собак при воздействии малых доз ФОВ представлены в табл. 1.
Для получения более полного представления о работоспособности при влиянии токсического фактора и оценки пригодности интегральных методов для соответствующих исследований были проведены испытания (на собаках) в условиях острого воздействия зарина — типичного для ингаляци-
Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева), 2002, т. ХУ!, № 6
онного поражения в реальных условиях представителя ФОВ — в широком интервале доз, от подпороговых до эффективных. В случае внутривенного введения зарина в наименьшей из исследуемых доз (2^10-3 мг/кг) изменения как состояния организма, так и уровня физической и «умственной» работоспособности собак не наблюдались. Показатели влияния зарина в более высоких дозах на работоспособность животных
приведены в табл. 2.
Клинические проявления интоксикации при воздействии зарина в дозах 4-10-3 и 8-10-3 мг/кг соответствовали преимущественно развитию пороговых эффектов, характеризующихся незначительной саливацией, легкой вялостью и небольшим снижением двигательной активности примерно у 70% животных.
Таблица 1
Схема экспериментального исследования работоспособности собак при воздействии малых доз
фосфорорганических отравляющих веществ
ФОВ Путь воздействия Действующая доза, Вид Количество Методы исследования и
вещества мг/кг воздействия биообъектов 1 регистрируемые показатели
Зарин Внутривенно 2-10-3—12-10-3 Острое 24 Измерение активности ацетил-
холинэстеразы цельной крови;
тест на краткосрочную
Зоман Внутримышечно 32-10-6—27-10-5 Повторное 21 память, количество правиль-
в течение 5 сут. ных выборов; метод лабирин-
Зоман То же 32-10-6 Подострое 8 та, время побежки; тест
в течение 68 сут. PWC200
УХ Накожно 36-10-6—43-10-5 Острое, повторное 10
в течение 4 сут.
Таблица 2
Показатели «умственной» и физической работоспособности собак при однократном воздействии зарина
Доза зарина, мг/кг
Динамика значений измеряемого параметра (х± ЭХ) по срокам наблюдения
Время побежки в лабиринте, с
норма 30 мин 1 ч 2 ч 3 ч 5 ч 1 сут. 2 сут.
4-10-3 83 ± 5 80 ± 6 94 ± 5 111 ± 8* 114±11* 96 ± 6 83 ± 4 86 ± 4
8-10-3 67 ± 1 78 ± 4 82 ± 3* 85 ± 4* 89 ± 5* 101 ± 12* 71 ± 3 68 ± 3
12-10-3 77 ± 4 90 ± 4 87 ± 6 97 ± 10* 110±15* 103±10* 85 ± 4 79 ± 2
Количество правильных выборов в тесте на краткосрочную память
норма 30 мин 1 ч 2 ч 3 ч 5 ч 1 сут. 2 сут.
4-10-3 4,0 ± 0,6 4,0 ± 0,5 4,2 ± 0,5 4,4 ± 0,6 3,8 ± 0,5 4,6 ± 0,4 4,4 ± 0,6 5,5 ± 0,5
8-10-3 4,8 ± 0,5 3,7 ± 0,5* 4,5 ± 0,5 4,0 ± 0,8 3,3 ± 0,2* 4,0 ± 0,8 3,3 ± 0,8* 4,2 ± 0,5
12-10-3 4,4 ± 0,2 3,4 ± 0,5* 4,4 ± 0,5 3,8 ± 0,6 3,6 ± 0,7* 4,2 ± 0,4 4,0 ± 0,6 3,6 ± 0,8
Индекс PWC2oo 1, кГ^м/(мин^кг)
норма 30 мин- -1 ч 2—3 ч 5 ч 1 сут. 2 сут.
4-10-3 27 ± 5 25 ± 4 26 ± 5 22 ± 4 26 ± 4 24 ± 1
8-10-3 26 ± 5 25 ± 6 30 ± 8 29 ± 3 25 ± 3 28 ± 3
12-10-3 29 ± 4 24 ± 3 24 ± 2 23 ± 5 24 ± 4 27 ± 4
' Достоверное отличие от показателей нормы при Р< 0,05.
Максимальная степень угнетения активности ацетилхоли-нэстеразы цельной крови для животных, подвергавшихся воздействию зарина в дозе 4Ч0-3 мг/кг, была на уровне 16%, а при дозе зарина 8,0Ч0-3 мг/кг среднее угнетение активности фермента на пике интоксикации составило 33 ± 5%. Восстановление нарушенных функций происходило в течение от 3 до 6 часов с момента воздействия отравляющего вещества. Доза зарина 12,0Ч0-3 мг/кг у половины животных вызывала более выраженную картину интоксикации, которую можно охарактеризовать как поражение легкой степени, что подтверждается средней степенью угнетения активности аце-тилхолинэстеразы на пике интоксикации, равной 57,0 ± 3%.
Результаты оценки «умственной» работоспособности животных после воздействия зарина по методу побежки в лабиринте свидетельствуют о достоверном снижении ее уровня независимо от вводимой дозы вещества. Данные нарушения развиваются уже через 1 ч после воздействия ФОВ и сохраняются на протяжении пятичасового обследования животных, нормализация работоспособности происходит в течение 1 — 2 сут.
Аналогичные изменения состояния «умственной» работоспособности после внутривенного введения зарина наблюдаются и в тесте на краткосрочную память. При этом отмечаются более выраженные нарушения в ранние сроки интоксикации и в ряде случаев просматривается дозозависимый характер изменений уровня работоспособности, что особенно заметно при анализе динамики ее восстановления.
Экспериментальные данные, полученные по методу PWC2oo, свидетельствуют о том, что физическау работоспособность не претерпевает существенных нарушений во всем интервале испытанных доз зарина, прослеживается лишь небольшая тенденция к снижению ее уровня в период наблюдения до 1 сут. с полной нормализацией состояния на вторые сутки обследования животных. Данный факт можно объяснить незначительным стимулирующим влиянием ФОВ в
подпороговых и пороговых дозах на физическую работоспособность.
Особенности клинических проявлений повторного воздействия ФОВ на работоспособность собак исследовались при ежедневном внутримышечном введении малых доз зомана в течение пяти суток. Суммарные дозы в каждой серии эксперимента составили 2,24Ч0-4, 5.12Ч0-4 и 1,3540 -3 мг/кг. В табл. 3 представлены обобщенные результаты исследований, обработанные с учетом наступления эффекта от воздействия вещества, соответствующего минимальному показателю потери работоспособности, а именно 20% для тестов на краткосрочную память и побежку по лабиринту и 30% при измерении показателя PWC2oo. Как видно из приведенных данных, уровень «умственной» работоспособности собак по тесту на краткосрочную память при ежедневном введении зомана в подпороговой дозе, равной 0,1Р050, значительно снижался по мере нарастания получаемой дозы.
При оценке по методу побежки в лабиринте фиксировался более высокий уровень состояния работоспособности, что, вероятно, связано с механизмом образования прочных нервных связей, лежащих в основе формирования данного вида условно-рефлекторной деятельности. Признаки нарушения работоспособности обнаруживаются только при достаточно высокой суммарной дозе зомана, достигаемой при повторных его введениях.
Существенных нарушений физической работоспособности, оцениваемой по тесту PWC2oo, не наблюдалось, что соответствует характеру токсического действия ФОВ на уровне испытанных доз.
В связи с различной чувствительностью интегральных методик оценки состояния организма, а также из-за неопределенности заключения об их диагностической значимости в случае нарастания подпороговых доз зомана, были проведены исследования в режиме подострого токсического воздействия. Зоман вводили собакам внутримышечно ежедневно в
Таблица 3
Показатели работоспособности собак при повторном воздействии малых доз зомана
Суммарная Тест на краткосрочную Тест на побежку Тест PWC2oo
доза зомана, память в лабиринте
мг/кг общее число с эффектом, общее число с эффектом, общее число с эффектом,
животных % животных % животных %
2.24-10-4 8 37 8 0 5 0
5.12-10-4 5 40 5 0 5 0
1.35-10-3 5 60 5 40 5 20
Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. ИИ. Менделеева), 2002, т. ХУ!, № 6
Таблица 4
Показатели работоспособности собак при подостром воздействии зомана Измеряемый па- Динамика значений параметра (л±£х) по срокам наблюдения (сут.)
раметр
норма 7 12 21 27 35 41 49 68
Время побежки в 72,0 ± 2,5 72,0 ± 2,8 67,0 ± 2,6 69,0 ± 2,9 64,0 ± 4,3 63,0±4,2 68,0±3,3 64,0* ±2,1 65,0 ± 2,9 лабиринте, с
Количество пра- 5,0 ± 0,4 4,0 ± 0,4* 4,0 ± 0,4* 5,0 ± 0,3 4,0 ± 0,8 5,0±0,3 4,0*±0,3 4,0 ± 0,5 5,0 ± 0,3 вильных выборов в тесте на краткосрочную память
Индекс PWC200, 29,0 ± 3,6 — 33,0 ± 3,5 — 28,0 ± 3,0 — 29,0 ±4,9 — 29,0 ± 2,8
кГ^м/(мин^кг)
* Достоверное отличие от показателей нормы при Р< 0,05.
дозе, равной 0,^050, в течение 68 сут. Через 7 сут. и последующие определенные интервалы времени измеряли показатели работоспособности животных (табл. 4), а также измеряли активность ацетилхолинэстеразы цельной крови.
Как видно из данных табл. 4, при подостром воздействии малых доз зомана у отдельных животных фиксируются незначительные изменения индекса PWC2oo, которые не выходят за пределы колебания нормы и существенно не отражаются на среднегрупповых величинах за весь период наблюдения. Зарегистрирован лишь один случай снижения PWC2oo на 34% (на сороковые сутки наблюдения), который может быть расценен как случайное событие, не меняющее общей картины сохранения физической работоспособности в течение всего периода обследования.
Оценка состояния «умственной» работоспособности по методу условно-рефлекторной побежки в лабиринте показала, что у всех животных, за исключением одного, во все сроки наблюдения отмечается стабилизация или увеличение скорости его преодоления. Данный эффект объясняется отчасти процессами закрепления нервных связей в коре головного мозга животных на фоне непрерывного условно-рефлекторного обучения. Немаловажное значение оказывает и стимулирующее влияние малых доз зомана на осуществление синаптической передачи в центральную нервную систему.
Оценка уровня «умственной» работоспособности по тесту на краткосрочную память в условиях подострого воздействия зомана показывает, что среднее значение измеряемого показателя снижается на 20% по отношению к норме в период наблюдения, за исключением 21, 35 и 68 сут. Снижение этого показателя на 20% является критериальной величиной частичной потери работоспособности. Следовательно, эф-
фект исследуемых доз зомана на «умственную» работоспособность, оцениваемый по тесту на краткосрочную память, можно рассматривать как границу значимого воздействия. Наиболее существенно данный эффект проявляется на 12 и 41 сут. от начала токсического воздействия, когда у 75% биообъектов отмечалось достоверное увеличение ошибок при выполнении этого теста.
Механизм наблюдаемых явлений гипотетически может быть представлен как закономерный процесс, который заключается в формировании первичной ответной реакции на поступление в организм ксенобиотиков, проявляющейся в достоверном снижении в течение первых двух недель «умственной» работоспособности. Затем развивается адаптация к действию периодически поступающего яда, позволяющая компенсировать на уровне целостного организма его токсические эффекты. Однако через 40 сут. происходит «срыв» адаптации, который выражается в частичной потере «умственной» работоспособности.
Экспериментальное исследование кожно-резорбтивного воздействия вещества УХ в малых дозах на «умственную» работоспособность проведено на собаках в условиях однократного и повторного воздействия отравляющего вещества. В обобщенном виде экспериментальные данные представлены в табл.5.
В виду малой чувствительности теста PWC2oo при исследовании воздействия малых доз зарина и зомана оценку физической работоспособности в данной серии экспериментов не проводили.
Клинический комплекс симптомов интоксикации и общее состояние организма животных соответствовали картине классического поражения ФОВ на уровне пороговых и подпорого-
Таблица 5
Показатели работоспособности собак в условиях однократного и повторного воздействия вещества УХ
Измеряемый параметр (л±£л)
Норма
Доза вещества
0,2 Рй50 однократно
1 Рй50 повторно
Количество правильных выборов 4,4±0,2
в тесте на краткосрочную память
Время побежки в лабирите, с 78,0±4,7
3,6±0,6 (через 5 ч) 3,2±0,6 (через 1 сут.) 86,0±7,6 (через 5 ч) 87,0±3,6 (через 1 сут.)
2,4±1,2 (через 2 сут.) 4,2±0,6 (через 4 сут.) 88,0±3,0 (через 2 сут. 89,0±5,4 (через 4 сут/
вых доз с менее выраженными, чем при внутривенном введении, проявлениями, свойственными накожному нанесению вещества УХ.
Результаты исследований, приведенные в табл. 5, свидетельствуют о существенном снижении уровня «умственной» работоспособности собак после однократного воздействия УХ в дозе 0,2Р050. Повторное нанесение вещества УХ в дозе 1Р050 приводило к полной потере работоспособности у 40% животных со значительным снижением ее уровня по оценке среднегруппового показателя. Однако последующее воздействие УХ на четвертые сутки в той же дозе практически не оказывало влияния на уровень «умственной» работоспособности, что можно объяснить развитием начального периода адаптации организма к повторному токсическому воздействию. Полученные результаты показывают определенную тенденцию к увеличению времени преодоления лабиринта в течение всего периода обследования животных как после однократного, так и после повторного воздействия вещества УХ, причем это время характеризуется примерно одинаковой величиной отклонения от исходного показателя.
Наблюдающиеся изменения уровня работоспособности свидетельствуют о большей устойчивости показателей побежки в лабиринте в сравнении с тестированием на краткосрочную память. Однако интерпретация результатов по среднеарифметическим величинам не в полной мере дает представление о биологической сущности и цене нарушения работоспособности в связи с неоднозначным вкладом в наблюдаемый процесс патологических изменений каждого из пораженных биообъектов.
* * *
Исследование воздействия фосфорорганических отравляющих веществ на уровень работоспособности животных с помощью интегральных методов оценки показало достаточно высокую чувствительность и информативность тестов на краткосрочную память и на условно-рефлекторную побежку в лабиринте во всем интервале испытанных доз — от подпоро-говых до доз, вызывающих развитие легких степеней пора-
жения. Однако оценки диагностической значимости апробированных методов исследования только по среднеарифметическим значениям регистрируемых показателей нельзя признать корректными, так как при данном подходе, по-видимому, «маскируется» истинная биологическая цена воздействия ФОВ на организм биообъектов.
Что касается метода PWC2oo, то вопрос о его применимости для диагностики малых воздействий ФОВ на уровень физической работоспособности в апробированном варианте остается проблематичным. К положительному результату может привести модификация этого теста по пути увеличения предъявляемых физических нагрузок. Пока с достаточной определенностью можно сделать заключение об эффективности применения теста на краткосрочную память для исследования физиологического воздействия фосфор-органических отравляющих веществ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Саноцкий И.В. и др. В кн.: К вопросу о критериях оценки донозологических состояний. Л.: Наука, 1979.
2. Трахтенберг И.М .и др. Методы изучения хронического действия химических и биологических загрязнений. Рига: Зинатне, 1987.
3. Жолус Б.Н. и др. В кн.: К вопросу о критериях оценки донозологических состояний. Л.: Наука, 1979.
4. Литвинов И. Н. и др. Медицинские проблемы охраны окружающей среды. М.: Медицина, 1981.
5. Прокопенко Ю.Н. и др. Состояние и перспективы развития гигиены окружающей среды. М.: Медицина, 1985.
6. Методические рекомендации по использованию поведенческих реакций животных в токсикологических исследованиях для целей гигиенического нормирования. Киев: Здоровье, 1980.
7. Котлец А.И. и др. Гигиена и санитария, 1991, № 7.
8. Авалиани С.Л. и др. В кн.: Проблемы донозологической гигиенической диагностики. Л.: Наука, 1989.
9. Саноцкий И.В. Методы определения токсичности и опасности химических веществ. М.: Медицина, 1970.
